28 28 kết tủa khuyếch tán trên thạch là một phƣơng pháp kém nhạy, do đó kết quả âm tính có thể do những nguyên nhân sau đây: Hàm lƣợng kháng thể trong kháng huyết thanh quá thấp hay không có nên không có phản ứng kết tủa xảy ra. Hàm lƣợng độc tố: do dịch độc tố sử dụng trong thử nghiệm này là dịch lọc vi khuẩn nuôi cấy có thể hàm lƣợng độc tố thấp nên không đủ để phản ứng kết tủa xảy ra. Vì lí do trên nên chúng tôi tiến hành định tính kháng huyết thanh bằng phƣơng pháp kết tủa khuyếch tán trên thạch với kháng nguyên là protein tái tổ hợp MBP- VT2eB. 4.3.2 Với kháng nguyên MBP-VT2eB Tiến hành định tính kháng huyết thanh bằng phƣơng pháp kết tủa khuyếch tán trên thạch với kháng nguyên là protein tái tổ hợp MBP-VT2eB có nồng độ 0,38mg/ml đƣợc kết quả nhƣ sau: Đối với đối chứng dƣơng: kết quả dƣơng tính đến nồng độ protein pha loãng 1/4 (hình 4.1) Đối với mẫu huyết thanh: kết quả âm tính ở tất cả các mẫu (hình 4.2) 1 2 3 4 5 6 KT Vạch kết tủa Hình 4.1 Kết quả dƣơng tính với huyết thanh thỏ KT: Kháng thể Kháng nguyên: protein MBP-VT2eB 0.38mg/ml 1.Kháng nguyên pha loãng 1 2. Kháng nguyên pha loãng ½ 3.Kháng nguyên pha loãng ¼ 4. Kháng nguyên pha loãng 1/8 5. Kháng nguyên pha loãng 1/16 6. Kháng nguyên pha loãng 1/32 1 2 3 4 5 6 KT Hình 4.2 Kết quả âm tính với huyết thanh heo 1. 2 3 4 5 6 KN 29 29 Từ đó kết luận liều tiêm 50 g/heo và 75 g/heo có lập lại và không lập lại đều tạo lƣợng kháng thể không đủ để phát hiện bằng phƣơng pháp kết tuả khuyếch tán trên thạch. 4.3 LIỀU TCID 50 CỦA DỊCH LỌC VI KHUẨN Thực hiện chuẩn độ độc tố VT2e đã lọc qua màng lọc 0,45 m trên môi trƣờng nuôi cấy tế bào vero có kết qủa nhƣ sau:  Hình thái tế bào khi quan sát dƣới kính hiển vi tại thời điểm 24- 48 giờ:  Thời điểm 24 giờ: Ở giếng đối chứng tế bào và giếng DH5α, thảm tế bào phát triển tốt. Ở các giếng nồng độ pha loãng 1/2 thấy có xuất hiện các tế bào chết nhiều hơn so với các giếng có nồng độ pha loãng thấp hơn nhƣng số lƣợng chƣa nhiều, các tế bào chết có hình dạng co tròn và sẫm màu hơn so với thảm tế bào ở dƣới, môi trƣờng có sự đổi màu từ màu hồng sang màu hồng nhạt. Ở các giếng còn lại cũng có tế bào chết nhƣng rất ít chủ yếu là do những tế bào già bị chết và không có sự chênh lệch rõ rệt giữa các độ pha loãng.  Thời điểm 48 giờ: Ở giếng đối chứng tế bào, thảm tế bào vẫn phát triển tốt (Hình 4.3) Các giếng mẫu ở các nồng độ 1/2, 1/20, 1/200 tế bào chết với số lƣợng lớn, chết nhiều nhất ở nồng độ ½ và giảm dần ở các nồng độ loãng hơn. Ở các giếng 1/2000 thì tế bào cũng chết nhiều hơn so với các giếng còn lại nhƣng số lƣợng không đáng kể. Các giếng ở các nồng độ còn lại tế bào chết không rõ rệt và không có sự chênh lệch giữa các nồng độ pha loãng. Do đó có thể kết luận đƣợc hiện tƣợng chết tế bào ở các nồng độ 1/2, 1/20, 1/200, 1/2000 chủ yếu là do độc tố.  Kết quả đo OD 620nm: Bảng 4.2 Kết quả đo OD trên đĩa nuôi cấy tế bào với dịch lọc vi khuẩn Nồng độ 1/2 1/20 1/200 1/2.10 3 1/2.10 4 1/2.10 5 ĐC OD 620nm 0.123 0.156 0.419 0.984 1.052 1.056 1.097 % tế bào sống 11.2 14.2 38.2 89.7 95.9 96.3 30 30 Biểu đồ 4.1 Đồ thị chuẩn độ độc tố Từ kết quả đo OD 620nm, ta thấy liều TCID 50 sẽ nằm ở khoảng nồng độ pha loãng 1/200 và 1/2.10 3 . Điều này hợp lí với kết quả ghi nhận bằng quan sát hình thái tế bào ở các thời điểm 24g và 48g. Ta có thể xác định đƣợc nồng độ pha loãng của độc tố gây chết 50% tế bào theo phƣơng pháp Reed- Muench: Vậy liều TCID 50 của dịch lọc vi khuẩn E. coli O139: K82 nuôi cấy trong môi trƣờng lactose broth trong 24g là ở độ pha loãng 1/340. Sử dụng liều này để tiến hành thực hiện phản ứng trung hòa độc tố. 4.4 HIỆU GIÁ KHÁNG HUYẾT THANH TRÊN MÔI TRƢỜNG NUÔI CẤY TẾ BÀO 4.4.1 Đối với mẫu huyết thanh có sodium azid chƣa bất hoạt Tiến hành thực hiện phản ứng trung hòa độc tố trên môi trƣờng nuôi cấy tế bào vero đối với mẫu huyết thanh của lô 5 có bổ sung sodium azid chƣa bất hoạt. Đây là lô có xác suất tạo kháng thể cao nhất do liều tiêm cao nhất 75μg/ml và có lập lại. Kết quả nhƣ sau: % tế bào sống ở nồng độ 1/2.10 3 - % tế bào sống ở nồng độ 1/200 Liều TCID 50 = log1/200 + 50- % tế bào sống ở nồng độ 1/200 x log 10 50 – 38.2 = 2.3 + x 1 = 2.53 ~ log 1/340 89.7 – 38.2 1/2.10 3 31 31 Thời điểm 24 giờ: Đối chứng dƣơng : tế bào phát triển tốt. Đối chứng âm: có hiện tƣợng tế bào chết với hình thái nhƣ chết do độc tố: tế bào co tròn, chuyển màu sậm hơn so với thảm tế bào bên dƣới nhƣng chƣa rõ ràng. Đối với các mẫu: xuất hiện hiện tƣợng tế bào chết hàng loạt với các triệu chứng khác hẳn với chết do độc tố. Các tế bào này chết co tròn, có màu sậm và tụ thành cụm. Không có sự khác biệt rõ rệt giữa các nồng độ. Tuy nhiên, thảm tế bào bên dƣới vẫn còn nên chúng tôi tiếp tục quan sát ở thời điểm 48 giờ. Thời điểm 48 giờ: Đối chứng dƣơng: tế bào vẫn phát triển bình thƣờng, màu tế bào không đổi chứng tỏ không có hiện tƣợng nhiễm khuẩn. Đối chứng âm (không có huyết thanh chỉ có độc tố) : Tế bào chết hàng loạt sau 48 giờ nuôi cấy với các triệu chứng nhƣ chết do độc tố. Đối với các giếng mẫu: tế bào chết với triệu chứng nhƣ trên rất rõ rệt, thảm tế bào bên dƣới chết hoàn toàn. Do đó chúng tôi kết luận tế bào chết không phải do độc tố mà do một thành phần nào đó trong huyết thanh gây ra nhƣ bổ thể hay do sodium azid. Vì vậy để tìm ra nguyên nhân gây chết tế bào chúng tôi tiến hành thử nghiệm trung hòa độc tố với mẫu huyết thanh này nhƣng có bất hoạt ở 56 o C trong thời gian 30 phút. 4.4.2 Đối với mẫu huyết thanh có sodium azid và có bất hoạt Tiến hành thực hiện phản ứng trung hòa độc tố trên môi trƣờng nuôi cấy tế bào Vero đối với mẫu huyết thanh của lô 5 có bổ sung sodium azid và bất hoạt ở 56 o C trong thời gian 30 phút. Kết quả nhƣ sau: Hình thái tế bào khi quan sát dưới kính hiển vi ở thời điểm 24h và 48h  Thời điểm 24 giờ: Đối chứng tế bào phát triển tốt, môi trƣờng vẫn có Đối chứng độc tố: có hiện tƣợng tế bào chết với hình thái nhƣ chết do độc tố: tế bào co tròn, chuyển màu sậm hơn so với thảm tế bào bên dƣới nhƣng chƣa rõ ràng. Ở các giếng mẫu: có hiện tƣợng tế bào chết hàng loạt nhƣng lớp tế bào dƣới đáy giếng vẫn còn. Môi trƣờng vẫn còn màu hồng chứng tỏ tế bào vẫn phát triển tốt không có hiện tƣợng nhiễm khuẩn. 32 32  Thời điểm 48 giờ: Đối chứng dƣơng: tế bào vẫn phát triển bình thƣờng, màu môi trƣờng không đổi chứng tỏ không có hiện tƣợng nhiễm khuẩn. Đối chứng âm: Tế bào chết hàng loạt sau 48giờ nuôi cấy. Đối với mẫu: Các tế bào này khi chết co cụm, bám thành mảng và sậm màu, thảm tế bào ở dƣới chết hoàn toàn. Ở nồng độ pha loãng huyết thanh càng thấp thì số tế bào chết càng ít. Điều này khác với chết do độc tố. Tế bào chết do độc tố cũng co lại nhƣng riêng rẻ, có màu nhạt, bên dƣới vẫn còn thấy lớp tế bào mỏng, và nếu nhƣ huyết thanh không có kháng thể để trung hòa độc tố thì tế bào ở các giếng này phải chết tƣơng đƣơng nhau. Ngƣợc lại, nếu huyết thanh có kháng thể thì lƣợng tế bào chết là tỉ lệ nghịch với độ pha loãng. Hơn nữa, đối chứng tế bào vẫn phát triển tốt, môi trƣờng không đổi màu nên không có hiện tƣợng bị nhiễm khuẩn ở đây. Do đó chúng tôi kết luận tác nhân chính gây hiện tƣợng chết tế bào không phải do độc tố VT2e. Kết quả đo OD 620nm Từ kết quả đo OD 620nm (bảng 3) cho thấy: Các giếng ở nồng độ huyết thanh cao (1/2, 1/4, 1/8, 1/32, 1/64) thì chỉ số OD thấp và thấp so với đối chứng âm, có nghĩa là tế bào chết nhiều so với đối chứng độc tố. Các giếng có nồng độ huyết thanh càng thấp (1/128, 1/256, 1/512, 1/1024, 1/2048) thì chỉ số OD càng cao, nghĩa là tế bào chết càng ít. Điều này không đúng với nguyên tắc trung hòa độc tố: nếu huyết thanh có kháng thể thì nồng độ huyết thanh càng cao khả năng trung hòa độc tố càng cao. Do đó tế bào không bị chết bởi độc tố nên chỉ số OD cao. Hay nói cách khác nồng độ huyết thanh tỉ lệ thuận với chỉ số OD. Trong trƣờng hợp nếu huyết thanh không có kháng thể chống lại độc tố hay kháng thể quá thấp thì các giếng này sẽ chết tƣơng đƣơng nhau và tƣơng đƣơng với đối chứng âm. Chỉ số OD của giếng đối chứng âm chênh lệch với đối chứng dƣơng không rõ rệt (0.041 ở phiến 1 và 0.046 ở phiến 2) chứng tỏ độc tố trong thử nghiệm này kém hoạt tính và chỉ số OD của các giếng có nồng độ huyết thanh thấp lại cao hơn so với đối chứng dƣơng. Do đó độc tố không khả năng gây chết tế bào hàng loạt nhƣ trên. Bởi vì huyết thanh chúng tôi lấy trong điều kiện vô trùng, có bất 33 33 hoạt các thành phần có trong huyết thanh có khả năng gây hại cho tế bào trƣớc khi thử nghiệm nhƣ bổ thể,…nhƣng lại bổ sung sodium azid để tăng thời gian bảo quản nên có thể do sodium azid đã gây chết tế bào hàng loạt. Vì chất này là một chất kháng khuẩn nên có thể gây hại cho tế bào. Để khẳng định điều này chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm chứng minh sodium azid là yếu tố gây chết tế bào. 4.4.3 Thí nghiệm chứng minh sodium azid gây chết tế bào vero 4.4.3.1 Mẫu huyết thanh có sodium azid có bất hoạt Tiến hành ủ huyết thanh có bổ sung sodium azid đã bất hoạt với tế bào vero thì sau 24 giờ nuôi cấy xuất hiện hiện tƣợng tế bào chết hàng loạt với các đặc điểm nhƣ thử nghiệm trung hòa độc tố. 4.4.3.2 Đối với mẫu không có sodium azid có bất hoạt Tiến hành ủ huyết thanh không bổ sung sodium azid đã bất hoạt với tế bào vero thì sau 24 giờ nuôi cấy tế bào vẫn phát triển bình thƣờng, màu môi trƣờng chuyển sang màu hồng nhạt. Do đó chúng tôi kết luận sodium azid đã gây ra hiện tƣợng chết tế bào hàng loạt. 4.4.4 Đối với mẫu huyết thanh không có sodium azid và có bất hoạt Qua các kết quả khảo sát trên chúng tôi chọn mẫu kháng huyết thanh không có sodium azid để thực hiện phản ứng trung hòa trên tế bào vero. Chúng tôi thu đƣợc kết quả nhƣ sau: Tiến hành thực hiện phản ứng trung hòa độc tố trên môi trƣờng nuôi cấy tế bào vero đối với mẫu huyết thanh không bổ sung sodium azid có kết quả nhƣ sau:  Hình thái tế bào khi quan sát dƣới kính hiển vi ở thời điểm 24-48 giờ:  Thời điểm 24 giờ: Ở giếng đối chứng tế bào (đối chứng dƣơng) tế bào phát triển tốt, giếng đối chứng độc tố (đối chứng âm) có hiện tƣợng tế bào chết rải rác, sậm màu hơn so với thảm tế bào nhƣng không đáng kể. Ở các giếng mẫu tế bào có chết nhƣng không rõ ràng, thảm tế bào vẫn phát triển tốt. Môi trƣờng nuôi cấy có màu hồng nhạt, không có hiện tƣợng nhiễm khuẩn.  Ở thời điểm 48 giờ: 34 34 Ở giếng đối chứng tế bào (đối chứng dƣơng) tế bào phát triển tốt, giếng đối chứng độc tố (đối chứng âm) có hiện tƣợng tế bào chết hàng loạt, sậm màu hơn so với thảm tế bào bên dƣới. Ở các giếng mẫu cũng có hiện tƣợng tế bào chết hàng loạt nhƣ ở giếng đối chứng âm, tuy nhiên không có sự khác biệt rõ rệt giữa các mẫu và các nồng độ pha loãng.  Chỉ số OD 620nm (bảng 4) Ở tất cả các mẫu thí nghiệm, chỉ số OD đều thấp hơn so với đối chứng dƣơng và cả đối chứng âm. Bên cạnh đó chỉ số OD ở các nồng độ và ở các lô thí nghiệm tƣơng dƣơng nhau không có sự chênh lệch rõ rệt. Điều đó chứng tỏ tế bào chết ở tất cả các giếng là tƣơng đƣơng nhau. Từ đó ta có thể kết luận hiệu giá của kháng huyết thanh ở tất cả các lô thí nghiệm là rất thấp không đủ khả năng trung hòa độc tố ở liều 10TCID 50 và không có sự khác biệt giữa các lô thí nghiệm. Tiến hành thí nghiệm giảm liều độc tố vero xuống còn 2TCID 50 thì kết quả vẫn âm tính. Điều này chứng tỏ liều protein tái tổ hợp MBP-VT2eB 75 g và 50 g/heo kích ứng đáp ứng miễn dịch rất yếu, hiện tƣợng trên có thể do các nguyên nhân sau:  Vì đây là protein tái tổ hợp nên có thể cấu trúc không gian bị thay đổi không giống với cấu trúc của tiểu phần B của độc tố VT2e nên kháng thể tạo ra không đặc hiệu với độc tố nên không có khả năng trung hòa độc tố, hay có thể protein bị biến tính trong quá trình bảo quản và pha dịch tiêm do đó mất đặc tính kháng nguyên đặc trƣng.  Liều tiêm thấp nên lƣợng kháng thể tạo ra không đủ khả năng trung hòa liều 10TCID 50 . Chúng tôi cho rằng nguyên nhân thứ hai là nguyên nhân chính. Bởi vì trong một thử nghiệm tiêm protein này trên thỏ với liều tiêm 100μg/ml thì protein tái tổ hợp MBP-VT2eB đã kích ứng thỏ tạo kháng thể trung hòa độc tố vero (Phan Lê Mai, 2005, số liệu chƣa công bố). 35 35 Hình 4.3 Hình tế bào vero chết do sodium azid Hình 4.4 Hình tế bào vero chết do độc tố Hình 4.5 Giếng đối chứng độc tố đã nhuộm Hình 4.6 Giếng đối chứng tế bào đã nhuộm 36 36 PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN MPB-VT2eB pha trong dung dịch keo phèn là một kháng nguyên an toàn đối với heo với liều tiêm 50µg/heo hay 75µg/heo. Phản ứng kết tủa khuyếch tán trên thạch có thể dùng để định tính kháng thể kháng protein tái tổ hợp MBP-VT2eB. Huyết thanh không bất hoạt và có bổ sung sodium azid 0,05% sẽ gây độc đối với tế bào vero. Liều tiêm 50μg/heo và 75µg/heo có lập lại và không lập lại không đủ khả năng gây đáp ứng miễn dịch tạo kháng thể có thể phát hiện đƣợc bằng phƣơng pháp kết tủa khuếch tán trên thạch cũng nhƣ phƣơng pháp trung hòa độc tố trên tế bào vero ở liều 2TCID 50 . 5.2 ĐỀ NGHỊ Thử nghiệm tăng dần liều kháng nguyên MBP- VT2eB (từ 200- 250 μg/heo). Nếu huyết thanh dùng để trung hòa độc tố trên môi trƣờng nuôi cấy tế bào thì không nên bổ sung sodium azid và phải bất hoạt ở 56 o C trong 30 phút. . 2TCID 50 thì kết quả vẫn âm tính. Điều này chứng tỏ liều protein tái tổ hợp MBP-VT2eB 75 g và 50 g /heo kích ứng đáp ứng miễn dịch rất yếu, hiện tƣợng trên có thể do các nguyên nhân sau: . và có bổ sung sodium azid 0, 05% sẽ gây độc đối với tế bào vero. Liều tiêm 50 μg /heo và 75 g /heo có lập lại và không lập lại không đủ khả năng gây đáp ứng miễn dịch tạo kháng thể có thể phát. kháng nguyên an toàn đối với heo với liều tiêm 50 µg /heo hay 75 g /heo. Phản ứng kết tủa khuyếch tán trên thạch có thể dùng để định tính kháng thể kháng protein tái tổ hợp MBP-VT2eB. Huyết