55 22. Donnenberg M. S., Tzipori S., McKee M. L., O Brien A. D., Alroy J., and Kaper J. B., 1993. The role of the eae gene of enterohemorrhagic Escherichia coli in intimate attachment in vitro and in a porcine model. J Clin. Invest. 92:1418-1424. 23. FAO, 1992. Microbiological analysis in the food control laboratory. 24. FDA, 2002. “Diarrheagenic Escherichia coli”, Bacteriological Analytical manual Online, CFSAN. September 2002. <URL: http://vm.cfsan.fda.gov/~ebam-4a.html. 25. Gaastra W., and Svennerholm A. M., 1996. Colonization factors of human enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC). Trends Microbiol. 4:444-452. 26. Gyles C. L., 1992. Escherichia coli cytotoxins and enterotoxins. Can. J. Microbiol. 38:734-746. 27. Handl C. E., Olsson E., and Flock J. I., 1992. Evaluation of three different STb assays and comparision of enterotoxin pattern over a five-year period in Swedish porcine Escherichia coli. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 15:505-510. 28. Harel J., Lapointe H., Fallara A., Lorrtie A., Bigras-Poulin M., Lariviere S., and Faibrother J. M., 1991. Detection of genes for fimbrial antigens and enterotoxins associated with Escherichia coli serogroups isolated from pig with diarrhea. J. Clin. Microbiol. 29:745-752. 29. Hitotsubashi S., Fujii Y., Yamanaka H., and Okamoto K., 1992. Some properties of purified Escherichia coli heat-stable enterotoxin II. Infect. Immum. 60:4468-4474. 30. Karmali M. A.,1989. Infection by verocytotoxin – producing Escherichia coli. J. Clin. Microbiol. Rev. 2:15-38. 31. Kenny B., DeVinney R., Stein M., Reinscheid D. J., Frey E. A., and Finlay B. B., 1997. Enteropathogenic E. coli (EPEC) transfers its receptor for intimate adherence into mammalian cells. Cell 91:511-520. 32. Keskimaki M., 2001, Shiga toxin-producing and other diarrhoeagenic Escherichia coli in Finland: pheno-and genotypic epidemiology. Academic dissertation. The Faculty of Ariculture and Forestry of the University of Helsinky, Finland. 33. Koneman E. W., Allen S. D., Dowell V. R., and Sommers H. M., 1983. Color Atlas and extbook of Diagnostic Microbiology. 2d ed., J.B. Lippincott Co., Philadelphia, PA, pp. 57-124. 56 34. Leung P. H. M., Peiris J. S. M., Ng W. W. S., Robin-Browne R. M., Bettelheim K. A., and Yam W., C., 2003. A newly discovered verotoxin variant, VT2g, produced by bovine verocytotoxigenic Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. 69: 7549-7553. 35. Levine M. M., Xu J., Kapper J. B., Lior H., Prado V., Tall B., Nataro J. P., Karch H., and Wachsmuth K., 1987. A DNA probe to identify enterohemorrhagic Escherichia coli of O157:H7 and other serotypes that cause hemorrhagic colitis and hemolytic uremic syndrome. J. Infect. Dis. 156:175-182. 36. Makino S., Kobori H., Asakura H., Watarai M., Shirahata T., Ikeda T., et al, 2000. Detection and characterization of Shiga toxin-producing Escheichia coli from seagulls. Epidemiol. Infect. 125:55-61. 37. Moon H. W., Schneider R. A., and Moseley S. L., 1986. Comparative prevalence of four enterotoxin genes among Escherichia coli isolated from swine. Am. J. Vet. Res. 47:210-212. 38. Nataro J. P. and Kaper J. B., 1998. Diarrheagenic Escherichia coli. Clin. Microbiol. Rev. 11(1):142-201. 39. Neter E., Westphal O., Luderitz O., Gimo R. M., and Gorzynski E. A., 1995. Demonstration of antibodies against enteropathogenic Escherichia coli in sera of children of various ages. Pediatrics. 16:801-808. 40. Paton A. W. and Paton J. C., 1998 a . Detection and characterization of Shiga toxigenic Escherichia coli by using multiplex - PCR assay for stx1, stx2, eaeA, enterohemorrhagic E. coli hlyA, rfb 0111 , and rfb o157 . J. Clinical Microbiol. 36(2):598-602. 41. Paton J. C. and Paton A. W., 1998 b . Phathogenesis and diagnosis of Shiga toxin-producing Escherichia coli infection. Clin. Microbiol. Rev. 11:450-479. 42. Pierard D., Muyldermans G., Moriau L., Stevens D., and Lauwers S., 1998. Identification of new verocytotoxin type 2 variant B-subunit genes in human and animal Echerichia coli isolates. J. Clin. Microbiol. 36:3317-3322. 43. Protocol online <URL:http://www.protocol-online.org/prot/Molecular-Biology/PCR/ Multiplex- PCR/ 44. Radu S., Mutalib S. A., Rusul G., Ahmad Z., Morigaki T., Asai N., Kim Y. B., Okuda J., and Nishibuchi M., 1998. Detection of Escherichia coli O157:H7 in beef marketed in Malaysia. Appl. Environ. Microbiol. 64:1153- 1156. 57 45. Schmidt H., Beutin L., and Karch H., 1995. Molecular Analysis of the Plasmid-encoed Hemolysin of Escherichia coli O157:H7 strain EDL 933. Infec. Immunity. 63:1055-1061. 46. Smith H. R., and Scotland S. M., 1998. Vero cytotoxin-producing strains of Escherichia coli. J. Med. Microbiol. 26:77-85. 47. Timisjarvi A. T., Alatossava T., 2004. Rapid DNA preparation from milk and dairy process samples for the detection of bacteria by PCR. Food Microbiol. 21:365-368. 48. Thomas A., Cheasty T., Chart H., and Rowe B., 1994. Isolation of vero cytotoxin-producing Escherichia coli serotypes O9ab:H- and O101:H- carrying VT2 variant gene sequences from a patient with haemolytic uraemic syndrome. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 13:1074-1076. 49. Toma C., Lu Y., Higa N., Nakasone N., Chinen I., Baschkier A., Rivas M., and Iwanaga M., 2003. Multipex – PCR Assays for identification of human diarrheagenic Escherichia coli. J. Clin. Microbiol. 41:2669-2671. 50. Wang G., Clark C. G., and Rodgerst F. G., 2002. Detection in Escherichia coli of the genes defining the O157:H7 serotype, and components of the type 2 shiga toxin family by multiplex PCR. J. Clin. Microbiol. 40:3613-3619. 51. Wieler L. H., Vieler E., Erpenstein C., Schlapp T., Steinruck H., Bauerfeind R., Byomi A., and Baljer G., 1996. Shiga toxin-producing Escherichia coli strains from bovines: Association of adhesion with carriage of eae and other genes. J. Clin. Microbiol. 34:2980-2984. 58 PHỤ LỤC 1 MÔI TRƯỜNG VÀ THUỐC THỬ Môi trường CT-SMAC SMAC Peptone 20 g Sodium chloride 5 g Bile salts 1,5 g Sorbitol 10 g Crystal violet 0,001 g Neutral red 0,03 g Agar 15 g Nước cất vừa đủ 1.000 ml CT – SUPPLEMENT Cefixime 0,05 mg/l Potassium tellurite 2,5 mg/l MAC Bacto peptone 17 g Bacto Proteose peptone 3 g Bacto Lactose 10 g Bacto Bile salts 1,5 g Sodium Chloride 5 g Bacto Agar 13,5 g Neutral Red 0,03 g Bacto Crystal Violet 0,001g Nước cất vừa đủ 1000 ml NA Peptone 5 g 59 Sodium chloride 5 g Beef Extract 1,5 g Yeast Extract 1,5 g Agar 15 g Nước cất vừa đủ 15 g pH = 7,4 ± 0,2 (25 0 C) Nước peptone đệm Peptone 10 g Sodium chloride 5 g Disodium hydrogen phosphate 9 g Potassium dihydrogen phosphate 1,5 g Nước cất vừa đủ 1000 ml pH = 7 SIMMON CITRAE Sodium citrate 2 g NaCl 5 g K 2 HPO 4 1 g NH 4 H 2 PO 4 1 g MgSO 4 0,2 g Bromothymol blue 0,08 g Agar 15 g Nước cất vừa đủ 1000 ml MR – VP Peptone 7 g Glucose 5 g K 2 HPO 4 5 g Nước cất vừa đủ 800 ml pH = 6,9 ± 0,2 60 Thuốc thử VP (Voges Proskauer) Dung dịch A: Alpha naphthol 5 g Ethanol tuyệt đối 100 ml Dung dịch B: Potassium hydroxyde 40 g Nước cất 100 ml MR (Methyl red) Methyl red 0,1 g Alcohol 300 ml Nước cất vừa đủ 500 ml HÓA CHẤT ĐIỆN DI TBE (0,5 X) Tris HCl 3,94 mg Acid Boric 1,39 g Na 2 EDTA 93,06 mg Nước cất vừa đủ 500ml pH = 8,3 Agarose (1,4%) Loading dye Bromophenol blue 0,25% Sucrose 40% TE 1X vừa đủ 100% HÓA CHẤT NHUỘM GEL TBE 1X Ẹthidium bromide 10 mg/ml 61 PHỤ LỤC 2 CÁC VẤN ĐỀ THƯỜNG GẶP TRONG MULTIPLEX – PCR VÀ HƯỚNG GIẢI QUYẾT Vấn đềà Hướng giải quyết Sản phẩm không chuyên biệt * Nếu dài - Tăng nồng độ KCl (buffer) đến 1,2 – 2 X nhưng giữ nguyên nồng độ MgCl 2 ở 1,5 – 2 mM. * Nếu ngắn - Giảm nồng độ buffer còn 0,7 – 0,9 X nhưng giữ nồng độ MgCl 2 ở 1,5 – 2 mM. - Tăng dần nhiệt độ ủ bắt cặp. - Giảm lượng DNA xét nghiệm. - Giảm lượng primer. - Giảm lượng Taq – polymerase. - Tăng nồng độ MgCl 2 đến 3 – 4,5 mM nhưng giữ nguyên nồng độ dNTP. - Thêm chất phụ gia, tốt nhất là dùng BSA (0,1 – 0,8 g/l: nồng độ cuối cùng). Có thể dùng 5% glycerol (v/v nồng độ cuối). * Nếu không có sản phẩm - Chạy PCR cho mỗi cặp primer được sử dụng trong multiplex với nhiệt độ ủ bắt cặp thấp hơn bình thường. - So sánh các sản phẩm không chuyên biệt cho mỗi cặp primer kiểm tra với sản phẩm không chuyên biệt nhìn thấy khi chạy multiplex – PCR. Điều này có thể chỉ ra mỗi cặp primer mang lại những sản phẩm không chuyên biệt trong phản ứng multiplex. - Kết hợp một vài hoặc tất cả những phương pháp trên. Sản phẩm yếu (mờ) - Giảm thời gian ủ bắt cặp. - Giảm nhiệt độ kéo dài xuống 62 – 68 0 C. - Tăng thời gian kéo dài. - Tăng nồng độ DNA xét nghiệm. - Tăng tất cả lượng primer sử dụng. - Điều chỉnh nồng độ Taq – polymerase. - Thay đổi nồng độ buffer nhưng giữ nồng độ MgCl2 ở 1,5 – 2 mM. - Tăng nồng độ MgCl 2 đến 3 – 4,5 mM nhưng giữ nguyên nồng độ dNTP. - Thêm chất phụ gia, tốt nhất là dùng BSA (0,1 – 0,8 g/l: nồng độ cuối cùng). Có thể dùng 5% glycerol (v/v nồng độ cuối). 62 Sản phẩm dài và yếu (mờ) - Giảm nồng độ buffer còn 0,7 – 0,8 X nhưng giữ nồng độ MgCl2 ở 1,5 – 2 mM. - Tăng nồng độ MgCl2 lên 3 – 4,4 mM nhưng giữ ngun nồng độ dNTPs. - Tăng thời gian biến tính. - Tăng thời gian ủ bắt cặp. - Giảm nhiệt độ ủ bắt cặp. - Tăng thời gian và nhiệt độ kéo dài. - Tăng lượng primer đối với sản phẩm PCR có băng mờ đồng thời giảm lượng primer cho băng đậm. - Thêm chất phụ gia, tốt nhất là dùng BSA (0,1 – 0,8 g/l). Nên thử 5% glycerol (v/v nồng độ cuối cùng). - Kết hợp một vài hoặc tất cả các phương pháp trên. Sản phẩm ngắn và yếu (mờ) - T ă ng n ồ n g độ buffer đến 1,2 – 2 X nhưng giữ nồng độ MgCl 2 ở 1,5 – 2 mM. - Giảm thời gian biến tính. - Giảm thời gian ủ bắt cặp. - Giảm nhiệt độ ủ bắt cặp. - Giảm thời gian và nhiệt độ kéo dài. - Tăng lượng primer đối với sản phẩm PCR có băng mờ và giảm lượng primer có băng đậm. - Thêm chất phụ gia BSA (0,1 – 0,8 g/l), có thể thử 5% glycerol (v/v nồng độ cuối cùng). - Kết hợp một vài hoặc tất cả các phương pháp trên. . enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC). Trends Microbiol. 4:4 44-452. 26. Gyles C. L., 1992. Escherichia coli cytotoxins and enterotoxins. Can. J. Microbiol. 3 8 :7 34 -74 6. 27. Handl C verocytotoxigenic Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. 6 9: 75 49 -75 53. 35. Levine M. M., Xu J., Kapper J. B., Lior H., Prado V., Tall B., Nataro J. P., Karch H., and Wachsmuth K., 19 87. A. Multipex – PCR Assays for identification of human diarrheagenic Escherichia coli. J. Clin. Microbiol. 4 1:2 669-2 671 . 50. Wang G., Clark C. G., and Rodgerst F. G., 2002. Detection in Escherichia coli