11 nhiễm sắc thể và có chiều dài tổng cộng 1389cM từ cặp lai IR34538 (Indica) và Bulu Dalam (Mc couch và ctv, 1998). Trong những thập niên qua, di truyền Menden đã và đang bƣớc vào thời đại mới, đƣợc gọi là hệ gen (Genomics), nghiên cứu về cấu trúc và chức năng của các gen. Những thông tin về chuỗi mã DNA đã đƣợc giải mã trên một số loài điển hình nhƣ lúa và Arapidopsis, nhƣng chức năng của các gen tìm thấy chƣa đƣợc biết nhiều. Việc tạo ra đột biến trên cây trồng kết hợp với đánh dấu phân tử đang đóng một vai trò quan trọng để giải quyết vấn đề trên, khi tác nhân gây đột biến làm thay đổi các tính trạng mang gen mục tiêu. Các đánh dấu ứng dụng hiện nay đƣợc xem nhƣ có hiệu quả đáng tin cậy là đánh dấu “siêu vệ tinh” hay còn gọi là SSR (simple sequence repeats) và đang đƣa vào ứng dụng rộng đánh dấu “các thể đa hình nucleotide đơn” hay SNP (Single nucleotid polymorphism) để xác định đột biến. 2.4. Nghiên cứu di truyền gen axit phytic thấp Kiểu gen và môi trƣờng là những nhân tố chính làm thay đổi tổng lƣợng photpho trong hạt.Trong tự nhiên các kiểu gen điều khiển sự thay đổi lƣợng photpho trong hạt chủ yếu là tăng hay giảm hàm lƣợng axit phytic mà các thành phần chứa photpho khác không thay đổi. Ngƣời ta đã tạo đƣợc một số gen lặn (lpa) làm giảm hàm lƣợng axit phytic bằng phƣơng pháp gây đột biến bằng hoá chất và phân lập gen này ở trên cây bắp và cây lúa mạch. Các gen này làm thay đổi rất lớn giữa các thành phần chứa photpho trong hạt nhƣ axit phytic, các inositol photphate khác và photphate tự do.Trong đó gen đột biến lpa1 làm giảm hàm lƣợng axit phytic bằng cách tự cân bằng sinh học trong phân tử với photphat tự do (tức là làm tăng hàm lƣợng photphat tự do). Gen này đƣợc xác định nằm trên chromosome 1S của cây bắp và trên chromosome 2H của cây lúa mạch. Tƣơng tự đối với gen lpa2 thì axit phytic giảm cùng với các dạng inositol photphate khác và làm tăng lên photphate tự do. Gen đột biến lpa2 đƣợc xác định nằm trên chromosome 1S của cây bắp và chromosome 2H của cây lúa. Nhƣ vậy cho đến 12 nay tất cả các gen đột biến cho hàm lƣợng axit phytic thấp đều làm tăng lƣợng photphate tự do. Đây chính là chỉ thị trong việc chọn lọc các dòng lúa đột biến có hàm lƣợng axit phytic thấp. Đột biến axit phytic thấp đƣợc tạo ra do các tác nhân đột biến trên các loài cây trồng nhƣ bắp, lúa gạo, lúa mạch và đậu nành ( Ras-mussen và Hatzack, 1998; Larson và ctv., 2000; Raboy và ctv., 2000; Wilcox và ctv., 2000) và đƣợc ứng dụng trong nghiên cứu chọn giống di truyền (Raboy và ctv., 2001). Có hai loại đột biến ảnh hƣởng đến axit phytic thấp trên bắp là đột biến lpa1 làm giảm lƣợng axit phytic nhƣng không tích lũy inositol polyphotphate và đột biến lpa2 cũng làm giảm lƣợng axit phytic nhƣng hạt đột biến này tích lũy InsP 3 , InsP 4 và InsP 5 (Raboy và ctv., 2000). Dạng đột biến lpa2 ở ngô (Zea mays) xảy ra do sự đột biến ở gen inositol phosphate kinase. Gen inositol phosphate kinase ở ngô (ZmIpk) đƣợc xác định thông qua sự so sánh trình tự với gen Ins(1,3,4)P 3 5/6-kinase ở ngƣời và Arabidopsis. Dạng mRNA của gen ZmIpK biểu hiện ở trong phôi, nơi mà hàm lƣợng axit phytic gia tăng ở hạt ngô. Phân tích Southern-blot, cloning, đọc trình tự gen ZmIpK từ dạng đột biến lpa2 cho thấy alen lpa2-1 đƣợc tạo ra do sự sắp xếp lại trình tự ở locus của gen ZmIpK và alen lpa2-2 đƣợc tạo ra do sự đột biến nucleotide làm xuất hiện một codon stop ở đầu N của gen ZmIpK. Và điều này cho thấy ZmIpK là một trong những enzym kinase tham gia vào quá trình sinh tổng hợp axit phytic trong giai đoạn phát triển của hạt. Sinh tổng hợp axit phytic thấp trong hạt và sự xác định gen thông qua con đƣờng phân lập các nhân bản cDNA trên bắp. Các nhân bản này có chuỗi mã di truyền giống với nhiều inositol photphat kinase từ động vật và nấm men. Ứng dụng kỹ thuật bất hoạt chèn đoạn mã đột biến (Mutator insertion knockout) để điều tra chức năng của gen. Sau khi bất hoạt những gen này, hàm lƣợng axit phytic trong hạt sẽ giảm, hạt sẽ tích lũy myo-inositol, inositol photphat và photphat tự do. Trong sự phát triển của hạt, axit phytic đƣợc tổng hợp từ quá trình đƣờng phân (Gluco-6-P). Enzym Ins(3) P 1 synthase (MIPS) xúc tác quá trình Glucose-6- photphate để tạo ra Ins(3) P 1 . 13 Phân tích clone MIPS ở cây yến mạch (Avena sativa) cho thấy clone này chứa 1936 bp (accession no. AB059557) mã hóa cho polypeptid có số lƣợng amino axit là 510 và có tính tƣơng đồng cao với nhiều loại cây trồng khác. Theo Yoshida và ctv. cho thấy độ tƣơng đồng amino axit giữa protein MIPS ở cây yến mạch với protein MIPS của các cây khác vào khoảng 77 đến 88% (Yoshida và ctv 1999, Hageman và ctv 2001). Protein MIPS có trọng lƣợng 56.13 kD. Phân tích bằng phƣơng pháp Northern blot cho thấy gen MIPS biểu hiện cao trong suốt giai đoạn đầu trƣởng thành của hạt và giảm hoạt động ở cuối giai đoạn trƣởng thành. Nồng độ axit phytic cũng tăng từ từ cùng với sự trƣởng thành của hạt. RNA của gen MIPS ít đƣợc phát hiện thấy ở hoa và không phát hiện đƣợc ở thân và lá. Nồng độ RNA MIPS cao nhất đƣợc phát hiện ở những hạt giai đoạn chƣa trƣởng thành của hạt và giảm từ từ theo quá trình phát triển của hạt. Hình 2.5. Phân tích bằng phƣơng pháp Northern-blot ở cây yến mạch. A: biểu hiện của gen MIPS ở hạt chƣa trƣởng thành (1), lá (2) và thân (3) sau 5 ngày trổ hoa. B: Biểu hiện gen MIPS ở hạt đang phát triển lúc 0, 5, 10, 15 và 25 ngày sau khi trổ hoa. (Nguồn:www.cropscience.org.au/icsc2004/poster/3/2/1/724_saneoka.htm) 14 Hình 2.6. Sự thay đổi nồng độ P tổng, axit phytic và và P vô cơ sau khi trổ hoa ở cây yến mạch. (Nguồn:www.cropscience.org.au/icsc2004/poster/3/2/1/724_saneoka.htm) Phân tích hàm lƣợng P tổng số, axit phytic cho thấy nồng độ P tổng số ở hoa là 3,51 mg/g trọng lƣợng khô (DW), và tăng từ từ với sự trƣởng thành của hạt (Hình 2.6). Nồng độ P tổng số ở hạt trƣởng thành đạt 10,15 mg/g trọng lƣợng khô lúc 65 ngày sau khi ra hoa (giai đoạn trƣởng thành đầy đủ ). Axit phytic bắt đầu tăng ở giai đoạn đầu và tăng nhanh cùng sự trƣởng thành của hạt với nồng độ 5,97 mg/g trọng lƣợng khô. Nồng độ P vô cơ là 1,58 mg/g trọng lƣợng khô ở hoa và tăng đến 3,3 mg/g trọng lƣợng khô sau 30 ngày trổ hoa, sau đó giảm nhanh cùng với sự tăng lên của axit phytic. Những hợp chất chứa P khác ngoại trừ axit phytic và axit vô cơ thì nồng độ tƣơng đƣơng với nồng độ P vô cơ ở giai đoạn phát triển ban đầu của hạt. Hợp chất P khác chứa P tế bào đƣợc định nghĩa là những hợp chất đƣờng có chứa P, trọng lƣợng phân tử thấp tham gia vào thành phần cấu tạo của màng tế bào. Những hợp chất này là những tiền chất quan trọng trong sinh tổng hợp axit phytic và inositol photphat. P đƣợc hấp thụ bởi cây trồng sẽ đƣợc chuyển trực tiếp vào hạt và đóng vai trò quan trọng cho việc tổng hợp những hợp chất hữu cơ chứa P ở giai đoạn đầu của quá trình trƣởng thành. Những kết quả nghiên cứu này cho thấy enzym MIPS biểu hiện mạnh trong hạt và đóng vai trò sinh tổng hợp axit phytic trong suốt quá trình phát triển của hạt. 15 2.5. Đánh dấu siêu vệ tinh (Microsatellite) Đánh dấu siêu vệ tinh hay SSR đƣợc ứng dụng thành công từ năm 1995 (Mc couch và ctv., 1996). Đó là tập hợp các đoạn chuỗi mã rất ngắn từ 2-10bp. Các đoạn này xuất hiện trên chuỗi mã DNA đƣợc lặp đi lặp lại nhất định, sắp xếp ngẫu nhiên, rất khác nhau đƣợc phân tán khắp nơi trên bộ gen động vật thực vật và con ngƣời (Gunter Kahl, 2001). Những chuỗi mã ngắn này có thể ở dạng lặp lại của hai, ba hay bốn nucleotid và đƣợc xắp xếp ngẫu nhiên trên một dãy của 5-50 bản sao (copy) chẳng hạn nhƣ (AT) 29 , (CAC) 16 hay (GACA) 32 . SSR xuất hiện rất nhiều trên bộ gen thực vật và có mặt trung bình sau mỗi 6-7kb (Cardle và ctv., 2000). Các đoạn này đƣợc khuyếch đại trong phản ứng PCR nhờ vào mồi xuôi và mồi ngƣợc. Sản phẩm PCR chứa các alen SSR đƣợc tách rời thông qua điện di trên gel agarose hay gel acrylamide. SSR hữu ích trong việc thiết lập bản đồ di truyền, bản đồ vật lý và bản đồ chuỗi mã cơ bản (Sequence-based) trên cây lúa. Ngoài ra SSR còn cung cấp cho nhà chọn giống và nhà di truyền công cụ đáng tin cậy và hiệu quả để liên kết sự khác biệt giữa kiểu gen và kiểu hình . 2.6. Quá trình sinh tổng hợp axit phytic Con đƣờng sinh tổng hợp axit phytic có thể tóm tắt gồm 2 phần sau: sự cung cấp Ins và sự tổng hợp Ins polyphotphat sau đó. Nguồn tổng hợp vòng Ins duy nhất là enzym Ins(3) P 1 synthase (MIPS). Enzym này chuyển Glc-6-P thành Ins(3) P 1 (Loewus và Murthy, 2000). Hoạt tính enzym Ins(3) P 1 synthase ở những hạt đang phát triển cung cấp Ins cũng nhƣ Ins(3)P 1 (Yoshida và ctv., 1999) mà sau đó sẽ đƣợc chuyển thành axit phytic qua sự photphoryl hóa của hai hay nhiều enzym kinase (Biswas và ctv., 1978; Stephens và Irvine, 1990 ). Bƣớc photphoryl hóa Inositol đầu tiên đƣợc xúc tác bởi enzym Inositol kinase. Enzym này cũng xúc tác tạo ra Ins(3)P 1 (English và ctv., 1966; Loewus và ctv., 1982). Con đƣờng tổng hợp axit phytic khởi đầu bằng cơ chất ban đầu là Ins, hoạt động của enzym Ins kinase và trải qua nhiều giai đoạn photphoryl hóa thông qua những hợp chất trung gian đã 16 đƣợc miêu tả lần đầu tiên thông qua những nghiên cứu ở nấm nha bào Dictyostelium discoideum (Stephens và Irvine, 1990) và những nghiên cứu sau này ở tập đoàn đơn bào Spirodela polyrhiza (Brearley và Hanke, 1996, 1996b. Con đƣờng sinh tổng hợp ở D. Discoideum tiến hành thông qua những hợp chất trung gian Ins(3) P 1 , Ins(3,6) P 2 , Ins(3,4,6) P 3 , Ins(1,3,4,6) P 4 , và Ins(1,3,4,5,6) P 5 . Con đƣờng sinh tổng hợp axit phytic ở S. Polyrhiza tiến hành thông qua những hợp chất trung gian Ins(3) P 1 , Ins(3,4) P 2 , Ins(3,4,6) P 3 , Ins(3,4,5,6) P 4 , và Ins(1,3,4,5,6) P 5 . Những con đƣờng này có điểm chung ở những hợp chất trung gian đầu và cuối. Những Ins photphat này vẫn chƣa đƣợc biết với vai trò là những chất truyền tín hiệu thứ cấp. Sự tổng hợp axit phytic cũng có thể tiến hành một phần qua những con đƣờng liên quan đến những chất truyền tín hiệu bao gồm photphatidylinositol (PtdIns), những photphat trung gian và Ins(1,4,5)P 3 (Bƣớc 6 và 7; Van der kayy và ctv., 1995; York và ctv., 1999). Ins photphat bị photphoryl hóa ở mức độ cao hơn axit phytic nhƣ là InsP 7 và InsP 8 , là những hợp chất đƣợc ghi nhận là xảy ra phổ biến ở tế bào eukaryotic (steps 12 và 13; Mayr và ctv., 1992; Menniti và ctv., 1993; Stephens và ctv., 1993; Brearley và Hanke, 1996c; Safrany và ctv., 1999) Những nghiên cứu còn cho thấy (Biswas và ctv., 1978b; Phillippy và ctv., 1994; Brearley và Hanke, 1996b) Ins(1,3,4,5,6) P 5 còn đóng vai trò là chất Ins photphat sau cùng trong con đƣờng tổng hợp axit phytic ở tế bào eukaryotic. 17 Hình 2.7. Sơ đồ con đƣờng sinh tổng hợp axit phytic ở trong tế bào eukaryo: (1), D-Ins(3)-P 1 (or L-Ins[1]-P 1 ) synthase; (2), D-Ins 3-phosphatase (or L-Ins 1-phosphatase); (3), D-Ins 3-kinase (or L-Ins 1-kinase); (4), Ins P- or polyP kinases; (5), Ins (1,3,4,5,6) P 5 2-kinase hay phytic acid-ADP phosphotransferase; (6), PtdIns synthase; (7), PtdIns và PtdIns P kinases, theo sau bởi PtdIns P-specific phospholipase C, và Ins P kinases; (8), D- Ins(1,2,3,4,5,6) P 6 3-phosphatase; (9) D-Ins(1,2,4,5,6) P 5 3-kinase; (10), D- Ins(1,2,3,4,5,6) P 6 5-phosphatase; (11), D-Ins(1,2,3,4,6) P 5 5-kinase; (12), pyrophosphate-forming Ins P 6 kinases; (13), pyrophosphate-containing Ins PolyP-ADP -phosphotransferases. Nguồn: http://www.plantphysiol.org/cgi/content/full/124/1/355 18 CHƢƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài Đề tài đƣợc thực hiện từ ngày 1 tháng 3 năm 2005 đến ngày 1 thánh 8 năm 2005 tại phòng phân tích sinh hóa và phòng thí nghiệm sinh học phân tử thuộc Bộ Môn Di Truyền và Chọn Giống của Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long, quận Ô Môn, TP. Cần Thơ. 3.2. Vật liệu Tên của các giống lúa trong thí nghiệm Bảng 3.1. Tên các giống lúa đƣợc phân tích Số thứ tự Tên giống 1 2 3 4 5 6 OM 1490 dạng bố mẹ OMCS 2000 dạng bố mẹ OM 1490 đột biến OMCS 2000 đột biến Lúa mùa Lúa cao sản 3.3. Nguồn gốc vật liệu Các quần thể lúa đột biến, lúa mùa và lúa cải tiến trên đƣợc lấy tại ngân hàng lúa của viện lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long. Trong đó: OMCS 2000, OM 1490, AS996, NTCĐ-5 đƣợc Bộ môn di truyền Viện Lúa Đồng Bằng sông Cửu Long phát triển bằng phƣơng pháp lai tạo và tạo biến dị soma. 19 OM CS2000 đƣợc phát triển từ cặp lai OM1738/MRC19399 và OM 1490 đƣợc phát triển từ cặp lai OM606/IR44592-62-1-3-3 . Đây là hai giống đƣợc chọn số dòng nhiều để đánh giá và phân tích hàm lƣợng axit phytic . Quần thể lúa đột biến OM1490 và OMCS2000 đƣợc tạo ra bằng việc gây đột biến bằng tia gamma với 5 Kr và phát triển thông qua chọn lọc ở các thế hệ M 0 M 1 , M 2 , M 3 và M 4 AS996 đƣợc phát triển từ phƣơng pháp lai xa và cứu sống phôi mầm IR 64/ O. Rufipogon và đƣợc phóng xạ bằng tia gamma với 3Kr Nàng thơm Chợ Đào -5 đƣợc đột biến bằng tế bào soma và tiếp tục đƣợc đột biến với tia phóng xạ gamma với cƣờng độ 5 Kr . Qui trình phát triển dòng đột biến OM 1490 và OMCS 2000 ( Lang 2004) OM O OM 606 x IR44592 – 62 – 1 – 3 – 3 OM 1490 M 0 M 1 M 2 M 3 M 4 Tia Gamma với 5 Kr OM 1738 x MRC 19399 OMCS 2000 M 0 M 1 M 2 M 3 M 4 Tia Gamma với 5 Kr 20 3.4. Dụng cụ và hóa chất 3.4.1. Dụng cụ Cối nghiền gạo Đĩa 96 giếng Pipetman các loại Máy thanh trùng (autoclave), máy Waterbath, lò vi sóng Tủ lạnh 4 0 và -20 0 C Cân Máy ly tâm Máy chạy PCR Máy điện di nằm ngang (Gibco BRL model 4001-Life technologies) Máy chụp hình gel bằng tia UV 3.4.2. Hóa chất 3.4.2.1. Hóa chất phân tích sinh hóa HCL, H 2 SO 4 , Amonium Molybdate, Axit Ascorbic, K 2 HPO 4 của Trung Quốc. 3.4.2.2. Hóa chất phân tích phân tử Các hóa chất ly trích DNA bao gồm: Cloroform : isoamylalcohol (24:1), Isopropanol, Etanol 100% và 70%, Dung dịch đệm ly trích DNA (xem phụ lục), SDS, CTAB, NaCl, TE thuộc hãng Merck của Đức Các hóa chất trong chạy điện di: Agarose (Mỹ), Dung dịch TAX 50X và TBE 10X. Các hóa chất chạy PCR : Dung dịch stock của dNTPs (5mM), dung dịch stock của PCR buffer (10X) . dòng lúa đột biến có hàm lƣợng axit phytic thấp. Đột biến axit phytic thấp đƣợc tạo ra do các tác nhân đột biến trên các loài cây trồng nhƣ bắp, lúa gạo, lúa mạch và đậu nành ( Ras-mussen và. Larson và ctv., 20 00; Raboy và ctv., 20 00; Wilcox và ctv., 20 00) và đƣợc ứng dụng trong nghiên cứu chọn giống di truyền (Raboy và ctv., 20 01). Có hai loại đột biến ảnh hƣởng đến axit phytic. đột biến OMCS 20 00 đột biến Lúa mùa Lúa cao sản 3.3. Nguồn gốc vật liệu Các quần thể lúa đột biến, lúa mùa và lúa cải tiến trên đƣợc lấy tại ngân hàng lúa của viện lúa Đồng Bằng