31 Bảng 3.4: Chƣơng trình nhiệt cho phản ứng RAPD – PCR của thí nghiệm 2 Số chu kỳ Nhiệt độ ( 0 C) Thời gian (phút) 1 94 4 37 94 1 T a 1 72 2 1 72 10 Hold 4 0 C  Chỉ tiêu đánh giá: Các band DNA trên gel điện di Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố MgCl 2 , dNTP và primer lên phản ứng RAPD – PCR  Mục đích thí nghiệm: Tối ưu hóa quy trình RAPD – PCR  Phương pháp tiến hành: Theo quy trình sau Bảng 3.5: Thành phần hóa chất cho phản ứng RAPD – PCR của các nghiệm thức trong thí nghiệm 3 Nghiệm thức Hóa chất Dung dịch gốc Thể tích sử dụng Nồng độ cuối PCR buffer Taq DNA polymerase DNA mẫu 25 mM 5 U 20 ng/ul 2,5 ul 0,1 ul 1 ul 250 uM 0,5 U 20 ng Nghiệm thức 1 MgCl 2 dNTP Primer 25 mM 10 mM 10 pmol/ul 1,5 ul 0,25 ul 0,65 ul 150 uM 100 uM 6,5 pmol (260 uM ) Nghiệm thức 2 MgCl 2 dNTP Primer 25 mM 10 mM 10 pmol/ul 2 ul 0,3 ul 0,65 ul 200 uM 120 uM 6,5 pmol (260 uM ) 32 Nghiệm thức 3 MgCl 2 dNTP Primer 25 mM 10 mM 10 pmol/ul 2,5 ul 0,3 ul 0,65 ul 250 uM 120 uM 6,5 pmol (260 uM ) Nghiệm thức 4 MgCl 2 dNTP Primer 25 mM 10 mM 10 pmol/ul 2 ul 0,35 ul 0,65 ul 200 uM 140 uM 6,5 pmol (260 uM ) Nghiệm thức 5 MgCl 2 dNTP Primer 25 mM 10 mM 10 pmol/ul 2 ul 0,3 ul 0,7 ul 200 uM 120 uM 7,0 pmol (280 uM ) Nghiệm thức 6 MgCl 2 dNTP Primer 25 mM 10 mM 10 pmol/ul 2,5 ul 0,35 ul 0,7 ul 250 uM 140 uM 7,0 pmol (280 uM ) H 2 O Thêm vào cho đủ 25 ul Bảng 3.6: Chƣơng trình nhiệt cho phản ứng RAPD – PCR của thí nghiệm 3 Số chu kỳ Nhiệt độ ( 0 C) Thời gian (phút) 1 94 4 37 94 1 T a 1 72 2 1 72 10 Hold 4 0 C  Chỉ tiêu đánh giá: Số lượng và chất lượng các band DNA trên gel điện di Sau khi xác định quy trình tối ưu của phản ứng RAPD – PCR, tiến hành chạy RAPD với 50 mẫu và phân tích kết quả bằng phần mềm NTSYS 33 3.3.3. Chạy AFLP (Quy trình theo Applied Biosystem) 3.3.3.1. Cắt thử DNA (300 ng) và chạy kiểm tra trên gel agarose 1,5% Phản ứng cắt gồm có:  300 ng DNA genome  4 U EcoRI  3 U MseI  6 ul 5X dung dịch đệm Ủ 2 giờ ở 37 0 C, 15 phút ở 70 0 C để bất hoạt enzyme, sau đó chuyển ngay sang đá rồi ly tâm để cho phản ứng dồn xuống đáy ống. Kiểm tra DNA đã cắt bằng cách lấy 10 ul điện di trên gel agarose 1,5% cùng với mẫu đối chứng xem DNA có được cắt hay không. Ở bước này nhằm kiểm tra chất lượng DNA bộ gene vì sự thành công của kỹ thuật AFLP phụ thuộc vào việc DNA bộ gene được cắt hoàn toàn bằng enzyme hạn chế. 3.3.3.2. Chuẩn bị hỗn hợp enzyme (cho 4 mẫu)  1 ul đệm 10X T4 DNA ligase có ATP  0,4 ul 0,5 M NaCl  0,2 ul 1 mg/ml BSA (làm loãng từ dung dịch mẹ 10 mg/ml)  4 unit MseI  20 unit EcoRI  4 Weiss unit T4 DNA ligase Trộn kỹ, ly tâm 10 giây. Giữ trong đá. 3.3.3.3. Thực hiện phản ứng cắt và gắn  1 ul đệm 10X T4 DNA ligase có ATP  1,0 ul 0,5 M NaCl  0,5 ul 1 mg/ml BSA  1,0 ul MseI adapter  1,0 ul EcoRI adapter  2,0 ul hỗn hợp enzyme (chuẩn bị ở bước 3.3.4.2)  Cho thêm 0,5 ug DNA mẫu (đối chứng cho 5,5 ul DNA từ KIT) 34 Trộn kỹ, ly tâm 10 giây. Để ở nhiệt độ phòng qua đêm hoặc 37 0 C trong 2 giờ. Cho thêm TE vào mỗi ống phản ứng cắt – gắn để được thể tích 200 ul. Giữ ở 2 – 6 0 C hoặc –20 0 C 3.3.3.4. Nhân bản tiền chọn lọc Cho vào ống 0,2 ml các thành phần:  4,0 ul DNA đã cắt – gắn và pha loãng (chuẩn bị ở bước 3.3.4.3)  1,0 ul primer tiền chọn lọc  15,0 ul hỗn hợp AFLP (P/N 402005) Bảng 3.7: Chƣơng trình nhiệt cho phản ứng PCR nhân bản tiền chọn lọc Số chu kỳ Nhiệt độ ( 0 C) Thời gian 1 72 2 phút 20 94 20 giây 56 30 giây 72 2 phút 1 60 30 phút Hold 4 0 C (Nguyễn Đức Thành, 2004) Sau khi nhân bản giữ ở 2 – 6 0 C. Kiểm tra nhân bản: Dùng 10 ul sản phẩm nhân bản tiền chọn lọc điện di trên gel agarose 1,5%. Pha loãng sản phẩm: Cho 190 ul TE vào 10 ul sản phẩm còn lại, trộn kỹ, ly tâm và giữ ở 2 – 6 0 C Lưu ý: Nên ủ adapter ở 95 0 C trong 5 phút, để nguội đến nhiệt độ phòng và ly tâm 14000 vòng/phút trước khi sử dụng. 3.3.3.5. Nhân bản chọn lọc Cho vào ống 0,2 ml các thành phần:  3,0 ul sản phẩm nhân bản tiền chọn lọc đã pha loãng  1,0 ul primer MseI –CXX (5 uM)  1,0 ul primer EcoRI –AXX đánh dấu (1 uM) 35  15,0 ul hỗn hợp AFLP (P/N 402005) Bảng 3.8: Chƣơng trình nhiệt cho phản ứng PCR nhân bản chọn lọc (Nguyễn Đức Thành, 2004) Sản phẩm PCR chọn lọc được điện di trên máy giải trình tự DNA để đọc kết quả Cách tiến hành: Cho vào ống eppendorf 0,2 ml các thành phần:  9,0 ul chất biến tính (hidiformamide)  0,5 ul sản phẩm PCR chọn lọc  0,5 ul DNA chuẩn (GeneScan 500 ROX) Biến tính ở 95 0 C trong 5 phút (sử dụng máy PCR), sau đó làm lạnh ngay bằng đá và load vào giếng điện di trên máy giải trình tự DNA. 3.3.4. Phân tích kết quả bằng phần mềm NTSYS Các band thu được từ kết quả điện di RAPD và số liệu từ AFLP được mã hóa thành dạng nhị phân 0 và 1. Band nào có thì chuyển thành 1, band không có chuyển thành 0. Bảng mã hóa được lưu dưới dạng file excel và chuyển sang phần mềm NTSYS phiên bản 2.1 để xử lý. Số chu kỳ Nhiệt độ ( 0 C) Thời gian 1 94 2 phút 1 94 20 giây 66 30 giây 72 2 phút 9 94 20 giây Giảm 1 0 C sau mỗi chu kỳ 30 giây 72 2 phút 20 94 20 giây 56 30 giây 72 2 phút 1 60 30 phút Hold 4 0 C 36 CHƢƠNG IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Thu thập mẫu tại các vùng trồng điều thuộc tỉnh Ninh Thuận Chúng tôi đã tiến hành thu thập 55 mẫu điều ở 12 xã thuộc 4 huyện của tỉnh Ninh Thuận với các đặc điểm cơ bản về: kích thước hạt, quả; năng suất; thời gian ra hoa; số đợt trái trong năm, màu sắc hạt, quả;…trong đó nhóm điều Việt Nam chiếm 48%, điều Ấn Độ chiếm 36% (cách phân chia nhóm điều do người trồng điều đưa ra); tính trạng hạt to chiếm 38%, hạt nhỏ và trung bình chiếm 58%; tính trạng năng suất cao chiếm 52%, năng suất thấp và trung bình chiếm 42%; các mẫu vừa có tính trạng hạt to vừa cho năng suất cao chiếm 22% và có vài mẫu mang những đặc điểm đặc biệt như: trái màu trắng, màu nâu, màu xanh; cho trái 3 đợt trong năm; cây một năm tuổi có trái; hoa nhiều nhưng không trái; ra hoa, trái sớm…(các đặc điểm chi tiết được trình bày ở bảng 4.1 phần phụ lục II) Do cây điều ở tỉnh Ninh Thuận được trồng theo các chương trình gây rừng, phủ xanh đồi núi trọc đồng thời giúp người dân xóa đói giảm nghèo nên về mặt giống còn nhiều hạn chế. Các giống điều chưa được phân chia rõ rệt. Theo kinh nghiệm người trồng điều chia làm hai loại: Một loại cây phân tán rộng, hoa chùm, lá non màu đỏ gọi là điều Ấn Độ; một loại cây phân tán hẹp hoặc trung bình, lá non màu xanh gọi là điều Việt Nam. Để đánh giá đa dạng di truyền chúng tôi đã thu thập mẫu nhiều nơi và lựa chọn những tính trạng đặc biệt vì vậy số lượng mẫu tuy ít nhưng vẫn mang tính đại diện cho việc đánh giá. 4.2. Hoàn thiện quy trình ly trích DNA DNA là thông tin di truyền, là vật liệu quan trọng dùng trong các thao tác nghiên cứu về phân tử. Vì vậy, hoàn thiện quy trình ly trích DNA nhằm thu được DNA tinh sạch, có chất lượng cao là bước đầu tiên, không thể thiếu trong các nghiên cứu về sinh học phân tử. Việc ly trích DNA từ lá điều gặp một số khó khăn do lá điều có lớp biểu mô ngoại bì bị cutin hóa mạnh, bên trong mô chứa nhiều protein, polysaccharide…làm cho DNA thu được có độ tinh sạch thấp. Để cải thiện chất lượng DNA ly trích chúng tôi đã thay đổi một vài yếu tố trong quy trình ly trích cho phù hợp. 37 Tóm tắt quy trình ly trích: cân Dịch lỏng (bỏ) Tủa trắng đục Dịch lỏng (bỏ) Rửa bằng Ethanol 70% (2 lần) + 100 ul TE 1X ủ 37 0 C /30 phút Để khô Bảo quản ở 4 0 C Mẫu 0,15 g Cho vào cối + 1,2 ml dịch trích EB Nghiền Dung dịch màu xanh đậm (vortex, ủ 65 0 C/45 phút) + 500 ul chloroform : isoamyl alcohol (24 : 1) Dung dịch màu xanh đậm Dịch lỏng màu xanh Cặn (bỏ) + 500 ul chloroform : isoamyl alcohol (24 : 1) Dịch lỏng màu xanh Dịch lỏng màu xanh nhạt Cặn (bỏ) vortex 10 phút, ly tâm 5 phút/14000 vòng/10 0 C vortex 10 phút, ly tâm 5 phút/14000 vòng/10 0 C + 2 ul RNase ủ 37 0 C/1 giờ Isopropanol lạnh (1 : 1) Dịch lỏng màu xanh nhạt có huyền phù (tủa ở -20 0 C qua đêm) Tủa trắng đục ly tâm 5 phút/14000 vòng/10 0 C + 300 ul TE 1X ủ 37 0 C/1 giờ Dung dịch trắng đục + 20 ul Sodium acetate 3 M, 640 ul Ethanol 100% Dung dịch trắng đục có huyền phù (để - 20 0 C / 30 phút) ly tâm 10 phút/14000 vòng/10 0 C Dịch lỏng màu xanh nhạt Hình 4.1 : Quy trình ly trích DNA 38 Quy trình ly trích sử dụng 2-mercaptoethanol có tác dụng phá hủy mạnh thành tế bào giúp cho việc giải phóng DNA hiệu quả hơn, muối sodium acetate làm bất hoạt enzyme phân hủy DNA và cho chloroform isoamyl acohol 2 lần với việc ly tâm tốc độ cao giúp loại bỏ được tạp chất như protein, polysaccharide qua đó chất lượng DNA thu được tốt hơn. Nhìn chung quy trình ly trích khá ổn định và hiệu quả, vấn đề là tìm cách hạn chế sự đứt gãy của DNA, điều này phụ thuộc nhiều vào các tác nhân cơ học. Chúng tôi thực hiện ly trích 55 mẫu, thu được DNA ở 50 mẫu đạt tiêu chuẩn dùng cho các kỹ thuật phân tử, chiếm 90,9%. Trong 50 mẫu thu được có 52% số mẫu đạt DNA tinh sạch có OD > 1,8 và 80% số mẫu có hàm lượng DNA lớn hơn 50 ng/ul. Trong đó có 44% số mẫu vừa có OD > 1,8 vừa có hàm lượng DNA lớn hơn 50 ng/ul. (kết quả chi tiết ở bảng 4.2 phần phụ lục II). Đối với 5 mẫu ly trích thu được DNA không đạt đều là 5 mẫu lá non, có thể do lá non chứa nhiều nhựa và các hợp chất phenol nên khi loại bỏ các tạp chất đồng thời mất đi một lượng DNA đáng kể. Do đó kết quả ly trích lá non thu được lượng DNA rất thấp, không đủ tiêu chuẩn để thực hiện RAPD – PCR. Như vậy thích hợp nhất cho việc ly trích là lá trưởng thành. Hình 4.2: Các mẫu DNA ly trích 12, 13, 14, 16, 18, 19, 21, 29: NH12 – NH29; 7 – 10: NP7 – NP10; 38, 39, 41: NS38 – NS41; 42, 50: BA42, BA50 12 13 14 16 18 19 21 29 7 8 9 10 38 39 41 42 50 39 Qua hình 4.2 chúng tôi nhận thấy việc ly trích theo hình 4.1 là tương đối phù hợp, mặc dù kết quả điện di cho thấy có hiện tượng DNA bị gãy (gel bị smear) nhưng kết quả đo OD tương đối tốt và hàm lượng DNA cũng khá cao (trung bình 108 ng/ul). Trong quá trình ly trích chúng tôi nhận thấy một số vấn đề sau:  Lúc cân mẫu chuẩn bị nghiền, tránh để lá điều thoát hơi nước, nếu không việc ly trích DNA sẽ không đạt hiệu quả thậm chí không có DNA. Do sự thoát hơi nước tự nhiên làm lá điều bị khô, các mô bị tổn thương dẫn đến sự hư hỏng DNA. Có thể dùng bịch nylon để đựng mẫu sau khi cân hoặc dùng giấy gói lại, tuy nhiên dùng bịch nylon hiệu quả hơn  Dịch trích EB khi bảo quản thường có hiện tượng kết tủa (CTAB) ảnh hưởng đến hiệu quả ly trích DNA, do đó cần ủ dung dịch EB ở 65 0 C khoảng 5 phút trước khi sử dụng  Quá trình nghiền ảnh hưởng đến sự đứt gãy DNA, do đó khi nghiền tránh tạo bọt và không nghiền quá mạnh  Ở các bước cho TE vào hòa tan DNA không nên khuấy bằng vortex (khuấy bằng vortex DNA sẽ gãy). Nếu ủ ở 37 0 C trong 30 phút mà DNA chưa tan hết thì ủ ở thời gian lâu hơn  Khuấy trộn nhẹ, kỹ để tránh gãy DNA, thường khuấy bằng vortex khoảng 800 – 900 vòng  Ở bước 3 và bước 4 khi chuyển lấy dịch trong cẩn thận tránh lấy phạm vào phần tạp phía dưới, nếu không độ tinh sạch sẽ không cao. Thường bước 3 hút khoảng 450 ul và bước 4 hút khoảng 300 ul  Ở bước 11 khi để khô cặn cần chú ý, nếu để quá khô sẽ làm hỏng DNA, nếu còn ethanol sẽ ảnh hưởng xấu đến DNA trong quá trình bảo quản và phản ứng PCR. 4.3. Xác định quy trình RAPD – PCR và đánh giá mức độ đa dạng di truyền của quần thể điều hiện đƣợc trồng tại tỉnh Ninh Thuận 4.3.1.Thí nghiệm 1: Khảo sát quy trình RAPD – PCR của Samal và ctv (2003) Với quy trình ở thí nghiệm này, sản phẩm PCR không có band trên gel điện di, mặc dù Samal và ctv (2003) đã thu được kết quả rất tốt. Điều này có thể do việc sử dụng hóa 40 chất có nguồn gốc khác nhau nên kết quả không giống nhau. RAPD – PCR không cho sản phẩm có thể do số chu kỳ quá lớn, làm cho Taq - polymerase giảm hoạt tính và các thành phần trong phản ứng PCR cạn kiệt, dẫn đến sự ức chế trong phản ứng PCR. Sunil Archak và ctv (2003) đã tiến hành phản ứng RAPD – PCR với quy trình khác với Samal và ctv (2003), số chu kỳ khuếch đại là 40 và cũng thu được kết quả rất tốt. Do đó chúng tôi nghĩ đến việc giảm số chu kỳ trong phản ứng PCR. 4.3.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của yếu tố chu kỳ đến phản ứng RAPD - PCR Sản phẩm PCR có xuất hiện band trên gel điện di nhưng kết quả các band còn mờ. Hình 4.3: Sản phẩm PCR khi thực hiện với primer 11 ở thí nghiệm 2 Nguyên nhân có thể do thành phần hóa chất hoặc số chu kỳ chưa phù hợp. Chúng tôi tiến hành thay đổi chu kỳ nhiệt với 39 chu kỳ khuếch đại nhưng kết quả thu được không tốt hơn. Do đó chúng tôi thực hiện thí nghiệm 3 để tìm quy trình tối ưu hơn. 4.3.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hƣởng của các yếu tố MgCl 2 , dNTP và primer lên phản ứng RAPD – PCR NH13 NH14 NH15 NH16 NH18 NH25 NS31 BA42 NP6 NP9 NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 NT6 NT1 NT2 NT3 NT4 NT5NT6 NP6, primer 11 NP9, primer 1 . quản và phản ứng PCR. 4. 3. Xác định quy trình RAPD – PCR và đánh giá mức độ đa dạng di truyền của quần thể điều hiện đƣợc trồng tại tỉnh Ninh Thuận 4. 3.1.Thí nghiệm 1: Khảo sát quy trình RAPD. (vortex, ủ 65 0 C /45 phút) + 500 ul chloroform : isoamyl alcohol ( 24 : 1) Dung dịch màu xanh đậm Dịch l ng màu xanh Cặn (b ) + 500 ul chloroform : isoamyl alcohol ( 24 : 1) Dịch l ng màu xanh. pmol/ul 2,5 ul 0,3 ul 0,65 ul 250 uM 120 uM 6,5 pmol (260 uM ) Nghiệm thức 4 MgCl 2 dNTP Primer 25 mM 10 mM 10 pmol/ul 2 ul 0,35 ul 0,65 ul 200 uM 140 uM 6,5 pmol (260 uM )