50 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************ XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP NHẬN DIỆN VÀ PHÂN TÍCH TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA 21 DÒNG CACAO (THEOBROMA CACAO L.) BẰNG KỸ THUẬT MICROSATELLITE Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện : TS. PHẠM HỒNG ĐỨC PHƯỚC NGUYỄN THỊ PHƯƠNG DUNG TS. BÙI MINH TRÍ TS.JUAN CARLOS MOTAMAYOR Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2005 51 SUMMARY Construction of Theobroma cacao L. identification and analysis of genetic diversity using Microsatellites. ABSTRACT-The objective of this thesis is to study the genetic identification of accessions of Theobroma cacao L. from the cocoa collection of Nong Lam University, based on microsatellite markers. Five pairs of primers were used. The amplification products are separated on an ABI 3100 automated DNA sequencing apparatus. The results of this work will help to identify and analyse genetically diversity of cocoa cultivar of the cocoa collection of Nong Lam University. OBJECTIVE 1- Establish Nong lam university cocoa microsatellite database of 21 clones. 2- Study the genetic diversity of 21 clones. 3- Perform multiplex PCR to reduce the cost. 4- Validate a methodology to compare fingerprinting of cocoa accessions. METHOD - Five primers mTcCIR7, mTcCIR8, mTcCIR11, mTcCIR15 and mTcCIR18 were used to find specific microsatellite sequences of 21 cocoa cultivars. - Software Gene Mapper was used to analyse microsatellite database on sequencer ABI 3100. - Software Genetix was used to analyse genetic diversity of 21 cocoa cultivars. CONCLUSION Five microsatellites are enough to compare the identity of all samples. We could use those markers to establish the methodology to perform genetic comparisons in Vietnam. This cacao fingerprint database would be useful in evaluating labeling consistency and mistakes in Vietnamese clonal gardens, and in validation of the identities of clones that have been transferred between cocoa collections. Our methodology of microsatellite analysis is consistent, accurate and harmony with method of ICGD. Another result is performing successfully multiplex PCR to reduce the cost 3 times. Besides, the genetic diversity among 21 cocoa cultivars were established to support the breeder overcome difficulties in plant salection. 52 LỜI CẢM TẠ   Tôi xin trân trọng gửi lòng biết ơn đến các Thầy:  TS. Phạm Hồng Đức Phước  TS. Bùi Minh Trí  TS. Juan Carlos Motamayor đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, truyền đạt những kinh nghiệm quý báu và tạo những điều kiện tốt nhất cho việc thực hiện và hoàn thành đề tài tốt nghiệp này.  Tôi xin chân thành cảm ơn :  Ban giám hiệu trường Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh.  Ban giám đốc Trung tâm Phân tích Thí nghiệm trường Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh.  Ban Chủ nhiệm, các Thầy, Cô ở Bộ môn Công nghệ sinh học. đã hỗ trợ và tạo điều kiện tốt trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài.  Tôi rất biết ơn gia đình đã hết lòng hỗ trợ về mọi mặt để tôi hoàn thành đề tài tốt nghiệp của mình.  Đồng chân thành cảm ơn đến các Anh, Chị trong Trung tâm Phân tích Thí nghiệm: chị Võ Thị Thúy Huệ, chị Phan Đặng Thái Phương, anh Hồ Viết Thế, và các bạn sinh viên lớp Công nghệ sinh học 27 làm đề tài cùng với tôi tại Trung tâm Phân tích Thí nghiệm đã nhiệt tình giúp đỡ và hỗ trợ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài, nhất là những lúc khó khăn. TP Hồ Chí Minh tháng 8/2005 Nguyễn Thị Phương Dung 53 TÓM TẮT KHÓA LUẬN   Tên đề tài: Xây dựng phương pháp nhận diện và phân tích tính đa dạng di truyền của 21 dòng cacao (Theobroma cacao L.) bằng kỹ thuật Microsatellite.  Thời gian nghiên cứu: từ tháng 3/2005 đến tháng 8/2005.  Địa điểm nghiên cứu: Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Trường Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh.  Cơ sở nghiên cứu: Sử dụng marker phân tử Microsatellite trên cở sở phương pháp PCR và phân tích trình tự tự động để xây dựng phương pháp nhận diện hiệu quả và phân tích tính đa dạng di truyền của một số dòng cacao.  Mục đích nghiên cứu: - Xây dựng phương pháp nhận diện 21 dòng cacao bằng kỹ thuật microsatellite với độ chính xác và ổn định cao. - Tối ưu hoá phương pháp bằng kỹ thuật multiplex PCR. - Nghiên cứu tính đa dạng di truyền của 21 dòng cacao, làm cơ sở để đánh giá, phân loại và chọn lọc các giống có định hướng.  Phương pháp nghiên cứu: - Sử dụng 5 cặp primer microsatellite: mTcCIR7, mTcCIR8, mTcCIR11, mTcCIR15 và mTcCIR18 để phát hiện trình tự microsatellite đặc trưng. - Tiến hành phân tích microsatellite trên máy giải trình tự DNA (ABI 3100), sử dụng phần mềm Gene Mapper để phân tích dữ liệu microsatellite thu được. - Sử dụng phần mềm Genetix để phân tích tính đa dạng di truyền của 21 dòng cacao khảo sát.  Kết quả: - Phương pháp và kỹ thuật định danh ổn định, có độ chính xác cao - Tối ưu hóa phương pháp nhờ thực hiện thành công qui trình phản ứng multiplex PCR với 3 primer khác màu huỳnh quang, có cùng nhiệt độ bắt cặp 46 o C. - Thiết lập được mối quan hệ di truyền giữa 21 dòng cacao khảo sát.  Kết luận : 5 cặp primer microsatellite sử dụng trong đề tài đủ để định danh chính xác 21 dòng cacao khảo sát và phân tích được tính đa dạng di truyền của 54 chúng. Đồng thời phương pháp và kỹ thuật định danh của đề tài phù hợp với phương pháp phân tích microsatellite của Ngân hàng cacao thế giới ICGD, mở ra một triển vọng cho các ứng dụng tiếp theo của microsatellite. 55 Phần 1 Mở đầu  1.Đặt vấn đề Cacao có tên khoa học là Theobroma cacao L., một loại cây nhiệt đới được người Maya trồng cách đây hơn hai ngàn năm. Theobroma cacao L. có nguồn gốc từ Trung Mỹ, ngày nay được trồng phổ biến ở Brazil, Ghana, Indonesia, Malaysia và một số nước ở lưu vực sông Amazone (Juan Carlos Motamayor, 1999). Những giống cacao có nguồn gốc từ các nước nhiệt đới trên được trồng tại nhiều quốc gia nhưng sau một thời gian lai tạo, tên giống có thể bị nhầm lẫn là một vấn đề thường gặp phải, điều này sẽ ảnh hưởng đến công tác lai tạo giống, tạo những cây có năng suất thấp và kém hiệu quả kinh tế. Do đó cần phải xây dựng một phương pháp định danh chính xác hay đánh giá đúng tính đồng nhất di truyền trong việc lưu trữ bộ giống, từ đó sẽ cải thiện tính chính xác và tăng hiệu quả trong công tác chọn giống. Microsatellite là một công cụ đắc lực để giải quyết vấn đề như định danh và phát hiện những cây bị mất lai lịch đồng thời cũng đánh giá mức độ đa dạng di truyền của cây. Mức độ đa dạng di truyền là một chỉ tiêu quan trọng trong quá trình chọn tạo giống vì khi các cặp cha mẹ có độ đồng nhất di truyền cao sẽ làm mất tính ưu thế lai. Sự phối hợp các primer microsatellite được đánh dấu huỳnh quang trong phản ứng PCR và tiến hành phân tích microsatellite bằng máy giải trình tự sẽ cung cấp dữ liệu giúp cho việc nhận diện chính xác các giống cacao bằng đặc trưng phân tử. Trên cơ sở đó chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Xây dựng phương pháp nhận diện và phân tích tính đa dạng di truyền của 21 dòng cacao (Theobroma cacao L.) bằng kỹ thuật Microsatellite” Đề tài được thực hiện dưới sự hướng dẫn của TS. Bùi Minh Trí, TS. Phạm Hồng Đức Phước và TS. Juan Carlos Motamayor, chuyên gia về Microsatellite trên cây cacao của tổ chức USDA-Bộ Nông Nghiệp Mỹ và Công ty Master Food, Miami, Mỹ. Đối tượng nghiên cứu của đề tài là các giống cacao trong tập đoàn cacao của trường Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh. 56 2.Mục đích yêu cầu 2.1.Mục đích nghiên cứu 1- Xây dựng phương pháp nhận diện 21 dòng cacao dựa trên 5 cặp primer microsatellite: mTcCIR7, mTcCIR8, mTcCIR11, mTcCIR15 và mTcCIR18. 2- Tối ưu hóa phương pháp. 3- Kiểm tra độ chính xác và tính ổn định của phương pháp nhận diện. 4- Phân tích tính đa dạng di truyền của 21 dòng cacao. 2.2.Yêu cầu - Ly trích DNA từ mẫu lá với độ tinh khiết cao. - Xây dựng được qui trình PCR ổn định. - Đánh giá được sự khác biệt di truyền giữa các giống cacao khảo sát qua việc phân tích microsatellite bằng máy giải trình tự. - Định danh chính xác các dòng mã hóa bằng phần mềm Cervus. - Mô tả được quan hệ di truyền gần hoặc xa giữa các giống cacao khảo sát bằng phần mềm Genetix. - Xây dựng được qui trình cho phản ứng multiplex PCR. 57 Phần 2 Tổng quan tài liệu  2.1.Giới thiệu tổng quan về cây cacao Cây cacao có tên khoa học là Theobroma cacao L. (2n = 20), thuộc họ Sterculiacea, là cây duy nhất trong số 22 loài của thứ Theobroma được trồng sản xuất. Hiện nay có 3 vùng chính trên thế giới trồng cacao: - Nam Mỹ: Brazil, Ecuador. - Tây Phi: Bờ Biển Ngà, Ghana, Cameroon, Nigeria. - Đông Nam Á: Indonesia, Malaysia, Việt Nam. 2.1.1.Nguồn gốc cây cacao Cacao là một loại cây trồng bản địa của các nước nhiệt đới ẩm và được người Maya trồng ở Châu Mỹ từ rất lâu, trước khi người Châu Âu có mặt. Từ “cacao” từ tiếng Maya mà ra, và cho đến ngày nay, khắp nơi đều dùng từ này. Cacao xuất hiện lần đầu tiên trong danh mục từ thực vật từ năm 1605. 2.1.2.Đặc điểm hình thái Hình 2.1: Theobroma cacao 58 Rễ: rễ cacao có dạng trụ, dài khoảng 1.5-2 m. Trên suốt chiều dài của rễ trụ có nhiều rễ ngang phân nhánh và rất nhiều rễ con tập trung chủ yếu dưới cổ rễ khoảng 20 cm. Thân: Cacao là loài cây thân gỗ nhỏ, có thể cao từ 10-20 m nếu mọc tự nhiên. Trong điều kiện sản xuất, chiều cao trung bình của cây cacao khoảng 5-7 m, đường kính khoảng 10-18 cm. Trên mỗi thân cacao có thể có từ 4-5 tầng cành. Lá: Lá cacao phát triển theo từng đợt, buông thỏng xuống. Màu sắc lá thay đổi tùy theo giống, từ màu xanh nhạt đến vàng, từ màu hồng đến đỏ đậm. Trong quá trình trưởng thành, lá mất sắc tố nên có màu xanh hoặc xanh thẫm, cứng cáp hơn và có thể nằm ngang. Lá dưới bóng che có phiến rộng và xanh hơn lá ở ngoài nắng. Khí khổng chỉ có mặt ở dưới phiến lá. Trên mặt lá, mô dậu có nhiều khoang giữa các tế bào và chứa đầy chất nhựa, lớp ngoại bì bị cutin hóa rất mạnh. Lá tồn tại được từ 4-5 tháng, sau đó đi vào giai đoạn lão suy và rụng. Hoa: Hoa cacao xuất hiện trên sẹo lá của thân, cành. Hằng năm, hoa xuất hiện trên cùng một chỗ ở vết sẹo lá, lâu ngày chỗ ra hoa phình to và nhô lên thành đệm hoa. Hoa có cuống dài 1-3 cm, có 5 cánh đều đặn xen kẽ với 5 cánh đài. Hoa nở từ 3 giờ chiều đến 9 giờ sáng hôm sau. Quả: Những đặc tính về màu sắc, kích thước và hình dạng quả thay đổi rất nhiều tùy thuộc vào giống. + Màu sắc: Quả chưa chín có thể có màu xanh, đỏ tím hoặc xanh điểm sắc đỏ tím…Khi quả đạt độ chín, màu xanh chuyển qua vàng, màu đỏ tím thường chuyển qua màu da cam. + Hình dạng, kích thước: Hình dạng quả thay đổi từ hình cầu, hình oval đến hơi dài, nhọn hoặc hình trứng. Thường quả có chiều dài 7-30 cm, rộng 7-9 cm. Hạt: Hạt cacao không có nhân, mập, dài 2-3 cm và có cùi nhớt màu trắng, có vị hơi chua bao bên ngoài. Kế lớp cùi nhớt là lớp vỏ mỏng, nhiều đường gân bao bọc lấy hạt ở bên trong. Hạt chứa tử diệp màu tím (màu trắng ngà hoặc vàng nhạt đối với giống Criollo) và hóa nâu sau khi lên men. Kích thước hạt có thể thay đổi tùy theo giống và mùa vụ. Mỗi quả cacao có từ 30-40 hạt. 59 2.1.3.Yêu cầu sinh thái Khí hậu: Cacao thường được trồng ở các vùng có độ cao 800 m so với mực nước biển, trên các vùng có lượng mưa khoảng 1500-2000 mm/năm. Cây cacao thích nghi tốt ở nhiệt độ tối đa là 30-32 o C và nhiệt độ tối thiểu là 18-21 o C. Cây bị thiệt hại nghiêm trọng ở nhiệt độ nhỏ hơn 10 o C. Ẩm độ thích hợp cho cây khoảng 70-80%. Cacao đặc biệt sinh trưởng phát triển tốt trong điều kiện che bóng (chỉ cho 70% lượng ánh sáng lọt qua). Đất: Cacao thích hợp với nhiều loại đất khác nhau, đất cát, đất phù sa ven sông, đất trên các triền dốc và cả trên đất nghèo dinh dưỡng nhưng có bóng che và gần nguồn nước. Cacao sinh trưởng và phát triển tốt nhất với đất có độ pH trong khoảng 5.5-6.7. Đất phải đảm bảo khả năng thoát nước tốt nhưng đồng thời cũng giữ nước tốt. Vì thế, ở nước ta, cacao thường được trồng ở Tây Nguyên, Duyên Hải Miền Trung, Đông Nam Bộ và một số tỉnh miền Tây Nam Bộ. 2.1.4.Các giống cacao Trên thế giới, cacao có nhiều dòng, nhóm. Mỗi dòng, nhóm đều mang những đặc tính khác nhau, thích hợp trên những vùng sinh thái khác nhau. Hiện nay giống cacao được chia làm 3 nhóm chính: - Nhóm Criollo: Hoa có nhị màu vàng nhạt, trước khi chín quả có màu xanh hoặc đỏ, quả dài, chóp nhọn và có 10 khía đều nhau, vỏ quả sần sùi, mỏng, dễ cắt, hạt có tiết diện tròn, phôi nhũ có màu trắng ngà. - Nhóm Forastero – Amazone: Hoa có nhị màu tím, quả màu xanh, sau chuyển sang màu vàng, đuôi quả tròn, vỏ dày, khó cắt, ít hoặc không có khía, hạt có phôi nhũ màu đỏ tím. - Nhóm Trinitario: Có đặc tính trung gian giữa 2 nhóm Forastero và Criollo. Ở Việt Nam, giống cacao hiện có là con lai giữa nhóm Forastero và nhóm Trinitario. Tuy nhiên, trước đây, giống được trồng ở các địa phương là thế hệ con cháu của sự tạp giao giữa 3 nhóm trên. . đề tài: Xây dựng phương pháp nhận di n và phân tích tính đa dạng di truyền của 21 dòng cacao (Theobroma cacao L. ) bằng kỹ thuật Microsatellite Đề tài được thực hiện dưới sự hướng dẫn của. và phân tích tính đa dạng di truyền của một số dòng cacao.  Mục đích nghiên cứu: - Xây dựng phương pháp nhận di n 21 dòng cacao bằng kỹ thuật microsatellite với độ chính xác và ổn định cao microsatellite: mTcCIR7, mTcCIR8, mTcCIR 11, mTcCIR15 và mTcCIR18. 2- Tối ưu hóa phương pháp. 3- Kiểm tra độ chính xác và tính ổn định của phương pháp nhận di n. 4- Phân tích tính đa dạng di