51  Kết luận sơ bộ Về khả năng tạo mô sẹo, khi ta thay đổi nồng độ đường (0-80g/l) và nước dừa (0-200 ml/l) thì tỉ lệ mẫu cấy hình thành mô sẹo cũng thay đổi. Chứng tỏ nồng độ đường và nước dừa có ảnh hưởng lớn đến khả năng tạo mô sẹo của protocorm lan Hồ Điệp, có tác dụng kích thích khả năng tạo mô sẹo khi tăng nồng độ. Trong đó môi trường VW bổ sung 40g/l đường và 200ml/l nước dừa cho tỉ lệ mẫu cấy hình thành mô sẹo cao nhất (80% mẫu) nên được khuyến khích sử dụng. 52  Các thí nghiệm phát sinh phôi soma từ mô sẹo Thí nghiệm 3 : Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng TDZ trong điều kiện môi trường đặc, lỏng lắc đến khả năng hình thành phôi soma từ mô sẹo của cây lan Hồ Điệp in vitro (45NSC) TDZ là chất kích thích sinh trưởng đặc biệt thuộc nhóm cytokinin. Ngoài tính chất tạo chồi của một cytokinin, nó còn có khả năng tăng sinh mô sẹo của một auxin, hoặc được dùng thay thế cho auxin hoặc tổ hợp auxin và cyokinin trong sự hình thành phôi ở nhiều loài cây khác nhau. Qua đó, thí nghiệm sử dụng TDZ trong sự hình thành phôi soma từ mô sẹo của cây lan Hồ Điệp in vitro được tiến hành qua 2 bước như sau:  Bước 1. Tăng sinh mô sẹo (45NSC) Thí nghiệm 3a : Nuôi cấy trên môi trường đặc Sau khoảng thời gian 30-45 ngày sau khi cấy, chúng tôi quan sát thấy mô sẹo nuôi cấy trên môi trường đặc phát triển tốt, sinh khối tăng nhanh và sự phát triển của mô sẹo ở các nghiệm thức khá đều nhau. Trong đó, phần lớn sinh khối tạo thành là mô sẹo, chỉ có một số ít là các cấu trúc giống phôi. Do đó, môi trường đặc chỉ thích hợp cho việc cảm ứng sự phát triển của mô sẹo. Hình 4.2 Mô sẹo lan Hồ Điệp trên môi trường đặc TDZ 2mg/l. 53 Thí nghiệm 3b : Nuôi cấy trên môi trường lỏng và lắc (100 vòng/phút) Khi nuôi cấy mô sẹo trong môi trường lỏng lắc chúng tôi quan sát thấy lượng sinh khối tạo ra ít hơn so với nuôi cấy trên môi trường đặc, phần lớn có màu tối và khá chắc. Trong đó nghiệm thức 4 với nồng độ TDZ 2mg/l có lượng sinh khối cao nhất và màu sáng hơn các môi trường còn lại, đặc biệt xuất hiện một số mô sẹo có màu xanh. Hình 4.3 Mô sẹo lan Hồ Điệp trên môi trường TDZ lỏng lắc.  Bước 2: Phát sinh phôi soma (45NSC). Mô sẹo thu được từ thí nghiệm 3 được tách thành những cụm nhỏ và cấy chuyền sang môi trường ½ VW. Sau 45 ngày nuôi cấy chúng tôi nhận thấy xuất hiện nhiều các cấu trúc giống phôi trên bề mặt embryo callus (sinh khối thu được ở bước 1). Quan sát dưới kính hiển vi soi nổi thì chúng ta có thể thấy rằng các dạng này có hình thái tương tự như hình thái phôi vô tính, cũng trãi qua tất cả các giai đoạn phát triển: hình cầu, hình tim, hình thuỷ lôi, hình lá mầm. Kết luận rằng đây chính là phôi vô tính của lan Hồ Điệp (phalaenopsis.sp) TDZ 1mg/l TDZ 2mg/l 54 Phôi hình cầu Phôi hình tim Phôi hình thuỷ lôi Phôi hình lá mầm Hình 4.4 Các giai đoạn phát sinh phôi ở lan Hồ Điệp Sự phát sinh phôi vô tính này có sự khác nhau đáng kể giữa các mẫu cấy chuyền từ những bình nuôi cấy ở thí nghiệm 3.  Mô sẹo từ các bình nuôi cấy đặc ở thí nghiệm 3a ban đầu tiếp tục gia tăng sinh khối, chỉ có 1 số ít phôi vô tính xuất hiện.  Mô sẹo từ các bình nuôi cấy lỏng lắc ở thí nghiệm 3b có kết cấu khá chắc và tạo ra lượng phôi vô tính khá nhiều. 55 Bảng 4.5 Số phôi được tạo ra khi cấy chuyền mô sẹo từ thí nghiệm 3a và 3b sang môi trường đặc 1/2VW CV(%) 23 18,3  Ghi chú: Các giá trị trung bình theo sau không cùng mẫu tự trong cùng một cột có sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức độ 0,05.  Nhận xét: Kết quả thí nghiệm cho thấy hiệu quả tạo phôi ở những mẫu cấy được cảm ứng trên môi trường TDZ lỏng lắc ở thí nghiệm 3b cao hơn hẳn so với những mẫu cấy được cảm ứng trên môi trường TDZ đặc ở thí nghiệm 3a. Trong đó, số phôi hình thành nhiều nhất (39,67 phôi) là ở những mẫu cấy được cảm ứng trên môi trường lỏng lắc với nồng độ TDZ 2mg/l. Trong khi nghiệm thức đối chứng không có phôi nào được tạo ra. Biểu đồ 4.1 Thí nghiệm gia tăng sự phát sinh phôi Nghiệm thức Nồng độ của TDZ (mg/l) Số phôi/mẫu cấy từ môi trƣờng đặc (3a) Số phôi /mẫu cấy từ môi trƣờng lỏng lắc (3b) 3.1 0 0.00 D 0.00 E 3.2 0,1 2.67 C 4.33 D 3.3 1,0 4.33 BC 12.67 C 3.4 2,0 10.67 A 39.67 A 3.5 3,0 5.67 B 20.00 B 56 TDZ 0mg/l (đối chứng) TDZ 2mg/l Hình 4.5 Phôi được tạo ra khi cấy chuyền mô sẹo từ thí nghiệm 3a sang môi trường đặc 1/2VW. TDZ 0,1mg/l TDZ 1mg/l TDZ 2mg/l TDZ 3mg/l Hình 4.6 Phôi được tạo ra khi cấy chuyền mô sẹo từ thí nghiệm 3b sang môi trường đặc 1/2VW. 57  Kết luận sơ bộ: Vậy, việc thêm vào môi trường nuôi cấy TDZ nồng độ 2mg/l là thích hợp nhất cho việc cảm ứng tạo phôi vô tính trên lan Hồ Điệp. Thêm vào đó, giai đoạn nuôi cấy mô sẹo trong điều kiện lỏng lắc là rất cần thiết cho việc cảm ứng phôi vô tính hình thành nhiều hơn và dễ nhận biết hơn. Môi trường nuôi cấy đặc ban đầu cũng tạo được phôi vô tính, tuy nhiên tỉ lệ phôi tạo thành không cao nên phương pháp này không cho được kết quả tốt nhất. 58  Thí nghiệm tái sinh chồi từ phôi soma Thí nghiệm 4 : Ảnh hưởng của các loại môi trường đến quá trình tái sinh cây lan Hồ Điệp in vitro từ phôi soma Khi tiến hành nuôi cấy tái sinh cây, người ta thường bổ sung vào môi trường rất nhiều chất dinh dưỡng. Trong đó, khoai tây được sử dụng khá phổ biến, bổ sung khoai tây vào môi trường nuôi cấy giúp cây in vitro tăng trưởng tốt. Bên cạnh đó, chồi lan khi phát triển thường tiết ra hợp chất phenol gây độc cho mẫu cấy. Do đó trong nuôi cấy người ta còn bổ sung thêm than hoạt tính để hấp thu bớt độc tố do mẫu cấy tiết ra. Nghiên cứu ảnh hưởng của các loại môi trường có hoặc không có bổ sung khoai tây và than đến quá trình tái sinh cây từ phôi soma lan Hồ Điệp, 75 NSC chúng tôi thu được kết quả như sau: Bảng 4.6 Sự phát sinh hình thái của phôi soma ở các loại môi trường (75NSC) Nghiệm thức Xuất hiện mô sẹo Xuất hiện protocorm Xuất hiện chồi Xuất hiện rễ chồi MS X X MS+30g Khoai tây X X X MS+30g Khoai tây+1g Than X X X ½ MS+30g Khoai tây+1g Than X X X VW X X X VW+30g Khoai tây X X X VW+30g Khoai tây+1g Than X X X ½ VW+30g Khoai tây+1g Than X X  Ở môi trường MS không tạo chồi mà lại xuất hiện một ít protocorm + mô sẹo.  Ở môi trường MS+30g khoai tây có xuất hiện chồi và cả protocorm + mô sẹo.  Ở môi trường MS+30g khoai tây+1g Than có xuất hiện chồi nhiều hơn nhưng chủ yếu là protocorm và 1 ít mô sẹo.  Ở môi trường ½ MS+30g khoai tây+1g Than xuất hiện chồi nhiều hơn và 1 ít protocorm. 59  Ở môi trường VW có xuất hiện 1 ít chồi nhưng chủ yếu là mô sẹo + protocorm.  Ở môi trường VW+30g khoai tây xuất hiện chồi nhiều hơn, đặt biệt một số chồi đã mọc rễ.  Ở môi trường VW+30g khoai tây+1g Than xuất hiện chồi nhiều nhất và có rất nhiều chồi đã mọc rễ.  Ở môi trường ½ VW+30g khoai tây+1g Than xuất hiện chồi cũng khá nhiều. 4.1 Ảnh hƣởng của các loại môi trƣờng đến tỉ lệ mẫu chết và hệ số nhân chồi của phôi soma lan Hồ Điệp trong nuôi cấy tái sinh cây. Bảng 4.7 Ảnh hưởng của các loại môi trường nuôi cấy đến tỉ lệ mẫu chết và hệ số nhân chồi cây lan Hồ Điệp in vitro từ phôi soma 75 NSC.  Ghi chú: Các giá trị trung bình theo sau không cùng mẫu tự trong cùng một cột có sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức độ 0,05. Nghiệm thức Số mẫu cấy Số mẫu chết Số chồi hình thành Tỉ lệ mẫu chết (%) Hệ số nhân chồi MS 45 11 0 26.67 A 0,00 E MS+30g khoai tây 45 12 35 24.45 A 0,78 E MS+30g khoai tây+1g than 45 0 65 4.45 BC 1,44 E ½ MS+30g khoai tây+1g than 45 0 405 2.22 BC 9,00 B VW 45 0 20 6.67 B 0,44 E VW+30g khoai tây 45 0 135 2.22 BC 3,00 D VW+30g khoai tây+1g than 45 0 510 0 C 11,34 A ½ VW+30g khoai tây+1g than 45 0 240 0 C 5,33 C CV(%) 32 21,2 60  Nhận xét: 4.1.1 Ảnh hưởng của các loại môi trường đến tỉ lệ mẫu chết của phôi soma lan Hồ Điệp trong nuôi cấy tái sinh cây. Kết quả cho thấy tỉ lệ mẫu chết ở 2 môi trường là MS và MS+30g khoai tây là cao nhất với tỉ lệ khoảng 26.7%. Mẫu chết có thể là do 1 số phôi yếu không thích ứng được với môi trường cơ bản MS không bổ sung nhiều các chất dinh dưỡng. Ở các môi trường còn lại mẫu vẫn phát triển bình thường thành chồi hoặc tạo protocorm hay mô sẹo, chỉ có một số ít tỉ lệ mẫu bị chết (2.22 – 6,67%). 4.1.2 Ảnh hưởng của các loại môi trường đến hệ số nhân chồi của phôi soma lan Hồ Điệp trong nuôi cấy tái sinh cây Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, hệ số nhân là điều được quan tâm nhất bởi vì hệ số nhân càng cao thì số lượng cây sẽ càng nhiều. Môi trường MS không bổ sung khoai tây và than có hệ số nhân thấp nhất: không có chồi lan nào được tái sinh mà chỉ xuất hiện protocorm và mô sẹo, môi trường VW cũng có hệ số nhân rất thấp (0,44). Ngược lại, ở môi trường VW + 30g khoai tây + 1g than cho hệ số nhân cao nhất (11,34. Điều này cho thấy việc kết hợp sử dụng khoai tây và than trong nuôi cấy tái sinh lan Hồ Điệp sẽ cho kết quả cao hơn là khi không sử dụng. Biểu đồ 4.2 Hệ số nhân chồi của phôi soma lan Hồ Điệp trong nuôi cấy tái sinh cây. . chồi của phôi soma lan Hồ Điệp trong nuôi cấy tái sinh cây. Bảng 4.7 Ảnh hưởng của các loại môi trường nuôi cấy đến tỉ lệ mẫu chết và hệ số nhân chồi cây lan Hồ Điệp in vitro từ phôi soma 75. tây và than đến quá trình tái sinh cây từ phôi soma lan Hồ Điệp, 75 NSC chúng tôi thu được kết quả như sau: Bảng 4 .6 Sự phát sinh hình thái của phôi soma ở các loại môi trường (75NSC) Nghiệm. nghiệm tái sinh chồi từ phôi soma Thí nghiệm 4 : Ảnh hưởng của các loại môi trường đến quá trình tái sinh cây lan Hồ Điệp in vitro từ phôi soma Khi tiến hành nuôi cấy tái sinh cây, người ta