61 4.2 Ảnh hƣởng của các loại môi trƣờng đến các chỉ tiêu hình thái của lan Hồ Điệp trong nuôi cấy tái sinh chồi từ phôi soma Bang 4.8 Ảnh hưởng của các loại môi trường đến các chỉ tiêu hình thái của lan Hồ Điệp trong nuôi cấy tái sinh chồi từ phôi soma.  Ghi chú: Các giá trị trung bình theo sau không cùng mẫu tự trong cùng một cột có sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức độ 0,05.  Nhận xét: 4.2.1 Ảnh hưởng của các loại môi trường đến số lá và chiều dài lá của lan Hồ Điệp trong nuôi cấy tái sinh chồi từ phôi soma Trong tất cả các môi trường, môi trường VW bổ sung thêm khoai tây và than hoạt tính có số lá trung bình ở mỗi chồi lan nhiều nhất (1,38). Bên cạnh đó, ở môi trường này thì chiều dài lá trung bình của chồi tái sinh cũng là dài nhất (8mm). Nghiệm thức số lá / chồi số rễ/chồi Chiều dài lá (mm) Chiều dài rễ (mm) MS 0,00 D 0,00 B 0,00 G 0,00 B MS+30g Khoai tây 1,00 C 0,00 B 0.5 0,00 B MS+30g Khoai tây+1g Than 1,00 C 0,00 B 1.00 F 0,00 B ½ MS+30g Khoai tây+1g Than 1,23 B 0,00 B 0,83 F 0,00 B VW 1,00 C 0,00 B 4,67 C 0,00 B VW+30g Khoai tây 1,23 B 0,24 A 5,00 B 3,67 A VW+30g Khoai tây+1g Than 1,38 A 0,22 B 8.00 A 4,00 A ½ VW+30g Khoai tây+1g Than 1,27 B 0,00 B 3,33 D 0,00 B CV(%) 3,4 27 25,6 41.2 62 Nhận xét tổng quát kết quả thí nghiệm ta thấy rằng khi nuôi cấy trên môi trường VW thì sẽ đạt được số lượng lá cao hơn và lá có độ dài hơn hẳn khi nuôi cấy trên môi trường MS. Biểu đồ 4.3 Số lá và chiều dài lá của lan Hồ Điệp trong nuôi cấy tái sinh chồi từ phôi soma 4.2.2 Ảnh hưởng của các loại môi trường đến số rễ và chiều dài rễ của lan Hồ Điệp trong nuôi cấy tái sinh chồi từ phôi soma. Sau 75 ngày nuôi cấy, ở các môi trường phần lớn xuất hiện chồi nhưng rễ chỉ xuất hiện khi nuôi cấy trên môi trường VW có bổ sung khoai tây và môi trường VW bổ sung khoai tây và than. Trong đó, ở môi trường VW bổ sung khoai tây thì số rễ xuất hiện nhiều hơn: 0,24 so với 0,22 (biểu đồ 3.4). Tuy nhiên chiều dài rễ trung bình khi nuôi cấy ở môi trường VW bổ sung khoai tây và than thì dài hơn chiều dài rễ trung bình khi nuôi cấy ở môi trường VW chỉ bổ sung khoai tây: 4 so với 3,67(biểu đồ 3.5). Qua đó thấy rằng khi nuôi cấy tái sinh Hồ Điệp từ phôi trên môi trường VW thì sự cảm ứng tạo rễ dễ xảy ra hơn là khi nuôi cấy trên môi trường MS. 63 Biểu đồ 4.4 Số rễ và chiều dài rễ của lan Hồ Điệp trong nuôi cấy tái sinh chồi từ phôi soma  Kết luận sơ bộ: Nghiệm thức đối chứng (MS và VW), phôi soma không có khuynh hướng tái sinh chồi mà chủ yếu là tăng sinh protocorm. Môi trường VW + 30g Khoai tây + 1g Than có hệ số nhân chồi cao nhất, đồng thời cũng là môi trường có các chỉ tiêu số lá, chiều dài lá, chiều dài rễ cao nhất và có chỉ tiêu số rễ cao thứ 2 trong các môi trường thí nghiệm. Kết quả thí nghiệm cũng cho thấy nuôi cấy tái sinh Hồ Điệp trên môi trường VW cho kết quả tốt hơn so với nuôi cấy trên môi trường MS. Trong đó môi trường VW bổ sung 30g Khoai tây và 1g Than là môi trường thích hợp nhất cho việc nuôi cấy tái sinh lan Hồ Điệp từ phôi soma. 64 MS MS+30g khoai tây MS+30g khoai tây+1g Than ½ MS+30g khoai tây+1g Than VW VW+30g Khoai tây VW+30g Khoai tây+1 g Than ½ VW+30g Khoai tây+1 g Than Hình 4.7 Chồi lan Hồ Điệp tái sinh từ phôi soma 75 NSC 65  Thí nghiệm tạo hạt nhân tạo Thí nghiệm 5 : Ảnh hưởng của môi trường tạo vỏ hạt đến sự tái sinh cây con từ hạt nhân tạo (60 NSC) Trong công nghệ tạo hạt nhân tạo, điều quan trọng nhất chính là việc chọn môi trường thích hợp để làm vỏ hạt. Môi trường đó phải cung cấp đủ chất dinh dưỡng cho phôi trong thời gian dài khi lưu trữ hạt cũng như giúp phôi phát triển nảy mầm thành cây con khi chúng ta cần hạt nẩy mầm. Bảng 4.9 Tỉ lệ nảy mầm của hạt nhân tạo Nghiệm thức Tỉ lệ nảy mầm (%) MS 44.44 D ½ MS 77.78 A 1/5MS 37.78 E VW 55.56 C ½ VW 71.11 B 1/5VW 37.78 E CV (%) 4.89  Ghi chú: Các giá trị trung bình theo sau không cùng mẫu tự trong cùng một cột có sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức độ 0,05.  Nhận xét: Kết quả thí nghiệm thấy môi trường 1/2MS là môi trường thích hợp nhất cho việc tạo vỏ hạt, tỉ lệ nảy mầm khi sử dụng môi trường này là 77.78%, rất có ý nghĩa về mặt thống kê so với các môi trường còn lại. Do đó, việc tạo hạt nhân tạo của phôi vô tính trên môi trường vỏ bao là ½ MS sẽ tiết kiệm chi phí hơn khi sử dụng môi trường MS hoặc VW mà vẫn giữ cho phôi khoẻ và hạt dễ nảy mầm hơn. 66 Hình 4.8 Hạt nhân tạo lan Hồ Điệp trên môi trường nảy mầm Hình 4.9 Quá trình nảy mầm của hạt nhân tạo lan Hồ Điệp. 0 NSC 30 NSC 40 NSC 50 NSC 60 NSC 70 NSC 67 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Qua quá trình nghiên cứu tìm hiểu kỹ thuật phát sinh phôi soma và tạo hạt nhân tạo ở cây lan Hồ Điệp, chúng tôi rút ra một số kết luận sau:  Nuôi cấy phát sinh mô sẹo từ protocorm trên môi trường VW có bổ sung 2,4-D 0.1mg/l + BA 0.01mg/l + nước dừa 200ml/l + đường 40g/l cho khả năng tạo mô sẹo cao nhất: 80% mẫu cấy hình thành mô sẹo (45NSC).  Môi trường thích hợp nhất cho việc tạo phôi là nuôi cấy mô sẹo trong môi trường VW bổ sung TDZ 2mg/l ở điều kiện lỏng lắc (45NSC), sau đó cấy chuyền sang môi trường đặc 1/2VW. Trung bình có 39.67 phôi/mẫu cấy (45NSC)  Môi trường thích hợp nhất cho việc tái sinh lan Hồ Điệp từ phôi là VW+30g khoai tây+1g than, với hệ số nhân chồi 11.34, số lá trung bình 1.38/chồi, số rễ trung bình 0.22/chồi, chiều dài lá trung bình 8mm, chiều dài rễ trung bình 4mm (75NSC)  Môi trường thích hợp nhất để làm vỏ bao hạt nhân tạo ở lan Hồ Điệp là môi trường 1/2MS, với tỉ lệ nảy mầm cao nhất: 77,78% (60NSC) 5.2 Đề nghị Cần tiếp tục hoàn thiện mô hình tạo phôi vô tính lan Hồ Điệp bằng một số phương pháp như:  Thử nghiệm nuôi cấy phát sinh mô sẹo từ mẫu lá hoặc thân lan Hồ Điệp ở các môi trường và nồng độ auxin, cytokinin khác nhau nhằm đạt khả năng tạo mô sẹo nhiều hơn trong thời gian ngắn hơn.  Thử nghiệm nuôi cấy mô sẹo trên các môi trường khác nhau với nồng độ TDZ khác nhau, hoặc bổ sung thêm NAA (như đã từng được thực hiện trên cây chuối, hoa lily…) để tìm ra môi trường cảm ứng tạo phôi hiệu quả hơn 68  Thử nghiệm tái sinh lan Hồ Điệp từ phôi trên các môi trường nuôi cấy khác bổ sung thêm các chất kích thích tố tăng trưởng như BA kết hợp với 2,4-D nhằm tạo ra nhiều cây con lan hơn, khoẻ mạnh hơn và trong thời gian ngắn hơn.  Thử nghiệm các môi trường tạo vỏ bao hạt nhân tạo khác để tìm ra môi trường tối ưu nhất.  Nghiên cứu, thử nghiệm các phương pháp bảo quản hạt nhân tạo như bảo quản hạt trong Nitơ lỏng nhằm phục vụ cho việc giữ giống.  Mở rộng công nghệ phát sinh phôi và tạo hạt nhân tạo đến các giống lan có giá trị kinh tế khác 69 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Bùi Trang Việt, 1989. Tìm hiểu và áp dụng các chất điều hòa sinh trưởng thực vật để kiểm soát hiện tượng rụng bông và trái non tiêu Piper nigrum L. Luận án Phó tiến sĩ Khoa học. Trường Đại học Tổng hợp TP. Hồ Chí Minh. 2. Klein R.M. và Klein D.T., 1974. Phương pháp nghiên cứu thực vật. Tập II (Nguyễn Như Thanh, Phạm Hồng Thái dịch). Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội. 3. Mai Trần Ngọc Tiếng, 1989. Giáo trình lý thuyết cơ sở sinh lý thực vật. Tủ sách Đại học Khoa học Tự nhiên TP. Hồ Chí Minh. 4. Nguyễn Văn Uyển, 1989. Các chất sinh trưởng trong nông nghiệp. Nhà xuất bản TP. Hồ Chí Minh. 5. Trần Văn Minh, 2003. Công nghệ tế bào thực vật. Giáo trình cao học – nghiên cứu sinh. Viện sinh học nhiệt đới. Trung tâm khoa học tự nhiên và công nghệ quốc gia. 6. Vũ Văn Vụ, Hoàng Đức Cự và csv, 1993. Sinh lý thực vật. Giáo trình cao học Nông nghiệp Sinh học. Viện KHKTNNMN Việt Nam. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội. TÀI LIỆU TIẾNG ANH 7. Broly H, 1982. Contribution a la multiplication clonale des Orchidées : Phalaenopsis, Paphiopedilum et Cymbidium. Thèse Docteur Ingenieur en Biologie et Physiologie végétale. Université de sciences et techniques de Lille. 8. Chatfield, J.M.; Amstrong, D.J., 1986. Regulation of cytokinin oxidase activity in callus tissue of Phaseolus vulgaris L. c.v great Northern. Plant Physiol. 80:493-499. 9. De Vries J.T, 1953. On the flowering of Phalaenopsis schilleranna. Rchb. Ann. Bogor. 1 : 61-76. 70 10. Fujimura T. and Komamine A., 1975. Effects of various growth regulators on the embryogenesis in carrot cell suspension culture. Plant Sci. Lett. 5:359-364. 11. Fujimura T. and Komamine A., 1979. Synchronization of somatic embryogenesis in carrot cell suspension culture. Plant Physiol. 64:162-164. 12. Gill, R.; Saxena, P.K., 1993. Somatic embryogenesis in Nicotiana tabacum L.: induction by TDZ of direct embryo differentiation from cultured leaf discs. Plant Cell Rep. 12:154-159. 13. Grossmann K, 1991. Induction of leaf abscission in cotton is a common effect of urea and adenin type cytokinins. Plant Physiol. 95:234-237. 14. Halle F, 1978. Les modèles architecturaux chez les arbres tropicaux, une approche graphique. Colloque Elaboration et Justification des modèles en Biologie. Paris, Ecole normale. 17pp. 15. Halle R, 1978. Recherches sur la nurtition minérale des tissus végétaux cultivés in vitro. Ann. Sci. Nat. Biol. Vég 14, 1-223. 16. Hare, P.D.; Staden, J., 1994. Inhibitory effect of TDZ on the activity of cytokinin oxidase isolated from soybean callus. Plant Cell Physiol. 35:1121-1125. 17. Hildebrandt, A.C; Wilmar, J.C.; Johns, H.; Riker, A.J., 1963. Growth of edible chlorophyllous plant tissue in vitro. Am.J.Bot. 50:248-254. 18. Li Z; Traore, A.; Maximova, S; Guiltinan M. J., 1998. Somatic embryogenesis and plant regeneration from floral explants of cacao (Theobroma cacao L.) using thidiazuron. In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant 34:293-299. 19. Halperin W. and Wetherell, 1964. Adventive embryony in tissue cultures of the wild carrot Daucus carota. Am. J. Bot. 51:274-283. 20. Lu, C., 1993. The use of thidiazuron in tissue culture. In vitro cell. Dev. Biol. 29:92-96. . KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Qua quá trình nghiên cứu tìm hiểu kỹ thuật phát sinh phôi soma và tạo hạt nhân tạo ở cây lan Hồ Điệp, chúng tôi rút ra một số kết luận sau:  Nuôi cấy phát. 4 .7 Chồi lan Hồ Điệp tái sinh từ phôi soma 75 NSC 65  Thí nghiệm tạo hạt nhân tạo Thí nghiệm 5 : Ảnh hưởng của môi trường tạo vỏ hạt đến sự tái sinh cây con từ hạt nhân tạo (60 NSC) Trong. 4.4 Số rễ và chiều dài rễ của lan Hồ Điệp trong nuôi cấy tái sinh chồi từ phôi soma  Kết luận sơ b : Nghiệm thức đối chứng (MS và VW), phôi soma không có khuynh hướng tái sinh chồi mà chủ