BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC * * * * * * * BIỆN TUẤN AN KHẢO SÁT HỆ VI KHUẨN Methylobacterium sp. TRÊN LÚA (Oryza sativa L.) Ở TÂY NINH LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC * * * * * KHẢO SÁT HỆ VI KHUẨN Methylobacterium sp. TRÊN LÚA (Oryza sativa L.) Ở TÂY NINH LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH:CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS.TS BÙI VĂN LỆ BIỆN TUẤN AN Th.S KIỀU PHƢƠNG NAM KHÓA: 2002 - 2006 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2006 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY * * * * * INVESTIGATING Methylobacterium sp. IN RICE (Oryza sativa L.) AT TAY NINH PROVINCE GRADUATION OF THESIS MAJOR: BIOTECHNOLOGY Professor: Student: Assoc.Prof.PhD. BUI VAN LE BIEN TUAN AN MSc. KIEU PHUONG NAM TERM: 2002 - 2006 HCMC, 8/2006 iv LỜI CẢM ƠN Em vô cùng biết ơn PGS. TS Bùi Văn Lệ, Th.S. Kiều Phương Nam, cùng toàn thể các thầy cô, các anh, chị, và các bạn cùng làm việc trong Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Đại học Quốc Gia thành phố Hồ Chí Minh đã tận tình chỉ dẫn và giúp đỡ em trong suốt khóa thực tập tốt nghiệp tại trường. Em xin chân thành cảm ơn sâu sắc đến Ban giám hiệu, cùng toàn thể giáo viên của trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh đã tận tình chỉ dẫn và dạy dỗ em trong suốt thời gian em học ở trường. Em vô cùng biết ơn các thầy cô của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại học Nông Lâm đã giúp đỡ em trong thời gian em học tại trường và trong khóa thực tập tốt nghiệp này. Cảm ơn các thành viên của lớp Công nghệ sinh học khóa 28 mến thương, đã cùng tôi chia sẽ những kỷ niệm buồn vui trong suốt thời gian học tập. Cảm ơn Bà Ngoại, cha mẹ và gia đình luôn ở bên con, luôn quan tâm đến con và nuôi con khôn lớn cho đến ngày hôm nay. Cảm ơn dì, dượng, cậu, mợ, đã động viên và giúp đỡ cho con. Cảm ơn toàn thể các thầy cô những người đã dạy dỗ con từ khi con vừa cắp sách đến trường. Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2006. Sinh viên thực hiện Biện Tuấn An v TÓM TẮT Trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh tháng 8 năm 2005, đề tài nghiên cứu: “Khảo sát hệ vi khuẩn Methylobacterium sp. trên lúa (Oryza sativa L.) ở Tây Ninh”. Đề tài do Biện Tuấn An thực hiện dưới sự hướng dẫn của: PGS.TS Bùi Văn Lệ Th.S Kiều Phương Nam Vi khuẩn thuộc chi Methylobacterium là vi khuẩn có sắc tố hồng dinh dưỡng methyl tuỳ ý (pink pigmented facultative methylotrophic – PPFM) có khả năng sử dụng nhiều hợp chất khác nhau từ một cacbon đến nhiều cacbon. Là vi khuẩn có tiềm năng ứng dụng trong nhiều lĩnh vự khác nhau vì chúng có khả năng sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp có lợi cho thực vật và con người. Mục đích của đề tài nhằm định danh các loài vi khuẩn Methylobacterium sp. trên lúa và khảo sát khả năng sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp của vi khuẩn. Được thực hiện qua các bước sau: - Phân lập và làm thuần các chủng vi khuẩn Methylobacterium sp. trên ruộng lúa. - Khảo sát các đặc điểm sinh lý sinh, sinh hóa của các chủng đã phân lập và làm thuần. - Định danh vi khuẩn đã khân lập bằng phương pháp PCR và giải trình tự vùng rDNA 16S nguyên vẹn của các chủng. - Khảo sát khă năng sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp của các chủng đã định danh. Các kết quả đạt được: - Thu thập, phân lập và làm thuần 26 dòng vi khuẩn khác nhau thuộc chi Methylobacterium. - Khảo sát được các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các chủng đã được làm thuần và phân bốn nhóm theo các đặc điểm sinh lý, sinh hóa. - Định danh được các chủng đã phân lập thuộc chi Methylobacterium bằng phương pháp PCR và giải trình tự. Qua đó, kết luận sơ bộ mối quan hệ của các chủng so với các loài đã công bố. vi - Khảo sát được khả năng sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp, trong đó có hai chủng có khả năng sinh tổng hợp auxin và bốn chủng có khả năng tích lũy PHB. Những kết quả trong nghiên cứu này đạt được nhờ sử dụng phối hợp phương pháp cổ điển và phương pháp hiện đại – là phương pháp phù hợp với những nghiên cứu vi sinh vật trong thời đại ngày nay. Kết quả của nghiên cứu này đã góp thúc đẩy những nghiên cứu về vi khuẩn Methylobacterium có lợi, để có thể ứng dụng tạo chế phẩm vi sinh dùng trong nông nghiệp, ứng dụng trong công nghệ nuôi cấy mô tế bào và trong các lĩnh vực khác. vii MỤC LỤC TRANG MỤC LỤC vi Danh mục các chữ viết tắt x Dang sách các bảng xi Dang sách các hình-sơ đồ xii Phần I: Phần mở đầu 1 1.1. Đặt vấn đề 1 1.2. Mục đích, yêu cầu 2 Phần II: Tổng quan tài liệu 3 2.1. Cây lúa 3 2.1.1. Nguồn gốc phân bố 3 2.1.2. Đặc điểm phân loại 4 2.1.2.1. Đặc điểm chung 4 2.1.2.2. Phân loại 5 2.2. Vi khuẩn 7 2.2.1. Lịch sử phát hiện và phân loại 7 2.2.2. Đặc điểm chung 12 2.2.2.1. Đặc điểm sinh thái và phân bố 12 2.2.2.2. Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa 13 2.3. Sự tương tác giữa thực vật và vi sinh vật 16 2.3.1. Sơ lược sự tương tác giữa vi sinh vật và thực vật 16 2.3.2. Sự tương tác giữa Methylobacterium với thực vật 17 2.3.3. Sự tạo các hợp chất thứ cấp bởi vi khuẩn Methylobacterium 19 2.3.4. Các ứng dụng khác của vi khuẩn Methylobacterium 21 2.4. Phương pháp định danh vi sinh vật 23 2.4.1. Định dang vi sinh vật bằng phương pháp truyền thống 23 2.4.2. Định danh vi sinh vật bằng kỹ thuật sinh học phân tử 24 2.4.2.1. Sơ lược kỹ thuật sinh học phân tử 24 2.4.2.2. Ứng dụng PCR và giải trình tự để định danh vi sinh vật 26 Phần III: Vật liệu và phương pháp 28 3.1. Vật liệu 28 viii 3.1.1. Mẫu thí nghiệm 28 3.1.2. Thiết bị, dụng cụ 28 3.1.3. Hóa chất 28 3.1.3.1. Môi trường phân lập và làm thuần 28 3.1.3.2. Môi trường giử giống vi khuẩn 29 3.1.3.3. Môi trường khảo sát khả năng sử dụng hợp chất cung cấp nguồn cacbon của vi khuẩn 29 3.1.3.4. Môi trường nhân sinh khối vi khuẩn 29 3.1.3.5. Bộ thử nghiệm sinh hóa định danh trực khuẩn gram âm IDS 14GNR 29 3.2. Phương pháp tiến hành thí nghiệm 30 3.2.1. Lấy mẫu 30 3.2.2. Tăng sinh vi khuẩn 31 3.2.3. Phân lập vi khuẩn 31 3.2.4. Làm thuần 31 3.2.5. Giữ giống 31 3.2.6. Khảo sát các đặc điểm sinh lý sinh hóa 31 3.2.6.1. Thử nghiệm gram và đo kích thước tế bào 32 3.2.6.2. Mối quan hệ với oxy 33 3.2.6.3. Khả năng di động 34 3.2.6.4. Thử nghiệm khả năng sử dụng nguồn cacbon của vi khuẩn 34 3.2.6.5. Các thử nghiệm trong bộ thử nghiệm IDS 14GNR 34 3.2.6.6. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và pH 37 3.2.6.7. Xác định đường cong tăng trưởng của vi khuẩn 38 3.3. Định danh vi khuẩn 38 3.3.1. Tính hệ số tương đồng di truyền 38 3.3.2. Ly trích DNA vi khuẩn 38 3.3.3. Tiến hành phản ứng PCR 39 3.3.3.1. Thành phần phản ứng PCR 39 3.3.3.2. Các primer sử dụng 39 3.3.3.3. Điện di và xem kết quả 41 3.3.4. Giải trình tự 41 ix 3.3.5. Xử lý kết quả giải trình tự 41 3.4. Khảo sát khả năng sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp 42 3.4.1. Định tính khả năng sinh tổng hợp auxin 42 3.4.2. Định tính khả năng sinh tổng hợp PHB 42 Phần IV: Kết quả và biện luận 44 4.1. Kết quả phân lập và làm thuần 44 4.2. Kết quả khảo sát các đặc điểm sinh lý, sinh hóa 46 4.2.1. Kết quả thử nghiệm gram và đo kích thước tế bào 46 4.2.2. Mối quan hệ với oxy 46 4.2.3. Khă năng di động 47 4.2.4. Khả năng sử dụng chất cung cấp nguồn cacbon 47 4.2.5. Bộ thử nghiệm IDS 14GNR 49 4.2.6. Kết quả thử nghiệm nhiệt độ và pH tối ưu cho sự phát triển của vi khuẩn 50 4.2.7. Đường cong tăng trưởng tế bào 52 4.3. Kết quả định danh vi khuẩn 55 4.3.1. Hệ số tương đồng di truyền 55 4.3.2. Kết quả PCR 56 4.3.2.1. Kết quả định tính vi khuẩn chi Methylobacterium 56 4.3.2.2. Kết quả khuếch đại trình tự 16S rDNA nguyên vẹn 57 4.3.3. Kết quả giải trình tự và so sánh độ tương đồng của các chủng với các loài đã công bố 58 4.4. Khảo sát khả năng sinh tổng hợp một số hợp chất thứ cấp 61 4.4.1. Định tính auxin 61 4.4.2. Định tính PHB 61 Phần V: Kết luận và đề nghị 62 5.1. Kết luận 62 5.2. Đề nghị 62 Tài liệu tham khảo 63 Phụ luc 76 x DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT CMS: môi trường MS bổ sung caseine hydrolase CP: môi trường cao thịt-peptone ctv: cộng tác viên DC: đối chứng DMHF: 2,5-dimethyl-4-hydroxy-2Hfuran-3-one IAA: indole-3-acetic acid MMS:môi trường methanol mineral salts NCBI: National Center for Biotechnology Imformation OD: optical density PCR: polymerase chain reaction PHB: poly- -hydroxybutyrate PPFM: pink pigmented facultative methylotrophic rDNA: trình tự DNA mã hóa cho rRNA RNA: ribonucleotide rRNA: RNA ribosome tRNA: RNA vận chuyển UV: ultraviolet Zeatin: 4-hydroxy-3-methyl-trans-2-butenylaminopurine [...]... môn Công nghệ 2 Sinh học nên chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu: Khảo sát hệ vi khuẩn Methylobacterium sp trên lúa (Oryza sativa L.) ở Tây Ninh với sự hướng dẫn của PGS.TS Bùi Văn Lệ và ThS Kiều Phương Nam 1. 2 Mục đích và yêu cầu Mục đích: Định danh và khảo sát một vài đặc điểm của vi khuẩn Methylobacterium sp trên ruộng lúa Yêu cầu: Phân lập, làm thuần và định danh các chủng vi khẩn Methylobacterium. .. sự tăng trưởng của vi khuẩn 50 Hình 4. 6: Ảnh hưởng của pH đến sự tăng trưởng của vi khuẩn 51 Hình 4. 7: Đường cong tăng trưởng của vi khuẩn 52 Hình 4. 8: Kết quả điện di trên gel sản phẩm PCR với cặp mồi 2F và 2R 57 Hình 4. 9: Kết quả điện di trên gel sản phẩm PCR với cặp mồi FPGS6 với 2R Và FPGS1509 với 2F 58 Hình 4 .1 0: Cây phát sinh loài 60 Hình 4 .1 1: Kết quả định... (Citrus) Vi khuẩn Methylobacterium còn hiện diện trên hạt Vi khuẩn PPFMs định cư trên bề mặt lá ở dạng kết hợp lại và trong giữa các tế bào biểu bì Omer và ctv (2004) Sự định cư của vi khuẩn Methylobacterium trên rễ cũng đã được ghi nhận trên nhiều loài thực vật khác nhau [9], [13 ], [14 ], [47], [59], [60], [72], [76], [89] Vi khuẩn Methylobacterium là những vi khuẩn hiếu khí bắt buộc Do vậy, vi khuẩn. .. Hood: Three new Methylobacterium species: M rhodesianum sp nov., M zatmanii sp nov., and M fujisawaense sp nov Int J Syst Bacteriol., 19 88, 38, 12 4 -12 7 Vị trí phân loại chi Methylobacterium trong giới vi sinh vật như sau [ 41 ]: Giới: Bacteria Ngành: Proteobacterium Lớp: Alphaproteobacteria B : Rhizobiales H : Methylobacteriaceae 2.2.2 Đặc điểm chung 2.2.2 .1 Đặc điểm sinh thái và phân bố Vi khuẩn Methylobacterium. .. 54, 11 911 196 17 M radiotolerans Green And Bousfield: Emendation of Methylobacterium Patt, Cole, and Hanson 19 76; Methylobacterium rhodinum (Heumann 19 62) comb nov corrig.; Methylobacterium radiotolerans (Ito and Iizuka 19 71) comb nov., corrig.; and Methylobacterium mesophilicum (Austin and Goodfellow 19 79) comb nov Int J Syst Bacteriol., 19 83, 33, 875-877 18 M rhodesianum Green, Bousfield And Hood: Three... lúa 5 Hình 2. 2: Hình dạng khuẩn lạc trên cỏ ba lá và tế bào vi khuẩn Methylobacterium dưới kính hiển vi điện tử 13 Hình 2. 3: sự gắn kết giữa chu trình serine và chu trình PHB trong quá trình biến dưỡng 15 Hình 2. 4: Sự nhiễm của Methylobacterium sp ở cây dương nuôi cấy mô 22 Hình 3. 1: Vị trí bắt cặp của các mồi trên vùng 16 S rDNA 40 Hình 3. 2: Chu trình nhiệt cho phản... xử lý Methylobacterium bằng cách trộn với hạt và phun trên lá, kết quả làm gia tăng sự đẻ nhánh của cây lúa, gia tăng năng suất lúa từ 22 ,1 – 24 ,1% Ngoài ra, cũng theo báo cáo này thì các chủng Methylobacterium sp còn có vai trò giảm tỷ lệ cây bệnh từ 17 ,8 – 23,7% Từ những cơ sở đó, để có thể hiểu rõ hơn về các chủng vi khuẩn Methylobacterium trên cây lúa và mối quan hệ của vi khuẩn này với cây lúa Được... hiện ở pha cuối của quá trình tăng trưởng Vi khuẩn Methylobacterium thường ở dạng tế bào đơn hay kết đôi lại theo dạng hoa hồng [34],[86] Hầu hết các chủng Methylobacterium sp đều có khả năng di động nhờ một tiêm mao ở cực hay gần cực Tuy nhiên, vài loài thì không Đa số các loài vi khuẩn Methylobacterium sp là vi khuẩn gram âm, một số có gram biến đổi Vi khuẩn Methylobacterium thường tăng sinh chậm, khuẩn. .. And Hood: Three new Methylobacterium species: M rhodesianum sp nov., M zatmanii sp nov., and M fujisawaense sp nov Int J Syst Bacteriol., 19 88, 38, 12 4 -12 7 19 M rhodinum Green And Bousfield: Emendation of Methylobacterium Patt, Cole, and Hanson 19 76; Methylobacterium rhodinum (Heumann 19 62) comb nov corrig.; Methylobacterium radiotolerans (Ito and Iizuka 19 71) comb nov., corrig.; and Methylobacterium. .. 2. 1: Kiểu gen và phân bố của một số loài trong chi Oryza 6 Bảng 2. 2: Các loài trong chi Methylobacterium được đặt tên 8 Bảng 2. 3: Đặc điểm sử dụng các nguồn cacbon các loài trong chi Methylobacterium 24 Bảng 3. 1: Hướng dẫn đọc kết quả bộ thử nghiệm sinh hóa IDS 14 GNR 36 Bảng 4. 1: Danh sách các khuẩn lạc được phân lập và làm thuần 44 Bảng 4. 2: Khả năng sử dụng nguồn cacbon của vi khuẩn . HỆ VI KHUẨN Methylobacterium sp. TRÊN L A (Oryza sativa L. ) Ở TÂY NINH LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH:CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giáo vi n hƣớng dẫn: Sinh vi n thực hiện: PGS.TS BÙI VĂN. NÔNG L M TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC * * * * * * * BIỆN TUẤN AN KHẢO SÁT HỆ VI KHUẨN Methylobacterium sp. TRÊN L A (Oryza sativa L. ) Ở TÂY NINH LUẬN VĂN. vi khuẩn Methylobacterium sp. trên l a (Oryza sativa L. ) ở Tây Ninh với sự hướng dẫn của PGS.TS Bùi Văn L và ThS. Kiều Phương Nam. 1. 2. Mục đích và yêu cầu Mục đích: Định danh và khảo sát