BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA QUẦN THỂ NẤM Corynespora cassiicola (Berk & Curt) Wei GÂY BỆNH TRÊN CÂY CAO SU (Hevea brasiliensis Muell Arg.) TẠI TRẠI THỰC NGHIỆM LAI KHÊ, VIỆN NGHIÊN CỨU CAO SU VIỆT NAM BẰNG KỸ THUẬT RAPD Nghành học: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2002-2006 Sinh viên thực hiện: LÊ VĂN HUY Thành phố Hồ Chí Minh -2006- BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA QUẦN THỂ NẤM Corynespora cassiicola (Berk & Curt) Wei GÂY BỆNH TRÊN CÂY CAO SU (Hevea brasiliensis Muell Arg.) TẠI TRẠI THỰC NGHIỆM LAI KHÊ, VIỆN NGHIÊN CỨU CAO SU VIỆT NAM BẰNG KỸ THUẬT RAPD GVHD: Sinh viên thực hiện: PGS.TS BÙI CÁCH TUYẾN LÊ VĂN HUY ThS PHAN THÀNH DŨNG Thành phố Hồ Chí Minh - 2006 LỜI CẢM TẠ  Con xin thành kính ghi ơn Cha Mẹ sinh thành, dưỡng dục nên người Con xin cảm ơn gia đình ln chỗ dựa vững cho bước qua khó khăn  Tơi xin chân thành cảm ơn: Ban Giám Hiệu trường Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh, Ban Chủ Nhiệm Bộ Mơn Cơng Nghệ Sinh Học, tất quý Thầy - Cô truyền đạt kiến thức quý báu cho suốt thời gian học trường PGS.TS Bùi Cách Tuyến ThS Phan Thành Dũng tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tơi hồn thành khóa luận Ban giám đốc Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam tạo điều kiện thuận lợi cho tơi thực tập hồn thành tốt khóa luận tốt nghiệp TS Bùi Minh Trí có dẫn, động viên giúp tơi thực tốt khóa luận KS Vũ Thị Quỳnh Chi cô chú, anh chị cán công nhân viên Bộ Môn Bảo Vệ Thực Vật - Viện Nghiên Cứu Cao Su nhiệt tình giúp đỡ hướng dẫn suốt thời gian thực tập Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam Các anh chị trực thuộc Trung Tâm Phân Tích – Thí Nghiệm Hóa Sinh Trường Đại Học Nơng Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh hướng dẫn chia sẻ khó khăn thời gian thực khóa luận Các bạn bè thân yêu lớp Công Nghệ Sinh Học 28 giúp đỡ chia sẻ vui buồn suốt năm học thời gian thực tập tốt nghiệp Thành Phố Hồ Chí Minh, ngày 15 tháng năm 2006 Lê Văn Huy iii TÓM TẮT LÊ VĂN HUY, Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh Tháng 8/2006 “ Nghiên cứu đa dạng di truyền quần thể nấm C.cassiicola(Burt &Curt) Wei gây bệnh cho cao su trại thực nghiệm cao su Lai Khê, Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam kỹ thuật RAPD” Bệnh rụng Corynespora gây nấm C cassiicola xem bệnh nguy hiểm cho vùng trồng cao su giới Ở Việt Nam, bệnh xuất lần đầu vào tháng năm 1999 trại thực nghiệm cao su Lai Khê, Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam Hiện bệnh giai đoạn tích lũy bùng phát tương lai Sự quan tâm xác định đa dạng di truyền nguồn bệnh Do 11 nguồn nấm gây bệnh cho dịng vơ tính cao su khác phân lập, tách đơn bào tử, nhân sinh khối, ly trích DNA Kỹ thuật RAPD sử dụng primer (OPL-08, OPM-O5,OPD - 18) áp dụng để phát đa dạng di truyền 11nguồn nấm Phân tích liệu RAPD 11 nguồn nấm chia nguồn nấm thành hai nhóm lớn Cây phả hệ (dendrogram) có hệ số đồng dạng di truyền từ 0,43 – 0,94 Điều cho thấy có đa dạng di truyền nguồn nấm nghiên cứu Tuy nhiên, khác biệt hình thái dường khơng liên quan đến nhóm RAPD nghiên cứu Thông tin thu từ nghiên cứu giúp hiểu biết sâu bùng phát nguồn bệnh, tiên đoán phát triển nguồn bệnh phát triển chiến lược lai giống tạo dịng vơ tính kháng bệnh cách hiệu Kết kỹ thuật RAPD mở rộng để đánh giá đa dạng di truyền nấm Corynespora cassiicola Việt Nam iv SUMMARY LE VAN HUY, Nong Lam University, Ho Chi Minh City August, 2006 “Studying genetic variation of Corynespora cassiicola population, destructive fungal pathogen of Hevea brasiliensis Muell Arg in Lai Khe rubber experimental station of Rubber Research Institute of Vietnam (RRIV), was carried out by using RAPD technique.” Corynespora leaf fall disease caused by C cassiicola was considered as one of the most harmful leaf diseases in Hevea brasiliensis Muell Arg In Vietnam, the disease was first detected in August, 1999 in Lai Khe rubber experimental station of Rubber Research Institute of Vietnam (RRIV) At present, the disease is spreading and can develope into epidemics in future A special attention has been made to determine the extent of genetic variation of the pathogen Therefore, 11 isolates collected from various clones of Hevea brasiliensis Muell Arg were purified to single spore Fungal isolates were inoculated in broth culture and total DNA extracted Three RAPD markers (OPL-08, OPM-O5 and OPD-18) were used to investigate the genetic diversity of these isolates Cluster analysis of 35 amplified DNA fragments (RAPD data) showed that 11 isolates could be placed into two groups Genetic similarity of these analyzed iolates was a range from 0.43 to 0.94 The result indicated that there is a significant genetic variation among these isolates It seems that morphological differences did not associate with molecular characters This preliminary study would be useful for a better under standing of disease outbreaks, predicting future disease development and developing effective strategy in breeding for disease resistant clones It is indicated that RAPD will be extended to assess intra-specific variation in C cassiicola isolates from rubber trees in Vietnam v MỤC LỤC PHẦN TRANG Trang tựa Lời cảm tạ iii Tóm tắt iv Summary v Mục lục vi Danh sách chữ viết tắt ix Danh sách hình x Danh sách bảng xi PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích 1.3 Yêu cầu 1.4 Nội dung công việc PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược cao su Hevea brasiliensis Muell Arg 2.1.1 Phân loại học 2.1.2 Nguồn gốc 2.1.3 Đặc điểm thực vật học 2.1.4 Vai trị tình hình sản xuất 2.1.5 Sâu bệnh 2.2 Đặc tính sinh học nấm C cassiicola cao su 2.2.1 Phân loại học 2.2.2 Giới thiệu khuẩn ty, khuẩn lạc, bào tử 2.2.3 Phổ kí chủ, xâm nhâm, lan truyền nấm C cassiicola 2.2.4 Điều kiện nuôi cấy 2.3 Bệnh rụng Corynespora cao su Hevea brasiliensis Muell Arg vi 2.3.1 Nguyên nhân, triệu chứng, hậu cách phòng trị bệnh rụng Corynespora 2.3.2 Yếu tố phát sinh bệnh cao su hình thành nòi nấm C cassiicola 10 2.4 Giới thiệu thơng tin di truyền, tính đa dạng di truyền thị 11 2.4.1 Thông tin di truyền 11 2.4.2 Tính đa dạng di truyền 12 2.4.3 Chỉ thị 12 2.5 Kỹ Thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms) 13 2.6 Kỹ thuật PCR 14 2.6.1 Giới thiệu kỹ thuật PCR 14 2.6.2 Các bước quy trình chuẩn PCR 14 2.6.3 Thành phần phản ứng PCR yếu tố ảnh hưởng 15 2.7 Kỹ thuật SSCP (Single – Strand Conformation Polymorphism) 19 2.8 Kỹ thuật STS (Sequence – Target Sites) 20 2.9 Kỹ thuật Microsatellites (SSR – Simple Sequences Repeat) 20 2.10 Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) 20 2.10.1 Giới thiệu kỹ thuật RAPD 20 2.10.2 Một số vấn đề thực tế thực phản ứng RAPD thường gặp phải 22 2.10.3 Những ưu điểm kỹ thuật RAPD 22 2.10.4 Những hạn chế kỹ thuật RAPD 23 2.10.5 Ứng dụng kỹ thuật RAPD 23 2.10.6 Sự cách tân kỹ thuật RAPD 24 2.11 Kỹ thuật AFLP 24 2.12 Nghiên cứu nước 25 2.12.1 Những nghiên cứu C cassiicola nước 25 2.12.2 Những nghiên cứu C cassiicola nước 28 PHẦN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 3.1 Thời gian địa điểm tiến hành 29 3.1.1 Giai đoạn 29 3.1.2 Giai đoạn 29 3.2 Đối tượng nghiên cứu 29 3.3 Nội dung phương pháp 29 3.3.1 Phương pháp lấy mẫu 29 vii 3.3.2 Phân lập 30 3.3.3 Nhân sinh khối 32 3.3.4 Tách chiết DNA 33 3.3.5 Thực phản ứng RAPD 35 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43 4.1 Kết lấy mẫu, phân lập nhân sinh khối 43 4.1.1 Kết lấy mẫu, phân lập 43 4.1.2 Kết nhân sinh khối 47 4.2 Kết ly trích 48 4.3 Thiết lập qui trình RAPD đánh giá độ đa dạng di truyền chủng nấm C cassiicola phân lập từ vườn tuyển non Lai Khê thuộc Bộ Môn Giống –trại thực ngiệm Lai Khê– VNCCSVN (Bình Dương) 51 4.3.1 Thí nghiệm 1: khảo sát qui trình RAPD Silva cộng sự, 2003 51 4.3.2 Thí nghiệm 2: khảo sát ảnh hưởng yếu tố chu kỳ đến phản ứng RAPD 53 4.3.3 Thí nghiệm Khảo sát ảnh hưởng yếu tố MgCl2, dNTP, primer, DNA, Taq polymerase (Promega) lên phản ứng RAPD 54 4.3.4 Đánh giá độ đa dạng di truyền chủng nấm C cassiicola phân lập từ vườn tuyển non Lai Khê thuộc Bộ Môn Giống trại thực nghiệm Lai Khê – VNCCSVN (Bình Dương) 55 4.3.5 Phân tích kết phản ứng RAPD phần mềm NTSYS 59 PHẦN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 63 5.1 Kết luận 63 5.2 Đề nghị 63 5.3 Hạn chế đề tài 64 PHẦN TÀI LIỆU THAM KHẢO 65 PHỤ LỤC 65 viii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT PCR: Polymerase Chain Reaction PDA: Potato Dextrose Agar PSA: Potato Saccharose Agar EtBr: Ethidium Bromide TE: Tris EDTA TAE: Tris Glacial Acetic Acid EDTA RFLP: Restriction Fragments Length Polymorphism ITS: Internal Transcribed Spacer RAPD: Random Amplified Polymorphism DNA Bp: base pairs rRNA: ribosomal RNA dvt : Dịng vơ tính BVTV: bảo vệ thực vật VNCCSCN: Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam KTCB : Kiến Thiết Căn Bản ix DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1 Một đợt dịch bệnh C cassiicola gây cao su Việt Nam Hình 2.2 Sơ đồ bước phản ứng chuỗi polymerase 15 Hình 2.3 Sự bắt cặp khuếch đại phản ứng RAPD – PCR 20 Hình 4.1 Triệu chứng đặc trưng bệnh rụng Corynespora 44 Hình 4.2 Triệu chứng biến thiên bệnh rụng Corynespora 44 Hình 4.3 Triệu chứng bệnh héo đen đầu 45 Hình 4.4 Bào tử nấm C cassiicola 45 Hình 4.5 Khuẩn lạc nấm C cassiicola 46 Hình 4.6 Màu sắc sợi nấm môi trường lỏng 47 Hình 4.4 Kết li trích DNA tổng số theo qui trình Lee Taylor 48 Hình 4.8 DNA tổng số 11 nguồn nấm li trích theo qui trình 50 Hình 4.9 Các mẫu DNA sau tiến hành pha loãng 51 Hình 4.10 Kết PCR thí nghiệm 1, primer OPM-O5, nguồn nấm 4, 5, 52 Hình 4.11 Sản phẩm PCR thí nghiệm thực với primer 53 Hình 4.12 Kết điện di sản phẩm RAPD thí nghiệm 54 Hình 4.13 Kết điện di sản phẩm RAPD 11 nguồn nấm C cassiicola Hình 4.14 Phát băng chức detect băng 58 Hình 4.15 Kết đánh giá đa dạng di truyền dạng số liệu NTSYS 60 Hình 4.16 Cây phả hệ (dendrogram) 11 nguồn nấm C cassiicola 61 x PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sơ lƣợc cao su Hevea brasiliensis Muell Arg 2.1.1 Phân loại học Cây cao su giới thuộc vào năm họ thực vật sau: Euphorbiaceae, Moraceae, Apocynaceae, Aslepiadaceae, Compositae Trong họ lại có nhiều giống, giống có nhiều loại Nhưng cao su thuộc loại Hevea brasiliensis (giống Hevea, họ Euphorbiaceae) chọn để canh tác đại qui mơ (Nguyễn Hữu Trí, 2004) 2.1.2 Nguồn gốc Cây cao su có nguồn gốc từ vùng rừng nhiệt đới, lưu vực sông Amazone Nam Mĩ Được du nhập vào Việt Nam năm 1897 Đến đầu kỷ 20 trồng thành đồn điền Đông Nam Bộ Đầu thập niên 50 số diện tích cao su định hình Tây Nguyên miền Trung 2.1.3 Đặc điểm thực vật học Cây cao su (cây tạo mủ) thuộc loại thân gỗ, to, cao Ở lâu năm cao từ 20 đến 30 mét Cấu tạo thân cao su có phần quan trọng vỏ thân, phận sản sinh nhựa mủ định đến suất sản lượng mủ Lá cao su mọc cách, có ba chét nhỏ cuống dài, có hình bầu dục, nhọn, mặt nhẵn gân song song Đối với cao su có vai trò quan trọng, ảnh hưởng trực tiếp đến sản lượng mủ Về phương diện sinh thái cao su phát triển tốt vùng xích đạo Địi hỏi nhiệt độ trung bình 250C, lượng mưa 1500 ml năm, chịu đựơc hạn nhiều tháng, địi hỏi chất lượng đất, nước ta cao su trồng từ Bắc đến Nam (Nguyễn Hữu Trí, 2004) 2.1.4 Vai trị tình hình sản xuất Cây cao su loại công nghiệp dài ngày, cung cấp mủ gỗ cho nhiều ngành công nghiệp Đây loại có giá trị kinh tế cao lĩnh vực nông – lâm – công nghiệp Trong năm gần đây, sản lượng mủ không ngừng nâng cao nhờ cải tiến giống, kỹ thuật nơng nghiệp, quy trình khai thác.v.v Đến năm 2004 tổng diện tích cao su nước đạt 454.000 Sản lượng 402.700 tấn, suất 1370 kg/ha/năm Năm 2005 toàn ngành cao su xuất 587.000 đạt kim ngạch xuất 804 triệu USD, nông sản đứng thứ kim ngạch xuất sau lúa Nếu tính đồ gỗ tổng kim ngạch xuất toàn ngành cao su Việt Nam năm 2005 ước lượng tỉ USD Hơn nghiên cứu gần ảnh hưởng vườn cao su với môi trường nêu lên khả đóng góp sinh khối dưỡng chất cao su sau chu kỳ trồng, khai thác tương đương với rừng nhiệt đới vùng nhiệt đớí ẩm, giúp cho đất trồng cao su cải thiện lý hóa tính (Trần Thị Thúy Hoa, 2006) Trong tương lai nghị định thư Kyoto thơng qua việc bán hạn ngạch khí thải mang lại cho người trồng cao su thêm khoản thu nhập đáng kể (Trần Văn Cảnh, 2006) 2.1.5 Sâu bệnh Cùng với phát triển mạnh cao su thiệt hại bệnh gây gia tăng đáng kể Một phần việc chọn lọc theo hướng sản lượng cao, sinh trưởng nhanh làm thất gen kháng bệnh Mặt khác, tình hình thời tiết – khí hậu có nhiều thay đổi diễn biến phức tạp Hơn việc phát triển chuyên canh trồng diện rộng vùng khí hậu nóng ẩm, mưa nhiều dẫn đến phát sinh – phát triển mạnh chủng loại mức độ bệnh, gây ảnh hưởng không nhỏ đến vấn đề canh tác hiệu kinh tế nó, thiệt hại sản lượng gia tăng chi phí sản xuất Hiện nay, cao su phát triển mạnh dạng tiểu điền, nên thiệt hại bệnh gây ảnh hưởng trực tiếp đến đời sống người trồng cao su Theo Chee (1976), cao su bị 550 lồi sinh vật cơng, có 24 lồi có tầm quan trọng kinh tế Theo Nguyễn Hải Đường (1997), có 24 loại bệnh gây hại cao su Việt Nam Đến năm 2003, Phan Thành Dũng ctv cho biết có loại bệnh cao su gây ảnh hưởng trực tiếp đến sinh trưởng sản lượng cao su nước, có loại bệnh lá, bệnh thân cành, bệnh mặt cạo bệnh rễ Đáng kể loại trên, bệnh rụng Corynespora bệnh xuất năm 1999 có chiều hướng mở rộng phạm vi gây hại cho dvt cao su 2.2 Đặc tính sinh học nấm C cassiicola cao su Tương tự nấm C cassiicola kí chủ khác Nấm C cassiicola cao su có đặc điểm sinh học sau 2.2.1 Phân loại học Bệnh ghi nhận xuất lần cao thực sinh Sierra Leone (Châu Phi) năm 1949 Năm 1954 Wei tổng hợp đặt tên Corynespora cassiicola (Berk.&Curt.) Wei Theo nghiên cứu phân loại gần (Kirk, Paul M, 2004) nấm C cassiicola phân loại sau: Giới nấm (Fungi) Ngành (Phylum): Ascomycota Lớp (Class): Ascomycetes Bộ (Order): Pleosporales Họ (Family): Corynesporascaceae Giống (Genus): Corynespora (Nguồn:http://www.SpeciesFungorum.org/) 2.2.2 Giới thiệu khuẩn ty, khuẩn lạc, bào tử Khuẩn ty nấm có màu xám đến nâu Có thể tồn điều kiện khơ hạn đến tháng mà giữ độc tính gây bệnh (Soe Kirman, 1987) Về khuẩn lạc biến thiên lớn tốc độ sinh trưởng, hình thái, độ dày, độ mịn, màu sắc khuẩn lạc cho dù phân lập từ bào tử (RRIM, 1986 ; Dũng, 1995) Trong số trường hợp màu sắc sợi nấm, khuẩn lạc thay đổi theo tuổi môi trường nuôi cấy (Darussamin A Pawirosoemardjo S., 1996) Trên mơi trường PDA, PSA khuẩn lạc có màu xám đến nâu (Liyanage Jayasinghe, 1987) Về hình thái hình thành bào tử phát triển nấm biến thiên rộng kí chủ sống mơi trường nhân tạo Bào tử có màu nâu nhạt với dạng hình lưỡi liềm chứa nhiều vết ngăn với chiều dài biến thiên, đạt 700 m Bào tử dạng đơn, đơi dạng chuỗi dính với hai đầu gọi hilum Bào tử phát tán nhờ gió hạt mưa, phóng thích vào ban ngày (Liyanage Jacob, 1992) Việt Nam cao điểm từ – 11 sáng (Phan Thành Dũng,2004) Sau thời gian mưa nhiều nắng ráo, số lượng bào tử phóng thích nhiều nấm cần ẩm độ cao để hình thành bào tử Dưới điều kiện tối ưu: phạm vi nhiệt độ từ 25 – 30oC, ẩm độ 100% bào tử nảy mầm (Liyanage Jayasinghe, 1988) phát triển ống mầm vị trí nằm hai vách, phổ biến hai đầu bào tử Sau bào tử nảy mầm chúng xâm nhập vào vị trí vách ngăn tế bào dậu, sau khuẩn ty phân nhánh xâm nhiễm vào tế bào hình thành bào tử 96 sau Tuy nhiên bào tử có khả tồn vết bệnh đất với thời gian kéo dài, cao su khô nấm tồn giữ nguyên khả gây bệnh đến năm (Chee, 1988) Trên vết bệnh, số lượng bào tử có lên đến 1.200 bào tử/cm2 Nấm C cassiicola hình bào tử mơi trường nhân tạo, số lượng bào tử thay đổi tùy dvt Có dvt sản xuất 100.000 bào tử đĩa petri chủng khác lại không tạo bào tử (Liyanage,A.deS.,Jayasinghe, 1986) Nếu dùng biện pháp kích thích như: chiếu sáng tia cực tím thời gian ngắn hay liên tục ánh sáng huỳnh quang.v.v làm tăng số lượng bào tử Tuy nhiên đa dạng đặc điểm hình thái dường khơng liên quan đến độc tính bệnh (Shamsul Samsuri, 1996; Darussamin A Pawirosoemardjo S., 1996) 2.2.3 Phổ kí chủ, xâm nhâm, lan truyền nấm C cassiicola Nấm C cassiicola có phổ kí chủ rộng có khoảng 160 lồi ký chủ thuộc nhóm ăn quả, cơng nghiệp, lâm nghiệp, ngũ cốc, rau màu nhiều loại cảnh khác Những nghiên cứu Malaysia (Phan Thành Dũng, 1995), Indonesia (Sinulingga cộng sự, 1990) cho thấy nấm C cassiicola cao su ký sinh chuyên biệt Tuy nhiên Srilanka lại có khả gây bệnh đu đủ Mikania scandens (Lianage & jacob, 1992) Nấm xâm nhập chủ yếu mặt qua lớp biểu bì khí khổng, ngồi cịn tiết enzyme cellulase giúp phân huỷ màng tế bào Trong suốt trình sinh trưởng, nấm cịn tiết độc tố CC toxin (là cassiicoline chứa amino acid) gây độc cho cao su, với lượng nhỏ gân đủ gây rụng (Chee, 1988; Dũng, 1995) Theo Onesirosan (1974) loại độc tính chun biệt có tác động đến tượng chết mơ lá, vỏ kích thích hình thành tầng rời hậu gây rụng lá, vết bệnh nhỏ cuống gây rụng chết dù khơng có triệu chứng tán Nấm có khả tồn phát triển phạm vi nhiệt độ lớn từ 16 – 36 oC, thích hợp 28 oC ẩm độ bảo hòa (Chee, 1988; Jayashinghe, 2000) Mầm bệnh lan truyền chủ yếu nhờ gió mưa 2.2.4 Điều kiện ni cấy Nấm ni cấy nhiều mơi trường khác nhau, với pH thay đổi tùy môi trường: PDA (potato dextrose agar, pH 6,8-7), PSA (Potato Sucrose Agar, pH 6,8 – 7,0): Rose Ben Agar(pH : 5,5); Czapek Dox Agar (pH : 6,8 -7,2); Core Meal Agar (pH 6,8- 7,0) Richard’s medium (pH:5,4) Nhưng PSA hay dịch chiết cao su + dextrose +agar hai mơi trường thích hợp cho hình thành bào tử (Liyanage cộng sự, 1986; Chee,1988) Tuy nhiên theo Jayasinghe, 1988 mơi trường PDA mơi trường tối ưu cho hình thành bào tử phát triển nấm Nhiệt độ 28 oC ẩm độ bảo hịa thích hợp cho phân lập phát triển nấm (Chee, 1987 & 1988; Jayashinghe, 2000) Bệnh rụng Corynespora cao su Hevea brasiliensis Muell 2.3 Arg 2.3.1 Nguyên nhân, triệu chứng, hậu cách phòng trị bệnh rụng Corynespora 2.3.1.1 Nguyên nhân Cũng nhiều loại trồng khác cao su bị nhiễm nhiều loại bệnh Trong đáng kể bệnh rụng Corynespora gây hại nặng từ thập niên 90 đến Bệnh nấm Corynespora cassiicola (Burt &Curt) Wei gây nên 2.3.1.2 Triệu chứng Bệnh xuất lá, cuống chồi với triệu chứng biểu khác Trên lá: Vết bệnh màu đen với hình dạng xương cá dọc theo gân lá, vết bệnh lan rộng điều kiện thuận lợi, gây chết phần, sau đổi màu vàng cam rụng Trên non vết bệnh hình trịn màu xám đến nâu với vịng màu vàng xung quanh, có hình thành lỗ Lá quăn biến dạng, sau rụng tồn Trên chồi cuống lá: Các chồi xanh dễ nhiễm bệnh, nấm bệnh gây hại chồi hóa nâu Dấu hiệu với vết nứt dọc theo cuống chồi có dạng hình thoi, có mủ rỉ sau hóa đen, vết bệnh phát triển dài đến 20 cm gây chết chồi, chết Nếu dùng dao cắt bỏ lớp vỏ xuất sọc đen ăn sâu gỗ, chạy dọc theo vết bệnh Trên cuống với vết nứt màu đen có chiều dài 0,5 – 3,0 mm Nếu cuống bị hại, toàn chét bị rụng cịn xanh khơng có triệu chứng xuất phiến 2.3.1.3 Hậu cách phòng trị Hậu Mức nguy hại bệnh tùy thuộc vào mức độ kháng dvt, giai đoạn tuổi Tùy theo tương thích kí sinh, kí chủ mơi trường Bệnh gây hại quanh năm vào giai đoạn sinh trưởng cao su Ở chưa trưởng thành bệnh xuất quanh năm gây rụng lá, làm chậm phát triển, cuối gây chết Ở cao su trưởng thành, nhạy cảm bệnh làm giảm 20 – 25 % giá trị kinh tế Chiến lược kiểm soát bệnh tập trung lai tạo sử dụng dvt kháng bệnh (P romruensukharom cộng sự, 2005) Hình 2.1 Một đợt dịch bệnh C cassiicola gây cao su Việt Nam (Nguồn: Bộ Mơn BVTV/VNCCSVN) Cách phịng trị Khơng trồng dvt mẫn cảm với bệnh Tạo tuyển dòng cao su kháng bệnh Cần hỗ trợ công nghệ sinh học nhằm tạo tuyển nhanh, xác kinh tế dvt kháng bệnh 10 Biện pháp sử dụng hóa chấtchỉ áp dụng cho pham vi qui mơ nhỏ, vườn ươm, vườn nhân, cao su giai đoạn kiến thiết (Shamsul Samsuri, 1996; Darussamin A Pawirosoemardjo S., 1996; Phan Thành Dũng, 2006) 2.3.2 Yếu tố phát sinh bệnh cao su hình thành nịi nấm C cassiicola Có ba yếu tố dẫn đến sư phát sinh bệnh cao su gồm: a) Dịng vơ tính cao su mẫn cảm : tính mẫn của dvt cao su tùy thuộc vào điều kiện nước giai đoạn phát triển Như dvt RRIC103 trước xem kháng bệnh Indonesia trở nên nhiễm nặng (Darussamin A Pawirosoemardjo S., 1996) Trong dvt PB 260 dvt có triển vọng sản lượng kháng bệnh tai Malaysia Indonesia bị hại nặng Cameroon châu Phi Dịng vơ tính RRIM 725 mẫn cảm giai đoạn kháng trưởng thành (Shamsul Samsuri, 1996; Darussamin A Pawirosoemardjo S., 1996) b) Nấm hình thành nịi mới: nấm dễ thích nghi với điều kiện mơi trường để hình thành nịi vượt qua tính kháng số dvt đáp ứng khác với thuốc trị bệnh Nịi hình thành gồm ba yếu tố sau: đáp ứng với điều kiện địa lí, đáp ứng với kí chủ khác, đáp ứng với dvt cao su, yếu tố đầu cuối có có vai trị quan đến mức độ gây hại nấm với cao su vùng c) Môi trường thuận lợi cho nấm bệnh cao su phát triển: nhiều loại bệnh khác, phát dịch, lây lan tác hại C cassiicola có liên quan đến yếu tố môi trường độ ẩm, nhiệt độ, lượng mưa, độ cao độ màu mỡ đất (CFC/INRO Project Proposal, 1999) RRIM 600 nhiễm bệnh nặng Johore, không bị bệnh vùng mùa khô kéo dài Kedah Pelis (Shamsul Samsuri, 1996; Darussamin A 11 Pawirosoemardjo S., 1996) Một số ghi nhận cho rằng, độ cao 300 m cao su bị bệnh (Jaysinghe, 2000) 2.4 Giới thiệu thơng tin di truyền, tính đa dạng di truyền thị 2.4.1 Thông tin di truyền Nucleic acid, vật liệu mang thông tin di truyền hệ thống sống Như tên gọi chất khởi đầu cô lập từ nhân Về mặt cấu tạo hóa học polymer hình thành từ monomer nucleotide Mỗi nucleotide gồm ba thành phần: nhóm phosphate, đường pentose (đường Carbon) base hữu (vì nucleotide khác base nên người ta thường dùng từ “base”thay cho “nucleotide”) Các base hữu thuộc hai nhóm: purine gồm Adenine (A) Guanine (G), pyrimidine gồm Thymine (T), Cytosine (C) Uracine (U) Các nucleotide nối với liên kết phosphodiester tạo thành chuỗi dài Các base nitrogen phân tử DNA mang thông tin di truyền, nhóm pentose phosphodiester có vai trị cấu trúc Về mặt cấu trúc nucleic acid gồm hai loại phân tử có cấu tạo giống deoxyribonucleic acid (DNA) ribonucleic acid (RNA) Ở sinh vật eucaryote, thông tin di truyền phân tử DNA, chuỗi xoắn kép gồm hai mạch đơn, mạch đơn chuỗi nucleotide Hai mạch đơn liên kết với nhờ liên kết hydro hình thành base bổ sung nằm hai mạch: A bổ sung với T, G bổ sung với C Mỗi mạch đơn trình tự có định hướng với đầu 5’ phosphate tự đầu 3’ hydroxyl tự (hướng quy ước 5’ 3’) Hướng hai mạch đơn chuỗi xoắn kép ngược nhau, người ta gọi chúng hai mạch đối song song Mỗi mạch đơn trình tự base khác nhau, mạch đơn mang thơng tin khác với mạch Hai mạch đơn liên kết với tính chất bổ sung Chính tính chất giải thích cấu trúc chặt chẽ phân tử DNA, đặc biệt cách thức tự chép để tạo hai phân tử từ phân tử mẹ (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2002; Bùi Trang Việt, 2002; Bùi Chí Bửu Nguyễn Thị Lang, 1999) 12 2.4.2 Tính đa dạng di truyền Trong giống, loài khác có trình tự gene khác Trình tự gene cá thể lồi khác nhau, xuất loại đột biến Đơi khác biệt lại có ý nghĩa mặt di truyền, đột biến xuất vị trí gene gene cá thể, làm cho gene khơng biểu hay biểu khác thành tính trạng khác với cá thể khác loài Sự khác biệt di truyền gọi tính đa dạng di truyền (Bùi Chí Bửu Nguyễn Thị Lang, 1999) 2.4.3 Chỉ thị Sự khác di truyền cá thể loài (hay loài giống) biểu hay khơng biểu thành tính trạng bên ngồi Người ta thường tìm kiếm dấu hiệu để nhận khác di truyền cá thể (hoặc lồi), gọi thị Có loại thị thường sử dụng: - Chỉ thị hình thái - Chỉ thị isozyme - Chỉ thị phân tử 2.4.3.1 Chỉ thị hình thái Gene thể chất di truyền liên kết với tính trạng hình thái mà người ta phát Tuy nhiên dựa vào thị loại để lập đồ gene chọn lọc thời gian, số lượng thị khơng phải tất tính trạng kiểu hình ta nhận diện được, đồng thời độ xác độ tin cậy thấp (Nguyễn Hữu Hỗ, 2005) 2.4.3.2 Chỉ thị isozyme Là thị protein Mỗi protein sản phẩm biểu hay vài gene, người ta dựa vào điều để tìm thị Dựa 13 vào hàng loạt enzyme giống mã hóa allen khác nằm locus Do khác điện tích aminoacid, isozyme phân tách điện di Nhiều enzyme bất biến quần thể hầu hết đa hình enzyme vài biến đổi nhỏ Kết mà thị isozyme đem lại khả quan so với thị hình thái có số lượng thị phát nhiều hơn, nhiên số lượng thị ít, khơng đáp ứng cho nghiên cứu sâu rộng Nghiên cứu Nguyễn Hoàng Luân cộng sự, 2005 hệ thống isozyme 65 kiểu di truyền khác cho thấy hạn hẹp mặt di truyền hầu hết quần thể giống cao su trồng đại trà (Nguyễn Hữu Hỗ, 2005) 2.4.3.3 Chỉ thị phân tử – thị DNA Là thị phân tử DNA tạo nhờ kỹ thuật sinh học phân tử Càng ngày người ta tìm nhiều kỹ thuật đánh giá đa dạng di truyền phát thị, nhiên chia làm nhóm:  Những kỹ thuật dựa kỹ thuật PCR (PCR based): RAPD (mục 2.10), STS (mục 2.8), SSR(mục 2.9), AFLP (mục2.11),.v.v  Kỹ thuật dựa kỹ thuật lai DNA – DNA (Non PCR based): điển hình RFLP (mục 2.5.) (Bùi Chí Bửu Nguyễn Thị Lang, 1999) 2.5 Kỹ Thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms) Đây kỹ thuật sinh học phân tử nhằm phát khác di truyền cá thể, loài giống dựa vào khác số lượng kích thước đoạn DNA tạo sử dụng enzyme cắt giới hạn (restriction enzymes) cắt toàn bộ gene cá thể hay loài nghiên cứu, sau đoạn DNA cắt lai với probe đánh dấu huỳnh quang biết, kết quan sát qua màu huỳnh quang phát Sử dụng đoạn probe chuyên biệt với loài hay giống cần nghiên cứu Nguyên lý kỹ thuật dựa vào tượng đột biến làm hay xuất vị trí cắt giới hạn, 14 kỹ thuật RFLP phát đột biến mức độ tin cậy không cao (Bùi Chí Bửu Nguyễn Thị Lang, 2004) 2.6 Kỹ thuật PCR 2.6.1 Giới thiệu kỹ thuật PCR PCR (polymerase chain reaction) mô tả Mulis cộng (1985) phương pháp tạo dòng in vitro, nghĩa nhằm mục đích thu nhận số lượng lớn trình tự xác định Cơ sở phương pháp đặc tính hoạt động DNA polymerase: chúng có khả tổng hợp mạch từ khuôn kể từ primer (là trình tự DNA ngắn) bắt cặp sẵn với khn Trong thực nghiệm, primer trình tự bổ sung chuyên biệt cho đoạn DNA cần tổng hợp Trong phản ứng PCR chuẩn cần phải biết trình tự đầu tận đoạn DNA cần tăng bội (khơng cần biết trình tự vùng giữa), để tạo oligonuclotide bổ sung cho chúng Các oligonucleotide có hai chức năng: cho phép định vị phần DNA cần tăng bội làm primer cho DNA polymerase (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2002; Bùi Trang Việt, 2002; Bùi Chí Bửu Nguyễn Thị Lang, 1999) 2.6.2 Các bƣớc quy trình chuẩn PCR Phản ứng PCR mơ tả Hình 2.1 gồm bước Bước 1: Giai đoạn biến tính (Denaturation) thường 940C - 960C vịng 30 giây -1 phút (tùy thuộc vào vật liệu) Bước 2: Giai đoạn bắt cặp (Annealing) thường nhiệt độ dao động khoảng 40 - 720C thường 550C kéo dài từ 30 giây - phút Bước 3: Giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (Extension) lúc nhiệt độ tăng lên đến 720C, nhiệt độ tối ưu cho nhiều DNA polymerase chịu nhiệt kéo dài từ phút đến nhiều phút tuỳ vào độ dài DNA cần khuếch đại Một chu kỳ bao gồm ba bước lặp lặp lại nhiều lần, lần lại làm tăng gấp đôi lượng mẫu lần trước Đây khuếch đại theo cấp số nhân.Phản ứng PCR kéo dài khoảng 25 – 40 chu kỳ (tùy vào ứng dụng 15 chuyên biệt) Cuối kết thúc giai đoạn kéo dài 720C phút, sau cho dừng hẳn cách tồn trữ sản phẩm PCR nhiệt độ phòng 40C (tuỳ vào loại máy PCR sử dụng) (Bùi Chí Bửu - Nguyễn Thị Lang, 2004) Số DNA tạo nhờ kỹ thuật PCR tính sau: Tổng số sản phẩm khuếch đại = m x 2n Trong n số chu kỳ, m số copy chuỗi mã hoá cần nghiên cứu Giả sử đạt hiệu 100 %, sau 30 chu kỳ có tổng số sản phẩm khuếch đại 1,07*109 (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2002, Bùi Chí Bửu, 2002, Nguyễn Thị Lang, 2002) DNA đích Biến tính (950C) Bắt cặp (40 -700C) Kéo dài (720C) Hình 2.2 Sơ đồ bƣớc phản ứng chuỗi polymerase (Nguồn: Nguyễn Thái Thủy, 2003) 2.6.3 Thành phần phản ứng PCR yếu tố ảnh hƣởng 2.6.3.1 Primer nhiệt độ lai hay bắt cặp Primer đoạn DNA ngắn, có khả bắt cặp với đầu mạch khuôn DNA DNA polymerase nối dài primer để hình thành mạch primer yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới tính đặc hiệu tính hiệu 16 phản ứng khuếch đại Trình tự primer thường chọn cho khơng có có bắt cặp bổ sung primer xi primer ngược, khơng có cấu trúc “kẹp tóc” bắt cặp bổ sung primer Tm primer phải khơng q cách biệt Ngồi ra, thành phần nucleotide primer phải cân bằng, tránh lặp lại nhiều lần cặp GC Primer chọn phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại, khơng trùng với trình tự gen Trình tự nằm hai primer không lớn, phản ứng PCR tối ưu trình tự nhỏ kb (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2002) Có hai loại primer phản ứng PCR chuẩn, primer xi (forward primer) bắt cặp gắn vào đầu 3’ mạch khuôn 5’ – 3’(sợi sense), primer ngược (reserve primer) bắt cặp bổ sung gắn đầu 3’ mạch khn 3’ – 5’(sợi antisense) (Bùi Trang Việt, 2002) Trình tự primer xác định kích thước, vị trí sản phẩm PCR nhiệt độ Tm, giúp ước lượng nhiệt độ bắt cặp khoảng Tm – (thường với primer có chiều dài nhỏ 20 basepairs) Tm = 2oC x (A+T) + 4oC x (G+C) (Suggs cộng sự, 1981) Với A, T, G, C số lượng nucleotide tương ứng có chuỗi primer, nhiên công thức để tham khảo hay ước lượng Trong hầu hết ứng dụng PCR có nồng độ hai primer nhau, nên từ – 25 pmol cho phản ứng từ 25 µl – 50 µl (dẫn theo Bùi Chí Bửu – Nguyễn Thị Lang, 1999) 2.6.3.2 DNA mẫu Kết phản ứng PCR phụ thuộc lớn vào độ tinh lượng DNA mẫu Tuy nhiên, kỹ thuật chẩn đoán nhanh PCR, DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào kết tốt Lượng DNA mẫu thường sử dụng 10 - 100 ng Lượng mẫu phù hợp có tác dụng hạn chế khuếch đại tạo sản phẩm không mong muốn (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2002) 17 Tỉ lệ primer/DNA mẫu : Nếu tỉ lệ cao, tượng dimer – primer xuất lượng DNA mẫu thấp lượng primer cao Ngược lại sản phẩm PCR không nhiều không đủ primer cho nhân 2.6.3.3 Enzyme DNA polymerase DNA polymerase: dùng phổ biến Taq polymerase, lấy từ vi khuẩn suối nước nóng Thermus aquaticus, có tính ổn định nhiệt cao Trong hầu hết protocol, người ta khuyến cáo nồng độ Taq sử dụng 0,5 U / 25 µl Nếu nồng độ Taq cao (> 1,25 U / 25 µl, sản phẩm khơng chun tính nhảy vào làm sai lệch kết Nếu nồng độ Taq q thấp, khơng có đủ số lượng men xúc tác tạo sản phẩm PCR mong muốn (Bùi Chí Bửu-Nguyễn Thị Lang, 2004) Taq polymerase kéo dài – Kb phút, 1Kb, phút với 72 oC thành cơng cho q trình khuếch đại (Nguyễn Thị Lang, 2002) 2.6.3.4 dNTP Bốn loại nucleotide thường sử dụng nồng độ 20 – 200 uM/ loại nucleotide Nồng độ cao dẫn đến việc tạo sản phẩm không mong muốn Sự cân thành phần nucleotide làm tăng lỗi chép polymerase (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2002) 2.6.3.5 Ion magnesium (Mg2+) Một nhân tố ảnh hưởng lớn tới phản ứng PCR dung dịch đệm ion Mg2+ Kết phản ứng tốt ta cho vào dung dịch phản ứng nồng độ Mg2+ tối ưu Nồng độ ion Mg2+ dung dịch đệm cao hay thấp ảnh hưởng khác phản ứng PCR Nồng độ Mg2+ cao làm cho dây đôi DNA ổn định hơn, làm biến tính tách DNA từ sợi đơi thành sợi đơn giảm, kết sản phẩm PCR Lượng dư Mg2+ làm cho tượng bắt cặp (annealing) khơng chun tính xảy ra, q trình bắt cặp vị trí khơng xảy cho sản phẩm không mong muốn với số lượng lớn, độ chuyên tính thấp Ngược lại, nồng độ Mg2+ thấp, ... cassiicola (Berk & Curt) Wei GÂY BỆNH TRÊN CÂY CAO SU (Hevea brasiliensis Muell Arg.) TẠI TRẠI THỰC NGHIỆM LAI KHÊ, VIỆN NGHIÊN CỨU CAO SU VIỆT NAM BẰNG KỸ THUẬT RAPD GVHD: Sinh viên thực hiện: PGS.TS... ? ?Nghiên cứu đa dạng di truyền quần thể nấm Corynespora cassiicola (Berk & Curt.) Wei gây bệnh cao su (Hevea brasliensis Muell Arg) trại thực nghiệm Lai Khê, Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam kỹ. .. LÊ VĂN HUY, Đại Học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh Tháng 8/2006 “ Nghiên cứu đa dạng di truyền quần thể nấm C .cassiicola( Burt &Curt) Wei gây bệnh cho cao su trại thực nghiệm cao su Lai Khê, Viện Nghiên