32 Ở hai mẫu một và hai là sản phẩm PCR của hai mẫu Phytophthora trên địa lan với nồng độ 30ng. Trong khi hai mẫu còn lại là kết quả thu được khi chạy PCR hai mẫu trên với nồng độ 10ng. Chúng tôi tạm thời không thể giải thích rõ ràng kết quả trên tuy nhiên nó cho ta thấy nồng độ DNA mẫu cũng quyết định kết quả PCR Ở nồng độ 30ng mẫu chỉ cho ra sản phẩm là một band DNA duy nhất chứng tỏ mẫu DNA ly trích là mẫu tinh sạch không tạp nhiểm với DNA của bất kì một loài nào khác. Sản phẩm PCR của hai mẫu Phytophthora trên địa lan ở nồng độ 10ng cho hai band rõ ràng, độ sáng như nhau. Kích thước hai band này chênh lệch nhau khoảng 100bp. Chúng tôi có thể giải thích kết quả trên như sau: thứ nhất nguyên nhân này có thể là do hai mẫu nấm này đã bị tạp nhiễm trong quá trình pha loãng ở nồng độ 10 ng cho nên sản phẩm PCR ở nồng độ 10 ng cho ra hai band khác; thứ hai do quá trình pha loãng không đáng tin cậy. Sản phẩm pha loãng ở 10 ng có nồng độ cao hơn sản phẩm pha loãng ở 30 ng và kích thước đoạn trình tự này có vùng lập lại cho nên trong điều kiện nhất định cặp mồi ITS4 – ITS5 có thể bắt cặp ở nhiều vị trí khác nhau và cho ra sản phẩm PCR có đến hai hay ba band khác nhau trên cùng một vùng trình tự, các band này có độ sáng như nhau. 900bp Hình 4.5. Sản phẩm PCR lần thứ hai (1) và (3) PCR mẫu DL1 ở nồng độ 30ng và 10ng (2) và (4) PCR mẫu DL2 ở nồng độ 30ng và 10ng 33 Như vậy, kết quả chạy PCR ở trên không thể định danh được hai mẫu Phytophthora. Để định danh được hai mẫu nấm trên, chúng tôi đã tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR nhằm mục đích giải trình tự chúng một cách chính xác hơn. 4.4 Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR Tinh sạch sản phẩm PCR dùng để giải trình tự cũng nhằm mục đích như tinh sạch mẫu DNA dùng cho phản ứng PCR. Cả hai nguyên tắc tinh sạch này là như nhau nhưng với qui trình tinh sạch để giải trình tự đòi hỏi phải được thực hiện nghiêm ngặt hơn. Bởi vì qui trình này phải đảm bảo độ tinh sạch của sản phẩm PCR là tối ưu nhất đủ để thực hiện phương pháp giải trình tự bằng máy giải trình tự trực tiếp. Qui trình tinh sạch được chúng tôi đề nghị thực hiện theo hai phương pháp khác nhau: - Phƣơng pháp tinh sạch bằng thao tác tay: phương pháp này thực hiện khá đơn giản, ta có thể sử dụng các hoá chất dùng cho tinh sạch mẫu DNA ly trích để tinh sạch phẩm PCR với mục đích đọc trình tự. Vấn đề đòi hỏi của phương pháp này là thao tác thực hiện phải chính xác. Do thao tác thực hiện trong quá trình tinh sạch còn kém nên. Chúng tôi đã không thu được sản phẩm tinh sạch từ phương pháp này. Nguyên nhân chính có thể là do công đoạn tủa DNA và rửa DNA bằng ethanol không đạt hiệu quả làm mất đi sản phẩm khuếch đại. - Phƣơng pháp tinh sạch bằng cột GFX: Đây là phương pháp tinh sạch bằng kit; thao tác thực hiện đơn giản, nhanh và cho sản phẩm tinh sạch với nồng độ cao. DNA của hai mẫu nấm Phytophthora trên địa lan trước khi được tinh sạch bằng cột phải được chạy điện di và thông qua công đoạn cắt gel để đảm bảo độ tinh sạch cho sản phẩm. Tuy nhiên, ta cũng nên lưu ý một số điểm sau: công đoạn cắt gel đòi hỏi phải chính xác cắt dúng vị trí band DNA trên gel; công đoạn dùng hoá chất phải nhỏ chính xác giữa cột , 34 4.5 Xử lý kết quả giải trình tự Đoạn gen khuếch đại được giải trình tự bằng máy đọc trình tự ABI PRISM 3100. Chúng tôi đã thu được trình tự hai mẫu nấm này trên hai chiều ( xuôi và ngược) phản ứng của kỹ thuật giải trình tự. Độ dài mỗi đoạn trình tự trên hai chiều xuôi và ngược của phản ứng khoảng 840- 850 bp. Để đơn giản cho quá trình so sánh trình tự với các loài nấm khác, chúng tôi chỉ chọn trình tự hai mẫu DL1, DL2 trên mồi ITS5. 4.5.1. Trình tự mẫu DL1 TTANGAAGAGGNAGGACATTACCACACCTAAAAAACTTTCCACGTGAACCGTATCAACCC CTTTAGTTGGGGGTCTTGCTTGGCGTGCGGCTGCTGGCCTTTATTGGTTGGCTGGCTGCG TGCTGGGCGAGCCCTATCATGGCGATCGTTTGGACCTCGGTCTGAGCTAGTAGCTTTTGT TTTAAACCCATTCTTTAATACTGATTATACTGTGGGGACGAAAGTCTCTGCTTTTAACTA GATAGCAACTTTCAGCAGTGGATGTCTAGGCTCGCACATCGATGAAGAACGCTGCGAACT GCGATACGTAATGCGAATTGCAGGATTCAGTGAGTCATCGAAATTTTGAACGCATATTGC ACTTCCGGGTTAGTCCTGGGAGTATGCCTGTATCAGTGTCCGTACATCAAACTTGGCTTT CTTCCTTCCGTGTAGTCGGTGGAGGAGACGTCAGATGTGAAGTGTCTTGCGGTTGGCCTT CGGGTCGTCTGCGAGTCCTTTGAAATGTACTGAACTGTACTCTCTCTTTGCTCGAAAAGC GTGGTATTGTTGGTTGTGGAGACTGCCTGTGTGGCCAGTCGGCGACCGGTTTGTCTGCTA CGGCGTTTAATGGAGGAGTGTTCGATTCGCGGTATGGTTGGCTTCGGCTGAACAGACGCT TATTGGACGTTTTTCCTGCTGTGGCGTGATGGGCTGGTGAACCGTAGCTGTGTTTGGCTT GGTCTTTGAATCGGCTTTGCTGTTGCGAAGTAGAGCGGCGGCTTCGGCTGTCGAGGGGTC GATCCATTTTGGGAAGTTTGTGTGTACTTCGGTGCGCATCTCAATTGGACCTGATATCAG GCAAGATTAC 4.5.2. Trình tự mẫu DL2 GACTGCGGAAGACATTACCACACCTAAAAAACTTTCCACGTGAACCGTATCAACCCCTTT AGTTGGGGGTCTTGCTTGGCGTGCGGCTGCTGGCCTTTATTGGTTGGCTGGCTGCGTGCT GGGCGAGCCCTATCATGGCGATCGTTTGGACCTCGGTCTGAGCTAGTAGCTTTTGTTTTA Hình 4.6. Mẫu tinh sạch dùng cho phản ứng giải trình tự (1) Sản phẩm PCR của DL1; (2) Sản phẩm PCR của DL2 900bp 35 AACCCATTCTTTAATACTGATTATACTGTGGGGACGAAAGTCTCTGCTTTTAACTAGATA GCAACTTTCAGCAGTGGATGTCTAGGCTCGCACATCGATGAAGAACGCTGCGAACTGCGA TACGTAATGCGAATTGCAGGATTCAGTGAGTCATCGAAATTTTGAACGCATATTGCACTT CCGGGTTAGTCCTGGGAGTATGCCTGTATCAGTGTCCGTACATCAAACTTGGCTTTCTTC CTTCCGTGTAGTCGGTGGAGGAGACGTCAGATGTGAAGTGTCTTGCGGTTGGCCTTCGGG TCGTCTGCGAGTCCTTTGAAATGTACTGAACTGTACTCTCTCTTTGCTCGAAAAGCGTGG TATTGTTGGTTGTGGAGACTGCCTGTGTGGCCAGTCGGCGACCGGTTTGTCTGCTACGGC GTTTAATGGAGGAGTGTTCGATTCGCGGTATGGTTGGCTTCGGCTGAACAGACGCTTATT GGACGTTTTTCCTGCTGTGGCGTGATGGGCTGGTGAACCGTAGCTGTGTTTGGCTTGGTC TTTGAATCGGCTTTGCTGTTGCGAAGTAGAGCGGCGGCTTCGGCTGTCGAGGGGTCGATC CATTTTGGGAAGTTTGTGTGTACTTCGGTGCGCATCTCAATTGGACCTGATATCAGGCAA GATTACCCGC Kết quả giải trình tự (ngược và xuôi) hai mẫu nấm này được xử lý độ chính xác bằng phầm mềm CLUSTALX. So sánh độ tương đồng các mẫu giải trình tự với các nguồn nấm đã công bố trên ngân hàng gen của NCBI (Mỹ) bằng phần mềm BLAST. Bảng 4.1. Các nguồn nấm trên ngân hàng gen đƣợc dùng để so sánh Tên dòng nấm Accession Number linear Tác giả 1 P.multivesiculata AF266790 24- FEB- 2005 Cooke,D.E., Drenth,A., Duncan,J.M., Wagels,G. Brasier,C.M 2 P.multivesiculata CBS545.96 DQ335639 16- JAN- 2006 Belbahri,L., Calmin,G. Lefort,F. 3 P.syringae L41386 01-JUL- 2005 Crawford,A.R., Bassam,B.J., Drenth,A., Maclean,D.J. Irwin,J.A.G. 4 P.citricola AY995355 25- APR- 2005 Catal,M., Fulbright,D.W., Stadt,S. Jacobs,J. Thực hiện thí nghiệm so sánh trình tự của hai mẫu nấm trên địa lan với một số loài trong bảng 4.2 bằng phần mềm ClustalX. 36 Bảng 4.2. So sánh trình tự nucleotide vùng ITS của hai mẫu DL1, DL2 Dl1 CCACACCT-AAAAAACTTTCCACGTGAACCGTATCAACCCCTTTAGTTGGGGGTCTTGCT P.multivesiculata CCACACCT-AAAAAACTTTCCACGTGAACCGTATCAACCCCTTTAGTTGGGGGTCTTGCT P.multiCBS545.96 CCACACCT-AAAAAACTTTCCACGTGAACCGTATCAACCCCTTTAGTTGGGGGTCTTGCT Dl2 CCACACCT-AAAAAACTTTCCACGTGAACCGTATCAACCCCTTTAGTTGGGGGTCTTGCT P.syringae CCACACCT-AAAAAACTTTCCACGTGAACCGTATCAACCCCTTTAGTTGGGGGTCTTGCT P.citricola CCACACCTTAAAAAACTTTTCACGTGAACCGTATCAACCCTTTTAGTTGGGGGTCTTGCT ******** ********** ******************** ******************* Dl1 TGGCGTGCGGCTGCTGGCCTTTATTGGTTGGCTGGCTGCGTGCTGGGCGAGCCCTATCAT P.multivesiculata TGGCGTGCGGCTGCTGGCCTTTATTGGTTGGCTGGCTGCGTGCTGGGCGAGCCCTATCAT P.multiCBS545.96 TGGCGTGCGGCTGCTGGCCTTTATTGGTTGGCTGGCTGCGTGCTGGGCGAGCCCTATCAT Dl2 TGGCGTGCGGCTGCTGGCCTTTATTGGTTGGCTGGCTGCGTGCTGGGCGAGCCCTATCAT P.syringae TGGCGTGCGGCTGCTGGCCTTTATTGGTTGGCTGGCTGCGTGCTGGGCGAGCCCTATCAT P.citricola T TTTT GCGAGCCCTATCAT * *** ************** Dl1 GGCGATCGTTTGGACCTCGGTCTGAGCTAGTAGCTTTT-GTTTTAAACCCATTCTTTAAT P.multivesiculata GGCGATCGTTTGGACCTCGGTCTGAGCTAGTAGCTTTT-GTTTTAAACCCATTCTTTAAT P.multiCBS545.96 GGCGATCGTTTGGACCTCGGTCTGAGCTAGTAGCTTTT-GTTTTAAACCCATTCTTTAAT Dl2 GGCGATCGTTTGGACCTCGGTCTGAGCTAGTAGCTTTT-GTTTTAAACCCATTCTTTAAT P.syringae GGCGATCGTTTGGACCTCGGTCTGAGCTAGTAGCTTTT-GTTTTAAACCCATTCTTTAAT P.citricola GGCGAATGTTTGGACTTCGGTCTGGGCTAGTAGCTTTTTGTTTTAAACCCATTCTACAAT ***** ******** ******** ************* **************** *** Dl1 ACTGATTATACTGTGGGGACGAAAGTCTCTGCTTTTAACTAGATAGCAACTTTCAGCAGT P.multivesiculata ACTGATTATACTGTGGGGACGAAAGTCTCTGCTTTTAACTAGATAGCAACTTTCAGCAGT P.multiCBS545.96 ACTGATTATACTGTGGGGACGAAAGTCTCTGCTTTTAACTAGATAGCAACTTTCAGCAGT Dl2 ACTGATTATACTGTGGGGACGAAAGTCTCTGCTTTTAACTAGATAGCAACTTTCAGCAGT P.syringae ACTGATTATACTGTGGGGACGAAAGTCTCTGCTTTTAACTAGATAGCAACTTTCAGCAGT P.citricola ACTGATTATACTGTGGGGACGAAAGTCTCTGCTTTTAACTAGATAGCAACTTTCAGCAGT ************************************************************ Dl1 GGATGTCTAGGCTCGCACATCGATGAAGAACGCTGCGAACTGCGATACGTAATGCGAATT P.multivesiculata GGATGTCTAGGCTCGCACATCGATGAAGAACGCTGCGAACTGCGATACGTAATGCGAATT P.multiCBS545.96 GGATGTCTAGGCTCGCACATCGATGAAGAACGCTGCGAACTGCGATACGTAATGCGAATT Dl2 GGATGTCTAGGCTCGCACATCGATGAAGAACGCTGCGAACTGCGATACGTAATGCGAATT P.syringae GGATGTCTAGGCTCGCACATCGATGAAGAACGCTGCGAACTGCGATACGTAATGCGAATT P.citricola GGATGTCTAGGCTCGCACATCGATGAAGAACGCTGCGAACTGCGATACGTAATGCGAATT ************************************************************ Dl1 GCAGGATTCAGTGAGTCATCGAAATTTTGAACGCATATTGCACTTCCGGGTTAGTCCTGG P.multivesiculata GCAGGATTCAGTGAGTCATCGAAATTTTGAACGCATATTGCACTTCCGGGTTAGTCCTGG P.multiCBS545.96 GCAGGATTCAGTGAGTCATCGAAATTTTGAACGCATATTGCACTTCCGGGTTAGTCCTGG Dl2 GCAGGATTCAGTGAGTCATCGAAATTTTGAACGCATATTGCACTTCCGGGTTAGTCCTGG P.syringae GCAGGATTCAGTGAGTCATCGAAATTTGGAACGCATATTGCACTTCCGGGTTAGTCCTGG P.citricola GCAGGATTCAGTGAGTCATCGAAATTTTGAACGCATATTGCACTTCCGGGTTAGTCCTGG *************************** ******************************** Dl1 GAGTATGCCTGTATCAGTGTCCGTACATCAAACTTGGCTTTCTTCCTTCCGTGTAGTCGG P.multivesiculata GAGTATGCCTGTATCAGTGTCCGTACATCAAACTTGGCTTTCTTCCTTCCGTGTAGTCGG P.multiCBS545.96 GAGTATGCCTGTATCAGTGTCCGTACATCAAACTTGGCTTTCTTCCTTCCGTGTAGTCGG Dl2 GAGTATGCCTGTATCAGTGTCCGTACATCAAACTTGGCTTTCTTCCTTCCGTGTAGTCGG P.syringae GAGTATGCCTGTATCAGTGTCCGTACATCAAACTTGGCTTTCTTCCTTCCGTGTAGTCGG P.citricola GAGTATGCCTGTATCAGTGTCCGTACATCAAACTTGGCTTTCTTCCTTCCGTGTAGTCGG ************************************************************ Dl1 TGGAGGAGACGTCAGATGTGAAGTGTCTTGCGGTTGGCCTTCGGGTCGTCTGCGAGTCCT P.multivesiculata TGGAGGAGACGTCAGATGTGAAGTGTCTTGCGGTTGGCCTTCGGGTCGTCTGCGAGTCCT P.multiCBS545.96 TGGAGGAGACGTCAGATGTGAAGTGTCTTGCGGTTGGCCTTCGGGTCGTCTGCGAGTCCT Dl2 TGGAGGAGACGTCAGATGTGAAGTGTCTTGCGGTTGGCCTTCGGGTCGTCTGCGAGTCCT P.syringae TGGAGGAGACGTCAGATGTGAAGTGTCTTGCGGTTGGCCTTCGGGTCGTCTGCGAGTCCT P.citricola TGGAGGATGTGCCAGATGTGAAGTGTCTTGCGGGTGTCCTTCGGGTCGTCTGCGAGTCCT ******* * ********************* ** *********************** Dl1 TTGAAATGTACTGAACTGTACTCTCTCTTTGCTCGAAAAGCGTGGTATTGTTGGTTGTGG P.multivesiculata TTGAAATGTACTGAACTGTACTCTCTCTTTGCTCGAAAAGCGTGGTATTGTTGGTTGTGG 37 P.multiCBS545.96 TTGAAATGTACTGAACTGTACTCTCTCTTTGCTCGAAAAGCGTGGTATTGTTGGTTGTGG Dl2 TTGAAATGTACTGAACTGTACTCTCTCTTTGCTCGAAAAGCGTGGTATTGTTGGTTGTGG P.syringae TTGAAATGTACTGAACTGTACTCTCTCTTTGCTCGAAAAGCGTGGTATTGTTGGTTGTGG P.citricola TTGAAATGTACTGAACTGTACT-TCTCTTTGCTCGAAAAGCGTGGTGTTGCTGGTTGTGG ********************** *********************** *** ********* Dl1 AGACTGCCTGTGTGGCCAGTCGGCGACCGGTTTGTCTGCTACGGCGTTTAATGGAGGAGT P.multivesiculata AGACTGCCTGTGTGGCCAGTCGGCGACCGGTTTGTCTGCTACGGCGTTTAATGGAGGAGT P.multiCBS545.96 AGACTGCCTGTGTGGCCAGTCGGCGACCGGTTTGTCTGCTACGGCGTTTAATGGAGGAGT Dl2 AGACTGCCTGTGTGGCCAGTCGGCGACCGGTTTGTCTGCTACGGCGTTTAATGGAGGAGT P.syringae AGACTGCCTGTGTGGCCAGTCGGCGACCGGTTTGTCTGCTACGGCGTTTAATGGAGGAGT P.citricola AGGCTGCCTGCGTGGCCAGTCGGCGACCGGTTTGTCTGCTGCGGCGTTTAATGGAGGAGT ** ******* ***************************** ******************* Dl1 GTTCGATTCGCGGTATGGTTGGCTTCGGCTGAACAGACGCTTATTGGACGTTTTTCCTGC P.multivesiculata GTTCGATTCGCGGTATGGTTGGCTTCGGCTGAACAGACGCTTATTGGACGTTTTTCCTGC P.multiCBS545.96 GTTCGATTCGCGGTATGGTTGGCTTCGGCTGAACAGACGCTTATTGGACGTTTTTCCTGC Dl2 GTTCGATTCGCGGTATGGTTGGCTTCGGCTGAACAGACGCTTATTGGACGTTTTTCCTGC P.syringae GTTCGATTCGCGGTATGGTTGGCTTCGGCTGAACAGACGCTTATTGGACGTTTTTCCTCC P.citricola GTTCGATTCGCGGTATGGTTGGCTTCGGCTGAACAGGCGCTTATTGTATGCTTTTCCTGC ************************************ ********* * * ******* * Dl1 TGTGGCGTGATGGGCTGGTGAACCGTAGCTGTGTTT-GGCTTGGTCTTTGAATCGGCTTT P.multivesiculata TGTGGCGTGATGGGCTGGTGAACCGTAGCTGTGTTT-GGCTTGGTCTTTGAATCGGCTTT P.multiCBS545.96 TGTGGCGTGATGGGCTGGTGAACCGTAGCTGTGTTNTGGCTTGGTCTTTGAATCGGCTTT Dl2 TGTGGCGTGATGGGCTGGTGAACCGTAGCTGTGTTT-GGCTTGGTCTTTGAATCGGCTTT P.syringae TGTGGCGTGATGGGCTGGTGAACCGTACCTGTGTTT-GGCTTGGTCTTTGAATCGGCTTT P.citricola TGTGGCGTGATGGGCTGGTGAACCGTAGCTGTGTGT-GGCTTGGCTTTTGAATCGGCTTT *************************** ****** ******* ************** Dl1 GCTGTTGCGAAGTAGAGCGGCGGCTTCGGCTGTCGAGGGGTCGATCCATTTTGGGAAGTT P.multivesiculata GCTGTTGCGAAGTAGAGCGGCGGCTTCGGCTGTCGAGGGGTCGATCCATTTTGGGAAGTT P.multiCBS545.96 GCTGTTGCGAAGTAGAGCGGCGGCTTCGGCTGTCGAGGGGTCGATCCATTTTGGGAAGTT Dl2 GCTGTTGCGAAGTAGAGCGGCGGCTTCGGCTGTCGAGGGGTCGATCCATTTTGGGAAGTT P.syringae GCTGTTGCGAAGTAGAGCGGCGGCTTCGCCTGTCGAGGGGTCGATCCATTTTGGGAAGTT P.citricola GCTGTTGCGAAGTAGAGTGGCGGCTTCGGCTGTCGAGGG-TCGATCCATTT-GGGAACTT ***************** ********** ********** *********** ***** ** Dl1 TGTGTGTACTTCGGTGCGCATCTCAATT P.multivesiculata TGTGTGTACTTCGGTGCGCATCTCAA P.multiCBS545.96 TGTGTGTACTTCGGTGCGCATCTCAA Dl2 TGTGTGTACTTCGGTGCGCATCTCAATT P.syringae TGTGTGTACTTCGGTGCGCATCTCAATT P.citricola TGTGTGCACCTCGGTGCGCATCTCAATT ****** ** **************** Dựa trên kết quả so sánh ở bảng 4.2 ta thấy hai mẫu địa lan có cấu trúc trình tự rất giống nhau và khá tương đồng với trình tự của ba dòng nấm là P.multivesiculata, P.multivesiculata CBS545.96 và P.syringae Chúng tôi tiến hành so sánh cây phát sinh loài của hai mẫu nấm trên địa lan với ba dòng nấm trên bằng phần mềm Treeview 38 Hình 4.7. Cây phát sinh loài của hai mẫu địa lan Theo hình 4.7 hai mẫu nấm này có thể có chung một nguồn gốc thuộc loài P.multivesiculata ( dòng CBS545.96). Chúng tôi đã thực hiện thêm một số so sánh nhằm xác định các tiểu phần gen trong vùng (ITS1-5,8S-ITS2) dựa trên trình tự tương đồng vùng ITS của dòng nấm P.multivesiculata chủng CBS545.96. Bảng 4.3. Kết quả so sánh từng vùng trên đoạn gen ITS1- 5,8S- ITS2 P.multi CBS545.96 Độ tương đồng Số lượng Nucleotide DL1 DL2 DL1 DL2 ITS1 5,8S ITS2 100% 100% 99,99% 100% 100% 99,99% 225 160 420 225 160 420 Tỉ lệ tương đồng trên vùng ITS1 của mẫu là 100%; trên vùng ITS2 là 99,5%; trên vùng 5,8S là 100%. Dựa trên trình tự ITS1, trình tự ITS2 và trình tự vùng 5.8S chúng tôi đã thu được bảng kết quả sau 39 Bảng 4.4. Trình tự vùng gen (ITS1-5.8S-ITS2) của mẫu Phytophthora địa lan #18S NAAGCTGGAGAGAGACTTCCCC #ITS1 CCACACCTAAAAAACTTTCCACGTGAACCGTATCAACCCCTTTAGTTGGGGGTCTTGCTT GGCGTGCGGCTGCTGGCCTTTATTGGTTGGCTGGCTGCGTGCTGGGCGAGCCCTATCATG GCGATCGTTTGGACCTCGGTCTGAGCTAGTAGCTTTTGTTTTAAACCCATTCTTTAATAC TGATTATACTGTGGGGACGAAAGTCTCTGCTTTTAACTAGATAG #5_8S AACTTTCAGCAGTGGATGTCTAGGCTCGCACATCGATGAAGAACGCTGCGAACTGCGATA CGTAATGCGAATTGCAGGATTCAGTGAGTCATCGAAATTTTGAACGCATATTGCACTTCC GGGTTAGTCCTGGGAGTATGCCTGTATCAGTGTCCGTA #ITS2 GTACATCAAACTTGGCTTTCTTCCTTCCGTGTAGTCGGTGGAGGAGACGTCAGATGTGAA GTGTCTTGCGGTTGGCCTTCGGGTCGTCTGCGAGTCCTTTGAAATGTACTGAACTGTACT CTCTCTTTGCTCGAAAAGCGTGGTATTGTTGGTTGTGGAGACTGCCTGTGTGGCCAGTCG GCGACCGGTTTGTCTGCTACGGCGTTTAATGGAGGAGTGTTCGATTCGCGGTATGGTTG GCTTCGGCTGAACAGACGCTTATTGGACGTTTTTCCTGCTGTGGCGTGATGGGCTGGTG AACCGTAGCTGTGTTNTGGCTTGGTCTTTGAATCGGCTTTGCTGTTGCGAAGTAGAGCGG CGGCTTCGGCTGTCGAGGGGTCGATCCATTTTGGGAAGTTTGTGTGTACTTCGGTGCGCA TCTCAA #28S ATATCAGGCAAGATTA Theo kết quả ở bảng 4.4, chúng tôi đi đến một số điều cần thảo luận như: - Kết quả BLAST đoạn trình tự trên ngân hàng gen cho thấy sản phẩm hai mẫu nấm trên thuộc giống Phytophthora ( phù hợp với kết quả định danh bằng quan sát hình thái của kỹ sư Trịnh Thị Phương Vy). - Vùng ITS1- 5,8S- ITS2 của hai mẫu nấm này có 850 nucleotide. Điều này cũng khá phù hợp khi kết quả PCR của hai mẫu nấm này cho ra sản phẩm khoảng 800 bp. - Kết quả so sánh bằng phần mềm ClustalX trên toàn vùng ITS1- 5,8S- ITS2 và vẽ cây phát sinh loài bằng phần mềm Treeview cho thấy hai mẫu nấm trên có quan hệ rất gần với loài P. multivesiculata, đặc biệt là dòng P. multivesiculata CBS545.96. - Để khẳng định lại kết quả trên chúng tôi đã tiến hành so sánh các trình tự ngay trên từng tiểu phần nhỏ như ITS1; ITS2; 5,8S. Tỉ lệ tương đồng của phép so sánh này đạt gần 100%. Chúng tôi kết luận hai mẫu trên cùng thuộc loài P. multivesiculata dòng CBS545.96. - Đối chiếu với bảng danh mục các loài Phytophthora có mặt tại Việt Nam ( A. Drenth và I. Guest, 2004) chứng minh rằng đây là một loài mới xuất hiện tại Việt Nam kể từ năm 2004. 40 Phần 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Kết quả giải trình tự cho ta một số kết luận như: - Ứng dụng của kỹ thuật PCR chúng tôi phát hiện hai mẫu nấm trên tiêu Bà Rịa và sầu riêng Đồng Nai đều thuộc giống Phytophthora nhưng chưa xác định rõ hai mẫu nấm trên địa lan. - Kết quả giải trình tự hai mẫu nấm trên địa lan có cấu trúc trình tự gần giống nhau. Trình tự của hai mẫu nấm này sau khi so sánh trên ngân hàng gen cho kết quả rất gần với ba dòng nấm bao gồm P.multivesiculata, P. multivesiculata CBS545.96 và P. syringae. Kết quả thu được trên cây phát sinh loài cho thấy hai mẫu nấm này có trình tự tương đồng với dòng P. multivesiculata CBS545.96. - So với bảng danh mục các loài Phytophthora xuất hiện tại Việt Nam do A. Drenth và I. Guest điều tra năm 2004 cho thấy loài nấm này không có mặt trong bảng danh mục các loài nấm Phytophthora gây bệnh ở Việt Nam. 5.2. Đề nghị - Giải trình tự trực tiếp hai nấm Phytophthora trên tiêu Bà Rịa và sầu riêng Đồng Nai. - Tăng số lượng các mẫu phân tích nhằm phát hiện mức độ đa dạng của các loài nấm trên cùng một đối tượng. - Áp dụng qui trình định danh trên cho những nghiên cứu về các loài nấm trên các loại lan ở Lâm Đồng. 41 Phần 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Trịnh Thị Phương Vy, 2005. Định danh nấm Phytopthora spp. bằng kỹ thuật PCR ( Polymerase Chain Reaction) kết hợp mô tả hình thái học. 2. Nguyễn Thị Lang, Bùi Chí Bửu, 2005. Sinh học phân tử, giới thiệu phương pháp và ứng dụng, NXB Nông Nghiệp Thành Phố Hồ Chí Minh. Tiếng Anh 3. André Drenth và David I. Guest, 2004. Diversity and Management of Phytophthora in Southeast Asia, Australian Centre for International Agricultural Research Canberra. 4. James C. Correll . Genetic, Biochemical, và Molecular Techniques for the Identification and Detection of Soilborne Plant-Pathogenic Fungi. 5. Alex A. Appiad, Isaac Y. Opoku và Andrews Y. Akrofi, 2004. Natural occurrence and distribution of stem cankers caused by Phytophthora palmivora on cocoa. 6. S.E. Zitko và L.W. Timmer,1994. Competitive Parasitc Abilities of Phytophthora parasitica and P. palmivora on Fibrous Roots of Citrus. 7. D. Cooke, N. Williams và J. M. Duncan, The uses of ITS regions in Phytophthora species. 8. C. Silvar, J. M. Duncan, D.E.L. Cooke, N.A. Williams, J. Diaz và F. Merino, 2004. Development of specific PCR primers for identification and detection of Phytophthora capsici Leon. 9. T. Wangsomboondee và J.B. Ristaino, 2002. Optimization of Sample Size and DNA Extraction Methods to Improve PCR Detection of Different Propagules of Phytophthora infestans. 10. A. Drenth và J.A.G. Irwin, 2001. Routine DNA based Diagnostic Test for Phytophthora. 11. F. Yamak, T.L. Peever, G.G. Grove, và R.J. Boal, 2002. Occurrence and Identification of Phtophthora spp. Pathogenic to Pear Fruit in Irrigation Water in the Wenatchee River Valley of Washington State. [...]... Mitochondrial DNA 13 P Chowdappa, D Brayford, J Smith và J Flood, 20 03 Molecular discrimination of Phytophthora isolates on cocoa and their relationship with coconut, black pepper and bell pepper isolates based on rDNA repeat and AFLP fingerprints, CURRENT SCIENCE, VOL 84, NO 9 14 C.M Brasier, D.E.L Cooke và J.M Duncan, 1999 Origin of a new Phytophthora pathogen through interspecific hydridization  43 44 45 46 . danh trên cho những nghiên cứu về các loài nấm trên các loại lan ở Lâm Đồng. 41 Phần 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Trịnh Thị Phương Vy, 2005. Định danh nấm Phytopthora spp. bằng. So với bảng danh mục các loài Phytophthora xuất hiện tại Việt Nam do A. Drenth và I. Guest điều tra năm 2004 cho thấy loài nấm này không có mặt trong bảng danh mục các loài nấm Phytophthora. thảo luận nh : - Kết quả BLAST đoạn trình tự trên ngân hàng gen cho thấy sản phẩm hai mẫu nấm trên thuộc giống Phytophthora ( phù hợp với kết quả định danh bằng quan sát hình thái của kỹ sư