NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ ĐỘC TÍNH CỦA NẤM PHIẾN ĐỐM VÂN LƯỚI PANAEOLUS AFF. RETIRUGIS Hoàng Văn Vinh, Trịnh Tam Kiệt Trung tâm Công nghệ Sinh học - ĐHQG Hà nội Đỗ Ngọc Liên Trường ĐHKHTN- ĐHQG Hà nội I. MỞ ĐẦU Nấm độc có thể gây hại cho con người và động vật có vú nếu ăn phải chúng. Tuy nhiên, các “độc dược” thu nhận được từ nấm nếu biết sử dụng đúng cách lại là một nguồn dược liệu vô cùng quý, có ứng dụng rất lớn đối với việc điều trị một số bệnh trong y học. Ví dụ như: từ một số loài nấm độc thuộc chi: Psilocybe, Conocybe, Stropharia, Panaeolus, Copeladia, Chlorophyllum…con người đã chiết xuất được nhiều chất có hoạt tính sinh học, mà chủ yếu là các alkaloid, ở nồng độ cao mang tính độc, có thể giết chết người và động vật. Tuy vậy với nồng độ thấp, ở liều lượng thích hợp nó lại là dược liệu quý có tác dụng hỗ trợ trong khi sản phụ sinh nở, chống bệnh biếu cổ, chống nhức đầu, cũng như các bệnh thần kinh và tim mạch khác. Đăc biệt một số loài nấm có chứa độc tố alkaloid gây ra trạng thái ảo giác gọi là hallucinogenic mushroom có ứng dụng điều trị các bệnh tâm thần, mất trí nhớ…[3] Chính vì nhữn lý do trên mà nấm độc ngày càng thu hút sự quan tâm nghiên cứu của nhiều nhà khoa học trên thế giới. Và nghiên cứu này cũng nhằm góp phần nhỏ vào sự hiểu biết chung về nấm độc đặc biệt là nấm độc Việt Nam. II. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Nguyên liệu: - Nấm Panaeolus aff. retirugis được thu hái trên bãi cỏ chăn thả trâu bò tại Hà Nội và Gia Bình- Bắc Ninh. - Chuột nhắt trắng khoẻ mạnh, trọng lượng trung bình từ 23- 24g do Viện Vệ sinh Dịch tễ cung cấp. - Máu người: nhóm máu A, B, O do Việt huyết học và truyền máu- bệnh viện Bạch Mai cung cấp. - Các chủng vi sinh vật do Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật- TTCNSH- ĐHQG cung cấp. - Các hoá chất được sử dụng dưới dạng tinh khiết. Phương pháp - Phân loại học theo phương pháp của Trịnh Tam Kiệt [5] - Nghiên cứu sự mọc và sự hình thành quả thể theo các phương pháp nghiên cứu của Trịnh Tam Kiệt và các tác giả [4] - Định tính và tách chiết alkaloid tổng số theo các phương pháp cập nhật đã được mô tả [8, 10, 11] - Thực hiện phản ứng gây ngưng kết hồng cầu theo nguyên tắc của Gebauer [9] - Thử khả năng kháng khuẩn của độc tố: Theo phương pháp khuyếch tán trên đĩa thạch. Môi trường nuôi cấy là Mueller- Hinton [9, 6] III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 1. Nghiên cứu hình thái quả thể và bào tử Panaeolus aff. retirugis (Fr.) Gill, Họ Strophariacea Singer KA. H. Sm. 1946, thuộc chi Panaeolus (Fr.) Quel., 1872. Đây là một chi tương đối lớn, ở Việt Nam đã có 10 loài được ghi nhận [5]. Mũ nấm khi non có hình cầu, khi mở ra thành hình bán cầu, màu trắng xám. Bề mặt mũ nhẵn bóng và khô, không nhày dính, đường kính khoảng 1-3cm. Phiến màu xám nhạt khi non, sau màu xám đen, lốm đốm (do bào tử chín không đều tạo nên những đốm đen trên nền xám). Cuống cùng màu với mũ, mảnh, dễ gẫy. Thịt nấm mỏng, màu trắng. Bào tử màu nâu, hình quả chanh, kích thước: 12- 14vm x 6-8m. Chúng thường mọc trên phân trâu bò mục, các bãi cỏ chăn thả gia súc, ven đường, đất trồng có bón phân chuồng. Đây là loài nấm độc mọc quanh năm. Hình1: Quả thể và bào tử của nấm Panaeolus aff. retirugis 2. Nghiên cứu sự mọc của nấm Giống gốc thuần khiết được phân lập từ mô rất mỏng của quả thể nấm Panaeolus aff. retirugis. Giống gốc nấm trên môi trường thạch nghiêng được cấy truyền sang môi trường thạch trong bình tam giác để nghiên cứu tốc độ sinh trưởng của hệ sợi, kết quả được chỉ ra trong bảng sau: Bảng 1: Tốc độ mọc của sợi nấm Qua kết quả nghiên cứu hệ sợi của nấm Paneolus aff. retirugis trên môi trường thạch chúng tôi nhận thấy: Sau khi tách phân lập được giống thuần khiết từ miền mô thể quả non, hệ sợi phát triển tốt ở 25 ± 3 O C trên môi trường thạch. Tốc độ mọc của sợi nhìn chung là khá chậm (68-70 m/giờ). Sau khoảng 7-15 ngày hệ sợi mọc dày đặc trên bề mặt thạch và sau khoảng 26 ngày bắt đầu xuất hiện sắc tố vàng ở vùng tâm khuẩn lạc (miền sợi già) đó là dấu hiệu xuất hiện mô sẹo. Khi quan sát dưới kính hiển vi, sợi nấm Paneolus aff. retirugis là sợi có vách ngăn, tồn tại dưới 2 dạng: dạng sợi bình thường, đó là dạng sợi mảnh, có độ dày khoảng 2-3 m, không nhìn thấy các hạt nội chất bên trong. Dạng thứ 2 là dạng sợi căng phình, bên trong chứa nhiều hạt nội chất, có độ dày khoảng 4-10 m. 3. Kết quả nghiên cứu về thành phần hoá học 3.1. Định tính alkaloid Để xác định nhanh sự có mặt của alkaloid trong nấm, ta có thể tiến hành theo cách đơn giản sau: Lấy 1-2 g nguyên liệu, ngâm vào 5 ml dung dịch CH 3 COOH 1%, đun sôi, lọc qua giấy lọc, li tâm bỏ cặn. Dịch lọc đem thử với các thuốc thử đặc hiệu với alkaloid [2, 7] Bảng 2: Phát hiện các hợp chất alkaloid trong nấm. Kết quả bảng 2 cho thấy: Các phản ứng phát hiện alkaloid trong nấm Paneolus aff. retirugis đều dương tính, chứng tỏ sự có mặt của nhóm chất này ở trong nấm Panaeolus aff. retirugis. Điều này hoàn toàn đúng so với kết quả đã công bố của các tác giả nghiên cứu về những chất này[12] 3.2. Chiết xuất và định lượng alkaloid tổng số Dựa vào tính chất của alkaloid, có thể tiến hành chiết rút alkaloid ra khỏi nguyên liệu, trước hết cần kiềm hoá nguyên liệu để đẩy alkaloid ra ở dạng tự do rồi rút alkaloid bằng dung môi hữu cơ. Sau đó có thể cho bay hơi dung môi và cân trực tiếp lượng alkaloid đã được tách ra, hoặc có thể chuẩn độ alkaloid được tách ra bằng axít và dựa vào lượng axít đã dùng để chuẩn độ tính ra lượng alkaloid [7]. Bảng 3: Hàm lượng alkaloid tổng số trong nấm Panaeolus aff. retirugis. Như vậy, hàm lượng alkaloid tổng số trong nấm Panaeolus aff. retirugis khá cao, có thể đạt tới 49 ÷ 50 mg/g bột nấm khô (chiếm tới gần 5% trọng lượng khô của nấm ). Do đó cần phải quan tâm đến hợp chất này về mặt khai thác cũng như thành phần và chức năng sinh dược học của chúng. Chế phẩm alkaloid tổng số này được dùng để thử độc tính của chúng. 4. Kết quả nghiên cứu độc tính 4.1. Thử độc tính trên đối tượng tế bào hồng cầu Chế phẩm alkaloid tổng số được hoà vào PBS với tỷ lệ chế phẩm/PBS =1g/20ml. Sau đó dùng dịch này tiến hành thử hoạt tính trên hồng cầu của 3 nhóm máu: A, B, O. Kết quả thu được như sau: Mặc dù chế phẩm của loài nấm này không gây ra hiện tượng ngưng kết hồng cầu nhưng chúng có khả năng làm tan huyết (giống với hiện tượng làm tan huyết của Saponin ) Bảng 4: Hoạt tính làm tan huyết của độc tố nấm Qua bảng kết quả cho ta thấy: Khả năng làm tan huyết của độc tố trong nấm Panaeolus aff. retirugis thể hiện trên cả 3 nhóm máu. Trong đó khả năng làm tan huyết mạnh nhất ở nhóm máu A (90 HHA). 4.2. Thăm dò khả năng kháng khuẩn của chế phẩm thô Chế phẩm chiết rút từ nấm Panaeolus aff. retirugis được hoà với nước cất tạo thành dạng nhũ dịch với nồng độ là 0.025 g/ml. Thử nghiệm được tiến hành trên 3 chủng vi khuẩn gram (-) và 2 chủng vi khuẩn gram (+). Kết quả thu được như sau: Bảng 5: Tính kháng của chế phẩm chiết từ nấm Panaeolus aff. retirugis Từ kết quả bảng trên cho thấy: Chế phẩm chiết rút từ nấm Panaeolus aff. retirugis có khả năng kháng đối với chủng gram (-) là S.typhy (không kháng đối với các chủng còn lại). Do đó cần phải được nghiên cứu kỹ hơn để xác định chính xác chất nào trong alkaloid tổng số thể hiện tính kháng khuẩn trên. 4.3. Thử độc tính cấp của chế phẩm trên đối tượng chuột Chế phẩm (độc tố) được hoà tan với nước tạo thành dạng nhũ dịch với các nồng độ từ 5- 20% tương ứng với từng lô, đưa vào cơ thể chuột theo đường uống, đảm bảo thể tích nhũ: 0.4 ml/chuột. Chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm trên 25 chuột nhắt, được chia thành 5 lô, trong đó: + Thí nghiệm A: 1 lô đối chứng, uống nước cất + Thí nghiệm B: 4 lô, uống chế phẩm độc tố với các nồng độ tương ứng: 5%, 10%, 15% và 20%. Kết quả, ở thí nghiệm A- lô đối chứng: Trong thời gian thí nghiệm chuột sống khoẻ mạnh, không có biểu hiện gì khác thường. Ở thí nghiệm B: Với nồng độ thấp 5% sau khi uống, chuột [...]... typhy Độc tố này tác dụng nhanh, mạnh lên cơ thể chuột (với liều uống 3330 mg/kg số chuột chết chiếm tới 80%) TÀI LIỆU THAM KHẢO 1 Lê Huy Chính (2001), Vi Sinh vật y học, Nxb Y học, Hà Nội 2 Trần Công Khánh, Phạm Hải (1992), Cây độc ở Việt Nam - nhiễm độc, giải độc và cách điều trị, NxbY học, Hà Nội 3 Trịnh Tam Kiệt (1981), Nấm lớn ở Việt Nam, Nxb khoa học, Hà nội 4 Trịnh Tam Kiệt và cộng sự (1996), Sinh. .. phân lập thuần khiết và nuôi cấy trên môi trường thạch khoai tây với tốc độ mọc của sợi nấm là 68-70 m/giờ Sợi nấm có các tế bào phình chứa nội chất, đạt kích thước tới 10 m đường kính 2 Hàm lượng alkaloid tổng số được chiết rút từ nấm Paneolus aff retirugis là: (49,5 ± 0.3) mg/g 3 Độc tố trong nấm Paneolus aff retirugis có khả năng gây tan huyết trên cả 3 nhóm máu: A, B, O ở người và ức chế đối với... lệ chuột chết dưới tác động của độc tố alkaloid trong nấm Panaeolus aff retirugis Ngay sau khi chuột chết, chúng tôi tiến hành mổ để quan sát phủ tạng Kết quả cho thấy - Phổi xung huyết, một số phế nang chảy máu - Não không thấy tổn thương - Dạ dày, ruột trương phềnh , trong chứa đầy khí Hình 2: Chuột chết do uống chất độc trong nấm Panaeolus aff retirugis IV KẾT LUẬN 1 Nấm Paneolus aff retirugis có... học, Hà nội 4 Trịnh Tam Kiệt và cộng sự (1996), Sinh học và kỹ thuật nuôi trồng nấm ăn, Nxb Nông nghiệp, Hà nội 5 Trịnh Tam Kiệt và các cộng sự (2001), Danh lục thực vật Việt nam- phần nấm, tr 296 6 Hoàng Thuỷ Long (1991), Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh vật y học, tr.328 7 Nguyễn Quang Vinh, Bùi phương Thuận, Phan Tuấn Nghĩa (1997), Thực tập hoá sinh học, tr.75-76 8 Goodwin & Mercer (1989), “introduction... hiện tượng giảm hoạt động và khó thở nhẹ, hơi lờ đờ, sau 5 giờ hồi phục dần và sống hoàn toàn qua 24 giờ Với nồng độ cao hơn sau khi uống 20 phút đã giảm hoạt động, khó thở lảo đảo như say, đầu co giật, trương phềnh bụng, có phản ứng ngứa ngáy, xù lông, tím tái, hiện tượng trên tăng dần theo nồng độ Nhiều chuột vật vã nhảy chồm lên mất phản xạ lật, khi chết toàn thân mềm Một số chuột qua cơn vật vã chống... Gergher D.A and Vlietink A.J (1994), "Menthod in plant biochemistry" 12 http:// Panaeolus/ DaoDas1 htm SUMMARY RESEACHING BIOLOGICAL CHARACTERISTIC AND TOXIN OF PANAEOLUS AFF RETIRUGIS Hoang Van Vinh, Trinh Tam Kiet Center of biotechnology - Vietnam national University, Hanoi Do Ngoc Lien Vietnam national university, Hanoi The fungi Panaeolus aff retirugis is isolated and growing in pure culture of potato- . NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ ĐỘC TÍNH CỦA NẤM PHIẾN ĐỐM VÂN LƯỚI PANAEOLUS AFF. RETIRUGIS Hoàng Văn Vinh, Trịnh Tam Kiệt Trung tâm Công nghệ Sinh học - ĐHQG Hà nội. trên mà nấm độc ngày càng thu hút sự quan tâm nghiên cứu của nhiều nhà khoa học trên thế giới. Và nghiên cứu này cũng nhằm góp phần nhỏ vào sự hiểu biết chung về nấm độc đặc biệt là nấm độc Việt. loài nấm độc mọc quanh năm. Hình1: Quả thể và bào tử của nấm Panaeolus aff. retirugis 2. Nghiên cứu sự mọc của nấm Giống gốc thuần khiết được phân lập từ mô rất mỏng của quả thể nấm