NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH AMYLAZA CỦA HAI CHỦNG Bacillus sp H5-1 VÀ H5-4 DÙNG TRONG SẢN XUẤT PHÂN BÓN HỮU CƠ Nguyễn Thị Hoài Hà, Phạm Văn Ty, Nguyễn Thị Kim Quy Trung tâm Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội I MỞ ĐẦU Trong nhiều loại nguyên liệu để sản xuất phân bón hữu vi sinh có chứa tinh bột (bột sắn, thân rễ cây, củ vv ), vi sinh vật dùng sản xuất loại phân bón này, ngồi vi sinh vật có khả phân giải xenluloz, cố định nitơ, phân giải protein, chuyển hoá hợp chất photpho khó tan thành dễ tan, sinh chất kích thích sinh trưởng chất kháng sinh, người ta bổ sung vi sinh vật phân giải tinh bột Xuất phát từ thực tế trên, tiến hành tuyển chọn chủng vi khuẩn ưa nhiệt có khả phân giải tinh bột để bổ sung cho vi sinh vật tạo chế phẩm dùng sản xuất phân bón hữu II NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU a Vi sinh vật Các chủng vi sinh vật phân lập từ đất tỉnh miền Bắc Việt Nam Các chủng giữ bảo quản Bảo tàng Giống chuẩn Vi sinh vật, Trung tâm Công nghệ Sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội b Môi trường MT2 dùng nghiên cứu (g/l): Tinh bột tan-10, CaCl2- 0,2, MgSO4-0,2; NaHCO3-0,2; K2HPO4-5,0; NaCl-0,2 Khử trùng 121oC 15 phút pH = 6,8 c Xác định hoạt tính amylaza theo phương pháp Srivastava [5] d Xác định amylaza sắc ký mỏng theo phương pháp Badal saha [2] e Xác định amylaza điện di gel polyacrylamit [3] III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết nhận biết amylaza sắc ký mỏng Chúng tiến hành xác định hoạt tinh amylaza chủng phương pháp sắc ký mỏng Hình Kết sắc ký mỏng chủng Bacillus i H5-1 H5-4 Chú thích: Chấm 1: -amylaza chuẩn Chấm 2: Bacillus sp H5-1 Chấm 4: Bacillus i H5-4 Kết cho thấy chủng sản sinh glucoza mantoza chủ yếu glucoza Điều chứng tỏ hoạt tính amylaza hai chủng bao gồm  - amylaza,  amylaza glucoamylaza Ảnh hưởng nguồn cacbon sinh tổng hợp amylaza Amylaza thuộc nhóm enzym cảm ứng với nguồn dinh dưỡng glucoxit Bởi việc sinh tổng hợp enzym phụ thuộc đáng kể vào có mặt nồng độ chất cảm ứng Theo nhiều nhà nghiên cứu chất cảm ứng thích hợp cho sinh tổng hợp amylaza vi khuẩn Bacillus maltoza sản phẩm thuỷ phân tinh bột [4] Một số khác lại cho chất cảm ứng isomaltoza penoza Đó loại đường chứa mối nối -1,6 mà -amylaza khơng có khả phá huỷ [2] Để khảo sát ảnh hưởng nguồn gluxit sử dụng chất với tỷ lệ 3% thấp khơng đủ nhu cầu cung cấp lượng cho vi khuẩn, cịn 3% mẫu có tinh bột đặc, ảnh hưởng tới q trình thơng khí Kết trình bày hình Hình Ảnh hưởng nguồn cabon đến sinh tổng hợp amylaza hai chủng Bacillus sp H5-1 H5-4 Kết thử nghiệm cho thấy chủng có khả đồng hóa nguồn chất khác nhau: bột gạo, bột mì, cám gạo, dextrin, bột ngơ Lượng đường khử sinh cao cho enzym tác dụng lên chất bột ngô Phải việc thoả mãn nhu cầu lượng cho vi khuẩn cịn có vai trị sinh tổng hợp cảm ứng amylaza mà vai trò liên quan mật thiết có số tác giả cho tinh bột có trọng lượng phân tử lớn khơng thể lọt qua màng tế bào để enzym tác dụng trực tiếp tới máy điều hoà sinh tổng hợp cảm ứng enzym [1] Vậy nhu cầu lượng, chất đóng vai trị quan trọng trình sinh trưởng sinh amylaza vi khuẩn 3.3 Ảnh hưởng nồng độ Ca2+ lên hoạt tính amylaza chủng Bacillus sp H5-1 H5-4 Hai chủng Bacillus sp H5-1 H5-4 nuôi môi trường MT2 máy lắc ổn nhiệt nhiệt độ 50oC, tốc độ 220 vòng/phút Sau 56 ly tâm thu dịch enzym thơ Eznym có bổ sung CaCl2 với nồng độ 2; 4mM xử lý nước sôi 100oC 15 30 phút Kết trình bày bảng Bảng Ảnh hưởng Ca2+ lên độ bền nhiệt amylaza cuả chủng Bacillus sp H5-1 H5-4 Kết thực nghiệm cho thấy độ bền nhiệt amylaza tăng lên bổ sung Ca2+ vào dịch enzym thô Khi khơng có Ca2+ hoạt tính amylaza giảm nhanh, hoạt tính bị nhanh sau 15, 30 phút xử lý nhiệt Nhiều nghiên cứu cho tách Ca2+ khỏi enzym nhóm –SH lộ ngồi làm hoạt tính phân huỷ amylaza enzym [5] Khi Ca2+ liên kết với apo- - amylaza, tồn hoạt tính enzym thể nhóm –SH nối với Kết phù hợp với nhận định Machius cho Ca2+ làm ổn định hoá cấu trúc bậc III enzym amylaza nhiệt độ cao [3] Nồng độ Ca2+ thích hợp 2mM thời gian xử lý nhiệt 15 phút 3.5 Kiểm tra amylaza điện di gel polyacrylamit Để kiểm tra enzym, cần xác định băng hoạt tính  amylaza Do dung dịch khơng biến tính với SDS, nhiên gel 7,5% chạy cho SDS Điện di chạy 1mA 4oC Lượng enzym đưa vào với thể tích 20l Sau kết thúc điện di, gel tẩy SDS Triton - X nồng độ 2,5% 30 phút Sau đó, ủ đệm axetat có pH = 6,8 50oC Cuối gel nhuộm với dung dịch Lugol (0.15% I2, 1,5% KI) 20 phút để xác định băng hoạt tính amylaza Kết thể hình Hình Điện di đồ enzym gel polyacrylamit hai chủng Bacillus sp H5-1 H5-4 Băng : Biểu hoạt tính amylaza chủng Bacillus sp H5-1 Băng :  - amylaza chuẩn Băng : Biểu hoạt tính amylaza chủng Bacillus sp H5-4 Kết cho thấy hai chủng Bacillus sp H5-1 H5-4 biểu băng hoạt tính amylaza với băng  amylaza chuẩn có trọng lượng phân tử 800 kDa IV KẾT LUẬN Bằng sắc ký mỏng dịch thuỷ phân amylaza chủng Bacillus sp H5-1 H5-4 cho thấy có chứa amylaza, -amylaza glucoamylaza Amylaza hai chủng vi khuẩn lựa chọn có khả đồng hoá nguồn cacbon khác (bột sắn, bột mỳ, dextrin, cám gạo, bột ngô) Lượng đường sinh cao cho enzym tác động lên bột ngơ Tính bền nhiệt amylaza hai chủng tuyển chọn phụ thuộc vào có mặt Ca2+ thuỷ phân tinh bột Nồng độ 2mM ion Ca2+ cho kết thích hợp 4mM Khi sử dụng phương pháp điện di gel polyacrylamit cho thấy enzym hai chủng Bacillus sp H5-1 H5-4 khiết -amylaza SUMMARY STUDY ON -AMYLASE ACTIVITY OF TWO STRAINS Bacillus sp H5-1 H5-4 USED IN MICROBIAL FERTILIZER PRODUCTION Nguyễn Thị Hoài Hà et al In conclusion, hydrolysis liquid conducting by TLC (Thin layer chromatography) method showed that  - amylase found in both strains Bacillus sp H5-1 H5-4 Amylase activity was able to assimilate in carbon sources (starch, wheat flour, dextrin, and bran, maize) Amount of sugar was highly produced when there was an action of enzyme on maize Amylase approved to be thermophilic in the occurrence of Ca2+ at concentration 2mM Enzyme of two strains were found in  - amylase when using gel electrothesis SDS-PAGE method TÀI LIỆU THAM KHẢO Dobreva, E., A Tonkova, V Ivanova, M Stefanova, L Kabaivanova, D Spassova 1998 Immobilization of Bacillus licheniformis cells, producers of thermostable alpha amylase on polymer membranes.J Ind Microbiol., 20, 166 - 170 Dobreva, E., V Ivanova, A Tonkova, E Radulova 1996 Influence of the immobilization conditions on the effeciency of alpha-amylase production by Bacillus licheniformis Process Biochem.,31,3,229-234 Emanuilova, E., M Kambourova 1994 Extremophilic microorganisms, new sources for biotechnologicaly relevant biocatalysts in: Eight Cong Microbiol Bul Proc Eds S Neychev, Ts.Angelova,S.Dimov,165-169, Sofia Ivanova, V., E Dobreva, E Emanuilova.1993 Purification and characterization of thermostable alphaamylase from Bacillus licheniformis J Biotechnol., 28, 277-289 Srevastava R A K 1981 production of extracellular high heats able amylase by a thermophilic Bacillus sp Indian J., Microbiol.,.123 - 237  ... chuẩn Băng : Biểu hoạt tính amylaza chủng Bacillus sp H5-4 Kết cho thấy hai chủng Bacillus sp H5-1 H5-4 biểu băng hoạt tính amylaza với băng  amylaza chuẩn có trọng lượng phân tử 800 kDa IV... xác định băng hoạt tính amylaza Kết thể hình Hình Điện di đồ enzym gel polyacrylamit hai chủng Bacillus sp H5-1 H5-4 Băng : Biểu hoạt tính amylaza chủng Bacillus sp H5-1 Băng :  - amylaza chuẩn... quan trọng q trình sinh trưởng sinh amylaza vi khuẩn 3.3 Ảnh hưởng nồng độ Ca2+ lên hoạt tính amylaza chủng Bacillus sp H5-1 H5-4 Hai chủng Bacillus sp H5-1 H5-4 nuôi môi trường MT2 máy lắc ổn