SỬ DỤNG KỸ THUẬT DI TRUYỀN TRONG NGHIÊN CỨU TƯƠNG TÁC PROTEIN Dương Văn Hợp Trung tâm Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà nội Sokolenko, R.G.Hermann Viện CNSH Thực vật. Đại học Tổng hợp Munich.Đức. I. GIỚI THIỆU: Nghiên cứu tương tác protein có ý nghĩa quan trọng nhằm xác định chức năng và sự tham gia của chúng vào một hay nhiều hoạt động sống cụ thể như quá trình phân chia tế bào, sao chép DNA, tổng hợp protein hay vận chuyển tín hiệu. Trên thực tế có nhiều phương pháp khác nhau dùng cho nghiên cứu tương tác protein như; sắc kí ái lực (Affinity chromatography), kết tủa miễn dịch ( Immunopricipitate) , tạo liên kết chéo ( Cross-linking). Phương pháp sắc ký ái lực được thực hiện như sau:protein nghiên cứu được cố định trên một chất mang ( ví dụ: agarose, Sephadex). Sau đó mẫu chứa protein tương tác được cho đi qua cột và chúng bị giữ lại. các protein bám này được tách ra khỏi cột bằng các dung dịch thích hợp như : SDS, muối NaCl, dung môi hữu cơ. người ta đã sử dụng phương pháp này để tách các protein tương tác với RNAaza từ 25 năm trước đây. (1). Phương pháp kết tủa miễn dịch dựa vào phản ứng kháng nguyên với kháng thể. ở đây người ta dùng chất mang (Sepharose) gắn với protein A tương tác với kháng thể để kết tủa phức hệ kháng nguyên kháng thể đồng thời kéo theo các protein khác tương tác với protein nghiên cứu (kháng nguyên). Các protein kết tủa cùng sẽ được tách ra để nghiên cứu (2) Phương pháp tạo các liên kết chéo. Với phương pháp này thì liên kết chéo giữa các protein tương tác với nhau nhờ một tác nhân(ví dụ gluceraldehite) . Sau đó phức hệ được tách ra và phân tích khi dùng điện di hai chiều để phát hiện khả năng hai protein có tương tác với nhau(3) Năm 1989, Stan Field (4) lần đầu tiên giới thiệu phương pháp sử dụng kỹ thuật di truyền để nghiên cứu tương tác protein có tên là hệ thống lai kép (Two hybride system ). Phương pháp này có nhiều ưu việt hơn hắn các phương pháp khác. Đặc biệt là độ chính xác và độ nhạy cao mà không phương pháp nào có thể đạt được.Nguyên lý của phương pháp này có thể được mô tả như sau. Việc hoạt động của promotor cho gen “báo cáo” (reporter genes) phụ thuộc vào hai nhân tố phiên mã: nhân tố hoạt hoá promotor AD (Activation Domain) và nhân tố bám vào sợi ADN để cho ARN polymeraza bắt đầu quá trình phiên mã BD (DNA Binding Domain). Như vậy khi có mặt cả hai nhân tố AD và BD thì quá trình phiên mã và dịch mã của gen ‘báo cáo” xảy ra, còn khi chỉ có một trong hai nhân tố trên thì sản phẩm của gen ‘báo cáo” không được tổng hợp. Người ta tách gen mã hoá cho hai nhân tố và gắn vào hai vectơ tách dòng riêng rẽ. Muốn nghiên cứu tương tác protein X và Y người ta tiến hành tách dòng gen mã hoá cho hai protein này và lần lượt gắn vào hai vectơ AD và BD. Sau đó hai vectơ cùng được biến nạp vào dòng tế bào biểu hiện gen. Kết quả là tạo ra các protein lai ( fussion protein) AD-X và BD-Y. Nếu hai protein X và Y có tương tác với nhau thì cả AD và BD cùng hoạt hoá promotor và sản phẩm của gen “báo cáo” được phát hiện. Ngược lại , nếu hai protein X và Y không tương tác với nhau thì tác động của chúng đối với promotor là riêng rẽ do đó không có sản phẩm của gen “báo cáo”. Hình 1: Cơ sở phân tử của hệ thống lai kép a. Phức hệ phiên mã gồm AD và BD b. Sử dụng phức hệ phiên mã để nghiên cứu tương tác hai protein X và Y Phương pháp lai kép được ứng dụng rộng rãi để nghiên cứu tương tác protein trong một số trường hợp sau: 1. Nghiên cứu tương tác hai protein như đã mô tả ở trên. 2. Nghiên cứu tương tác giữa các đoạn peptit chức năng (domain) khác nhau của một protein với các protein khác. 3. Nghiên cứu sàng lọc (screening) từ thư viện gen để tìm kiếm các protein tương tác với một protein đã biết. Dưới đây chúng tôi sẽ trình bày một thí nghiệm ứng dụng kỹ thuật hệ thống lai kép với tế bào chủ là nấm men để nghiên cứu các protein tương tác vớ photphataza (TTP30). II. SỬ DỤNG HỆ THỐNG LAI KÉP NGHIÊN CỨU CÁC PROTEIN TƯƠNG TÁC VỚI MỘT PHOTPHATAZA TTP30. A.Vật liệu và dòng tế bào dùng cho nghiên cứu: Thư viện gen (cDNA library) của Arabidopsis, Viện CNSH thực vật, ĐHTH Munich. Đức. Plasmit pGBT9 mang Gal4-BD và Trp và Plasmit pGAD424 mang Gal4-AD và Leu. Dòng tế bào nấm men HF7C khuyết dưỡng Leu.,Trp.,và His.,thư viện gen ( cDNA library) của Arabidopsis đã được gắn vào plapsmit pGAD424 mang gen Leu.( Công ty clontech ,USA) cung cấp. 2. Hoá chất dùng cho nghiên cứu: Sử dụng các cặp mồi dùng để tách dòng gen TTP30 và gắn vào vectơ pGBT9 như sau:F1,R1;F2R2 và F3. Các hoá chất khác dùng cho nghiên cứu đạt độ tinh khiết cho sinh học phân tử từ các nhà sản xuất Meck, Sigma. Điều kiện phản ứng PCR: Hỗn dịch phản ứng 25 microlit: dNTP: 0,25 microMol., đệm tris : pH:8.0 10 mM, MgCl2:1mM, DNA mồi (primer) 50ng, DNA khuôn (template) 10-20ng) , 94 oC:45s,55 oC:45s,72oC :45s. Số chu kỳ lặp lại : 35. 4. Kỹ thuật: Sử dụng cá kỹ thuật di truyền như: tách, tinh sạch DNA, cắt với enzim giới hạn, gắn vào vectơ và biến nạp E.coli theo các phương pháp mô tả của Maniats 5. (Molecular Cloning)(5). Biến nạp vào nấm men theo phương pháp Li thium acetat của (6) 6. Các kỹ thuật phát hiện dòng tế bào biến nạp trên môi trường chọn lọc và sản phẩm của gen chỉ thị theo chỉ dẫn của Clontech(7) B: Kết quả nghiên cứu: 1. Thu nhận dòng gen mã hoá cho TTP30 bằng kỹ thuật PCR. Gen TTP30 đã được nghiên cứu tại Việnn CNSH thực vật, ĐHTH Munich. Kết quả nghiên cứu cho thấy sản phẩm của gen là protein có hai nhóm chức năng phân biệt là vị trí bám vào photphat : PB(435 bps ) và vị trí có độ lặp lại cao của 4 a xitamin TPR( 550bps ). Với mục đích tìm hiểu các protein tương tác với gen TTP30 cũng như với từng đoạn peptit PB và TPR chúng tôi dùng phản ứng PCR để thu được các đoạn gen mong muốn. Khi dùng cặp mồi F1 và R1, chúng tôi nhận được gen đầy đủ chứa cả hai vị trí PB và TPR(1050bps) và khi dùng các cặp mồi F2, R2 và F3 ,R1 sẽ thu được các phần gen riêng biệt cho PB và TPR. Kết quả điện di sản phẩm PCR được trình bày ở hình2. Hình 2: Sản phẩm PCR của gen TTP30 và các đoạn PB,TPR. 2. Gắn sản phẩm PCR vào vectơ pGBT9 và biến nạp vào dòng tế bào nấm men HF7C. Các đoạn mồi đều mong vị trí cắt của enzim giới hạn SmaI. Chúng tôi đã tiến hành cắt riêng rẽ các sản phẩm PCR và vectơ pGBT9 với SmaI . Sản phẩm PCR và vectơ tinh sạch lại được gắn với nhau nhờ ligaza(MPI) và được biến nạp vào E.coli (DH5anpha). Chúng tôi nuôi cấy E.coli chứa plasmit pGBT9 mang các đoạn gen nghiên cứu , tiến hành tách plasmit và biến nạp vào dòng tế bào nấm men HF7C.Trên môi trường chọn lọc khuyết dưỡng triptophan chúng tôi thu được dòng tế bào biến nạp. Sử dụng kỹ thuật PCR để kiểm tra các đọan gen đã được gắn vào vectơ pGBT9, kết quả kiểm tra được trình bày ở hình 3. Hình 3: Kết quả kiểm tra bằng PCR các đoạn gen sau khi gắn vào vectơ pGTB9 và biến nạp vào HF7C. 3. Tuyển chọn dòng gen mã hoá cho protein tương tác với TTP30. Chúng tôi đã tiến hành tách plasmit pGAD424 mang cDNA biến nạp vào tế bào nấm men HF7C đã chứa plasmit pGBT9 mang các đoạn gen tương ứng TTP30,PB,TPR ở trên. Các thể biến nạp được phát hiện trên các môi trường chọn lọc: MT1 không chứa Leu và Trip (phát hiện hiệu quả và tần số biến nạp), môi trường MT2 không chứa Leu, Trip và His (phát hiện dòng gen mã hoá cho protein tương tác với TTP30) theo sơ đồ 1. Kết quả thí nghiệm cho thấy các dòng tế bào đều cho tần số biến nạp cao khi phát hiện trên môi trương MT1. Trên môi trường MT2 chúng tôi chỉ nhận được 5 khuẩn lạc với dòng tế bầo mang gen TTP30 trong khi đó không nhận được thể biến nạp nào với 2 dòng tế bào còn lại (PB và TPR). Để khẳng định các thể biến nạp thu được chúng tôi đã xác định hoạt độ betagalactosidaza và chỉ có hai thể biến nạp có hoạt tính. Đồng thời chúng tôi đã dùng phản ứng PCR để phát [...]... riêng rẽ các vùng chức năng sẽ ảnh hưởng đến cấu hình không gian và làm thay đổi khả năng tương tác của chúng Việc xác định loại gen và vùng tương tác của hai dòng gen thu được ở trên chỉ được thực hiện sau khi giải trình tự gen và axitamin của protein tương ứng kết hợp với kỹ thuật tạo đột biến điẻm trong các nghiên cứu tiếp theo SUMMARY Dương Văn Hợp Sokolenko, R.G.Hermann The paper is a briefly introduction... biến nạp thu được NHẬN XÉT: Như vậy, khi dùng kỹ thuật lai kép với tế bào chủ là nấm men HF7C chúng tôi đã thu được 2 gen mã hoá cho protein tương tác với TTP30 có kích thước khoảng 1,6 kb ( kết quả PCR).Gen TTP30 có hai vùng chức năng PB và TPR nhưng không có biểu hiện tương tác với một protein nào từ thư viện gen cDNA , điều này có thể liên quan đến việc tách dòng riêng rẽ các vùng chức năng sẽ ảnh . pháp lai kép được ứng dụng rộng rãi để nghiên cứu tương tác protein trong một số trường hợp sau: 1. Nghiên cứu tương tác hai protein như đã mô tả ở trên. 2. Nghiên cứu tương tác giữa các đoạn. SỬ DỤNG KỸ THUẬT DI TRUYỀN TRONG NGHIÊN CỨU TƯƠNG TÁC PROTEIN Dương Văn Hợp Trung tâm Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc. để nghiên cứu các protein tương tác vớ photphataza (TTP30). II. SỬ DỤNG HỆ THỐNG LAI KÉP NGHIÊN CỨU CÁC PROTEIN TƯƠNG TÁC VỚI MỘT PHOTPHATAZA TTP30. A.Vật liệu và dòng tế bào dùng cho nghiên