NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI GANODERMA BẰNG MỒI PCR ĐẶC HIỆU CHO GEN SUPEROXIDE DISMUTASE Nguyễn Hoài Giang Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương Nguyễn Xuân Hùng, Lê Đình Lương Trung tâm Công nghệ Sinh học, ĐHQG Hà nội ĐẶT VẤN ĐỀ Trong tự nhiên chi Ganoderma rất đa dạng và không phải tất cả các loài này đều sản sinh ra các hợp chất sinh học có tác dụng như nhau, nên việc phân loại chính xác chúng không phảI chỉ có ý nghĩa khoa học mà còn mang tính thực tiễn. Sự phân loại Ganoderma được thực hiện đầu tiên dựa trên màu sắc và hình thái, tiếp theo là phân loại bằng các isozym, và gần đây là ở mức độ ADN (2, 3, 4). Trong nghiên cứu trước chúng tôi đã sử dụng kỹ thuật RAPD và PCR với mồi đặc hiệu cho gen laccase để phân loại một số chi Ganoderma ở Việt nam (4). Từ những kết quả thu được, chúng tôi tiến hành nghiên cứu các chỉ thị phân tử mới nhằm phân loại Ganoderma chính xác và cụ thể hơn. Enzym superoxide dismutase (SODs) có vai trò quan trọng trong cơ chế bảo vệ của tế bào. Gốc O 2 - gây độc cho tế bào và SODs xúc tác quá trình chuyển O 2 - thành O 2 và chuyển O 2 - và H - thành H 2 O 2 . SODs được phát hiện có tồn tại trong các tế bào từ vi khuẩn đến thực vật và động vật bậc cao (5). Đến nay người ta đã biết có 4 loại SODs, sự phân chia này dựa trên các nguyên tố kim loại có ở vị trí hoạt động của enzym này: Mn SOD, Fe SOD, Cu, Zn SOD và Ni SOD. Enzym Mn SOD giống nhau đến 65% giữa các loài thực vật và chúng có độ tương đồng cao với vi khuẩn. Mỗi phân tử Mn SOD mang một nguyên tử mangan và enzym này không hoạt động được nếu không có nguyên tử mangan ở vị trí hoạt động. So sánh trình tự axít amin của các SODs cho thấy Mn SOD và Fe SOD có nguồn gốc cổ hơn so với các loại SODs còn lại, và có nhiều khả năng chúng tiến hoá từ một loại enzym ban đầu. Ngược lại, Cu- Zn SODs lại không có trình tự tương tự với Mn SOD và Fe SOD và có thể chúng tiến hoá riêng biệt trong quá trình phát triển của các tế bào nhân chuẩn (5, 6). Trong bài báo này, chúng tôi giới thiệu phương pháp sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen Mn SOD để phân loại và xếp nhóm cho Ganoderma ở Việt nam. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 1. Vật liệu Các mẫu nấm Ganoderma lucidum với các dưới loài khác nhau được ký hiệu là Gl 1 và Gl 2; Ganoderma australe sensulato với các dưới loài khác nhau được ký hiệu là Ga 1 và Ga 2; Ganoderma applanatum sensulato với các dưới loài khác nhau được ký hiệu là Gb 1 và Gb 2; Ganoderma tortnatum sensulato với các dưới loài khác nhau được ký hiệu là Gc 1 và Gc 2; Ganoderma australe được ký hiệu là Gau, do GS. Trịnh Tam Kiệt, phòng Giống nấm gốc, Trung tâm Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà nội cung cấp. 2. Phương pháp nghiên cứu • ADN được tách chiết từ các mẫu Ganoderma theo Nguyễn Thị Kim Dung và Lê Đình Lương, có cải tiến, để tăng số lượng ADN thu được (7). • PCR với mồi đặc hiệu cho gen Mn SOD của Ganoderma australe là FGau 1 và RGau 1. • PCR với mồi đặc hiệu cho gen Mn SOD của Ganoderma lucidum và Ganoderma australe là FGau 1 và RGau 2. • Điện di sản phẩm PCR trên gel polyacrylamid 6% và nhuộm bạc (8). KẾT QUẢ, THẢO LUẬN 1. Thiết kế các cặp mồi của gen Mn SOD để phân loại Ganoderma Trong nghiên cứu trước (4) sử dụng kỹ thuật PCR với mồi ngẫu nhiên (OPU1: 5'- ACGGACGTCA -3') và cặp mồi đặc hiệu laccase (LA1: 5'- CAT TGG CAC GGA TTC TTC -3’ và LA2: 5'- ATG GCT GTG GTA CCA GAA -3'), các mẫu Ganoderma nghiên cứu đã được phân ra thành các nhóm: (i) Ganoderma lucidum với sản phẩm PCR 217 bp hoặc 144 bp của gen laccase, (ii) Ganoderma australe và Ganoderma tortnatum sensulato với sản phẩm PCR 144 bp của gen laccase và (iii) Ganoderma applanatum sensulato và Ganoderma australe sensulato không tạo sản phẩm PCR với cặp mồi LA 1 và LA 2. Trong nghiên cứu này, chúng tôi dùng gen mã hoá enzym Mn SOD để phân loại cụ thể hơn các mẫu Ganoderma nêu trên. Khai thác dữ liệu từ Ngân hàng gen quốc tế (Genbank) và kết quả sử dụng phần mềm chuyên dụng Blast (www.ncbi.nlm.nih.gov) để so sánh trình tự gen Mn SOD của Ganoderma lucidum (số hiệu U56134, Genbank) với trình tự gen Mn SOD của Ganoderma australe (số hiệu U56112, Genbank) cho thấy gen Mn SOD của hai loài này có độ tương đồng khá cao (các nucleotid giống hệt nhau được thể hiện bằng các dấu *, Hình 1). Tuy nhiên, trong gen Mn SOD của Ganoderma lucidum và Ganoderma australe cũng có những đoạn trình tự khác biệt đặc trưng riêng cho từng loài (thể hiện bằng các khoảng trống hoặc dấu -, Hình 1). Sử dụng các đoạn có trình tự giống hệt nhau của hai loài Ganoderma này, chúng tôi thiết kế mồi xuôi (FGau 1) và mồi ngược (RGau 2) để nhân các đoạn trong gen Mn SOD. Ngoài ra, sử dụng đoạn trình tự khác biệt đặc hiệu của Ganoderma australe, chúng tôi đã thiết kế một mồi ngược dành riêng cho loại Ganoderma này với ký hiệu RGau 1. Trình tự các mồi như sau: FGau 1: 5’-GAA GCA CCA CCA GAC CTA CGT G-3’ RGau 1: 5’-ATC GAG AGA GGC CGA AGC ACC-3’ RGau 2: 5’-AGA CGT CGA CGC CGA TGA TGG-3’ Theo cách thiết kế các mồi nêu trên, khi tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi FGau 1và RGau 1 thì Ganoderma australe dự kiến sẽ cho 1 băng ADN với kích thước khoảng 461 bp; và sẽ không có sản phẩm PCR với Ganoderma lucidum. Ngược lại khi tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi FGau 1và RGau 2 thì Ganoderma australe dự kiến sẽ cho 1 băng ADN với kích thước khoảng 755 bp, còn với Ganoderma lucidum dự kiến sẽ cho 1 băng ADN với kích thước khoảng 693 bp. Hình 1. So sánh trình tự gen Mn SOD của Ganoderma lucidum và Ganoderma australe. Gl : Ganoderma lucidum aut: Ganoderma australe >: Chiều và vị trí các mồi 2. Sử dụng gen Mn SOD để phân loại Ganoderma Để sử dụng được gen Mn SOD trong phân loại Ganoderma, đầu tiên chúng tôi tiến hành tối ưu hoá điều kiện PCR theo nhiệt độ gắn mồi tính toán được từ các mồi (FGau 1, RGau1 và RGau 2) và kích thước sản phẩm PCR dự đoán sẽ tạo ra. Điều kiện PCR sau khi tối ưu hoá với cặp mồi FGau 1và RGau 1 là 94 o C 3 phút/ 35 chu kỳ với 94 o C 20 giây, 65 o C 30 giây, 72 o C 40 giây/ 72 o C 3 phút. Kết quả điện di và nhuộm bạc trên gel polyacrylamid 6% cho thấy, đúng như dự đoán của chúng tôi, cặp mồi FGau 1và RGau 1 cho phép khuyếch đại 1 phần của gen Mn SOD ở Ganoderma australe (Gau) với kích thước khoảng 461 bp (Giếng 7, Hình 2). Trong khi đó các mẫu Ganoderma lucidum (Gl 1 và Gl 2), Ganoderma tortnatum sensulato (Gc 1 và Gc 2), Ganoderma australe sensulato (Ga 1 và Ga 2) và Ganoderma applanatum sensulato (Gb 1 và Gb 2) đều không tạo ra sản phẩm PCR với cặp mồi này (Hình 2). Hình 2. Khuyếch đại PCR đoạn gen Mn SOD bằng cặp mồi đặc hiệu của Ganoderma australe (FGau 1 và RGau 1) Giếng 1 và 2: Ganoderma australe sensulato (Ga 1 và Ga 2). [...]... nghiên cứu bằng mồi OPU1, mồi cho gen laccase và các mồi cho gen Mn SOD, chúng ta có thể thấy việc phân loại Ganoderma được hệ thống theo bảng sau: Bảng 1 Kết quả phân loại Ganoderma ở mức độ ADN Bảng trên cho thấy, nếu một mẫu Ganoderma chạy PCR với cặp mồi LA 1 và LA 2 tạo ra một hoặc hai băng có kích thước 217 hoặc 144 bp, không cho sản phẩm PCR với cặp mồi FGau 1 và RGau 1, tạo ra sản phẩm PCR có... nghiên cứu trước (4) kết quả khuyếch đại gen laccase với cặp mồi (LA 1 và LA 2) của Ganoderma australe và Ganoderma australe sensulato cho thấy chỉ tạo ra sản phẩm PCR (144 bp) với Ganoderma australe mà không tạo ra sản phẩm với Ganoderma australe sensulato Kết hợp kết quả đó với kết quả khuyếch đại gen Mn SOD cho thấy Ganoderma australe và Ganoderma australe sensulato, tuy tên khoa học trong phân loại. .. phẩm PCR với cặp mồi FGau 1 và RGau 1, cũng không tạo ra sản phẩm PCR với cặp mồi FGau 1 và RGau 2, thì có nhiều khả năng mẫu này sẽ thuộc Ganoderma tortnatum sensulato Việc phân loại Ganoderma applanatum sensulato và Ganoderma australe sensulato sẽ dựa trên các băng đặc hiệu của mồi OPU1 và sẽ được chúng tôi thực hiện trong các nghiên cứu tiếp theo KẾT LUẬN Đã khuyếch đại được gen Mn SOD của Ganoderma. .. nhiều, nhưng trình tự gen có sự khác biệt rõ rệt Hình 3 Khuyếch đại PCR đoạn gen Mn SOD bằng cặp mồi đặc hiệu của Ganoderma australe và Ganoderma lucidum (FGau 1 và RGau 2) Giếng 1 và 2: Ganoderma lucidum (Gl 1 và Gl 2) Giếng 3: Ganoderma australe (Gau) Giếng 4 và 5: Ganoderma tortnatum sensulato (Gc 1 và Gc 2) Giếng 6 và 7: Ganoderma applanatum sensulato (Gb 1 và Gb 2) Giếng 8 và 9: Ganoderma australe... 693 bp với cặp mồi FGau 1 và RGau 2, thì mẫu này sẽ thuộc Ganoderma lucidum Nếu một mẫu Ganoderma chạy PCR với cặp mồi LA 1 và LA 2 tạo ra một băng có kích thước 144 bp, tạo ra sản phẩm PCR có kích thước 461 với cặp mồi FGau 1 và RGau 1, tạo ra sản phẩm PCR có kích thước 755 bp với cặp mồi FGau 1 và RGau 2, thì mẫu này sẽ thuộc Ganoderma australe Nếu một mẫu Ganoderma chạy PCR với cặp mồi LA 1 và LA... Kết quả điện di cho thấy, cặp mồi FGau 1và RGau 2 cho phép khuyếch đại 1 đoạn của gen Mn SOD ở Ganoderma australe (Gau) với kích thước khoảng 755 bp; cặp mồi này cũng cho phép khuyếch đại 1 đoạn của gen Mn SOD ở Ganoderma lucidum (Gl 1 và Gl 2) với kích thước khoảng 693 bp Trong khi đó các mẫu Ganoderma tortnatum sensulato (Gc 1 và Gc 2), Ganoderma australe sensulato (Ga 1 và Ga 2) và Ganoderma applanatum... KẾT LUẬN Đã khuyếch đại được gen Mn SOD của Ganoderma australe và Ganoderma lucidum bằng các cặp mồi đặc hiệu Gen Mn SOD cũng là một chỉ thị phân tử có triển vọng để ứng dụng trong việc phân loại và định nhóm Ganoderma ở Việt nam LỜI CẢM ƠN Công trình này được hoàn thành với sự hỗ trợ của Chương trình Nghiên cứu Cơ bản trong lĩnh vực Khoa học Tự nhiên, hướng 8.2 This work was supported by the National... Boominathan, K., and Reddy A.C (1996) Isolation of Laccase Gene-Specific Sequences from White Rot and Brown Rot Fungi by PCR Applied and Environmental Microbiology 62(10), pp 1354-1363 4 Nguyễn Hoài Giang, Nguyễn Xuân Hùng, Trịnh Tam Kiệt, Lê Đình Lương (2005) Nghiên cứu khả năng phân loại chi Ganoderma bằng kỹ thuật phân tử RAPD -PCR và mồi đặc hiệu laccase Tạp chí Di truyền học và Ứng dụng Số 1, trang... không tạo ra sản phẩm PCR với cặp mồi này (Hình 3) Một điểm cần lưu ý là tất cả các mẫu Ganoderma đem tiến hành nghiên cứu với các mồi FGau 1, RGau1 và RGau 2 đều đã cho kết quả PCR dương tính với mồi ngẫu nhiên OPU 1 (4), nghĩa là ADN của tất cả các mẫu này đều được tách chiết tốt Như vậy, nguyên nhân của việc không tạo ra sản phẩm PCR ở đây là do trình tự gen Mn SOD các loài Ganoderma khác nhau là... of the Ganoderma complex by PCRing with the specific primers for superoxide dismutase gene Ganoderma species are known as the valuable herbs RAPD -PCR and PCR with the specific primers of laccase gene or the internal transcribed spacers (ITS) of the ribosomal gene are the most sensitive and efficient methods currently available for distinguishing between different strains of Ganoderma species Superoxide . quả nghiên cứu bằng mồi OPU1, mồi cho gen laccase và các mồi cho gen Mn SOD, chúng ta có thể thấy việc phân loại Ganoderma được hệ thống theo bảng sau: Bảng 1. Kết quả phân loại Ganoderma. và PCR với mồi đặc hiệu cho gen laccase để phân loại một số chi Ganoderma ở Việt nam (4). Từ những kết quả thu được, chúng tôi tiến hành nghiên cứu các chỉ thị phân tử mới nhằm phân loại Ganoderma. nhân chuẩn (5, 6). Trong bài báo này, chúng tôi giới thiệu phương pháp sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen Mn SOD để phân loại và xếp nhóm cho Ganoderma ở Việt nam. VẬT