XÂY DỰNG QUY TRÌNH TÁI SINH CÂY BÔNG (GOSSYPIUM HIRSUTUM) BẰNG CÁCH TẠO ĐA CHỒI Trương Thu Thủy, Đinh Thị Phòng, Lê thị muội, Lê Trần Bình Viện Công nghệ Sinh học (IBT) Lê quang Quyến Viện Nghiên cứu Cây Bông và Cây Có Sợi (RICFC) 1. GIỚI THIỆU Cây bông (Gossypium hirsutum. L) là nguồn cung cấp sợi may mặc quan trọng. Song năm 2000, Việt Nam mới chỉ sản xuất được 8 ngàn tấn, đáp ứng được 10% nhu cầu. Theo chương trình phát triển ngành dệt may, Việt Nam đến năm 2005 phải sản xuất 150.000 tấn sợi các loại và đến năm 2010 chỉ tiêu đó là 300.000 tấn [7, 9]. Nguyên nhân làm sản lượng thấp chủ yếu là bông bị sâu bệnh và hạn hán. Vì thế một trong những chiến lược để tăng sản lượng bông là tạo ra những giống bông có khả năng kháng sâu và chịu hạn. Chuyển gen là một phương pháp để tạo ra những giống bông như vậy. Hai phương pháp chuyển gen đang được sử dụng nhiều ở thực vật nói chung và cây bông nói riêng là súng bắn gen và Agrobacterium, song phương pháp chuyển gen thông qua Agrobacterium là có hiệu quả nhất. Tuy nhiên để chuyển được gen bằng súng bắn gen/Agrobacterium thì trước tiên cần phải thiết lập và tối ưu cho được hệ thống nuôi cấy và tái sinh cây in vitro. Khả năng nuôi cấy và tái sinh cây tuỳ thuộc vào các kiểu gen của từng loại đối tượng cây trồng. Cho đến nay, việc tái sinh đối với cây bông còn rất hạn chế và mới chỉ thành công ở một vài giống như Coker, Deltapine 15 và Jinmian [2, 3, 10, 11, 12 ]. Như vậy, với mục tiêu tái sinh được cây và chuyển gen có định hướng như kháng sâu bệnh và chịu han trực tiếp vào những giống có năng suất cao, chất lượng sợi tốt và đang trồng phổ biến, một phương pháp tái sinh hiệu quả và không phụ thuộc vào nguồn gốc di truyền là rất cần thiết. Đó là phương pháp tái sinh thông qua tạo đa chồi từ phôi mà trong nghiên cứu này, chúng tôi đã xây dựng được một quy trình áp dụng cho giống bông 254, một giống có tuổi đời trung bình, phẩm chất tốt và thường được dùng làm bố mẹ trong các phép lai chọn giống. 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Khử trùng hạt và chuẩn bị nguyên liệu tái sinh cây Giống bông 254 được Viện Nghiên cứu Cây Bông và Cây Có Sợi cung cấp. Sau khi đã bóc vỏ cứng, hạt được khử trùng bề mặt bằng cồn 70% trong 1 phút, tiếp theo lắc trong dung dịch javen 60% (Hoá chất Việt Trì) trong 20 phút và rửa 5 lần bằng nước cất vô trùng. Cuối cùng thấm khô hạt bằng giấy lọc khử trùng. Tách bỏ lá mầm và thu lấy phôi bao gồm cả đỉnh rễ và đỉnh chồi (hình 1A). 2.2. Cảm ứng đa chồi và tái sinh cây Phôi được đặt lên các môi trường cảm ứng tạo đa chồi C1- C20 của các tổ hợp hoóc môn khác nhau. Sau 10 ngày, đỉnh chồi của phôi được cắt với độ dài trung bình 2 mm và cấy lên các môi trường tạo đa chồi S1-S5. Thành phần các môi trường như trong bảng 1. Đánh giá khả năng tạo đa chồi sau 5 tuần. Tách chồi đơn từ các cụm chồi và cấy chuyển lên các môi trường kéo dài chồi E0-E2. Khi chồi cao khoảng 2-4 cm thì kích thích tạo rễ trên các môi trường R1-R2. 2.3. Môi trường và điều kiện nuôi cấy Các tổ hợp môi trường nuôi cấy được trình bày trong bảng 1. Bảng 1: Thành phần các môi trường tái sinh cây và tạo đa chồi 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Cảm ứng tạo đa chồi Trên môi trường không có chất điều khiển sinh trưởng C0, phôi nhanh chóng vươn dài thành cây con và phát triển lá. Trong khi đó, trên tất cả cảc môi trường cảm ứng đa chồi (C1-C20), 100% phôi không phát triển thành cây hoàn chỉnh mà phình to, phát sinh mô sẹo màu trắng. Như vậy, sự kết hợp 2,4-D, BAP và NAA đã có tác dụng làm kìm hãm quá trình biệt hoá, tạo ra nhiều tế bào liên tục phân chia. Trong thí nghiệm của chúng tôi thì môi trường C16 cho mức độ cảm ứng vừa phải và đồng đều nhất. Sau 10 ngày trên môi trường C16, chiều cao trung bình của phôi là 1,5 cm, dao động từ 1cm đến 4cm. Đỉnh chồi được cắt làm nguyên liệu tạo đa chồi. 3.2. Sự hình thành cụm chồi Các đỉnh chồi của phôi (hình 1B) được đặt lên các môi trường kích thích tạo đa chồi S1-S5 chứa các tổ hợp khác nhau của Kinetin, BAP và NAA. Sau 5 tuần, chồi mới chỉ xuất hiện ở dạng 1 chồi (đơn chồi), hoặc dạng 2-3 chồi (cụm 2-3 chồi). Từ bảng 2, một số mẫu vật ngả màu nâu, ít khả năng sống sót có thể do đỉnh chồi có kích thước rất nhỏ và được cấy trên môi trường với mật độ cao, nên mẫn cảm đối với thao tác nuôi cấy và các hợp chất phenol do chính mẫu vật tiết ra. Tỉ lệ sống sót của mẫu vật sẽ tăng lên khi kỹ thuật nuôi cấy được tối ưu hoá. Môi trường tạo đa chồi tốt phải cho tỉ lệ chết thấp và tỉ lệ tạo cụm chồi cao. Môi trường S1, S2 và S5 cho tỉ lệ chết gần tương đương nhau (20, 28 và 29%), nhưng môi trường S2 và S5 cho tỉ lệ tạo cụm 2-3 chồi cao hơn hẳn (46, 47% so với 33%). Bảng 2: Sự hình thành chồi sau 5 tuần nuôi cấy Sau giai đoạn 5 tuần, các đỉnh chồi đã hình thành 0-3 chồi, đều được cấy chuyển lên chính môi trường tạo đa chồi ban đầu là S2-S4 (bỏ qua môi trường S1), với mục đích tiếp tục thu được cụm chồi. Ba tuần sau, các cụm chồi trung bình 4,5 chồi/cụm và nhiều nhất là 10 chồi/cụm đã hình thành (bảng 3). Như vậy, sau 5 tuần trên môi trường tạo đa chồi thì mới chỉ thu được 0-3 chồi từ mỗi mẫu vật, còn sau 8 tuần với một lần thay mới môi trường đã thu đươc các cụm chồi có hệ số chồi cao hơn (hình 1C). Có những mẫu vật không có chồi nào trước khi được cấy chuyển nhưng lại tạo cụm chồi sau khi cấy chuyển. Hầu hết các môi trường S cho tỉ lệ tạo đa chồi trên tổng số mẫu vật cấy chuyển cao, từ 78%-93%, trong đó cao nhất là S5 (93%). Kết hợp kết quả bảng 2 và 3, S5 được chọn là môi trường tối ưu cho quy trình tạo đa chồi áp dụng cho biến nạp gen sau này. Bảng 3: Sự hình thành cụm chồi sau 8 tuần nuôi cấy Hình 1: Quá trình tạo đa chồi từ phôi: A: Phôi B: Đỉnh chồi C: Cụm chồi hình thành sau khi cấy chuyển 3.3. Sự phát triển chiều cao của chồi Kết quả kéo dài chồi được thể hiện trong bảng 4. Các chồi kích thước từ 1 cm trở lên được coi là có cảm ứng kéo dài. Một số chồi hình thành rễ ngay trên những môi trường này. Bảng 4: Kết quả kéo dài chồi Như vậy là các môi trường không có hoóc môn hoặc có nồng độ hoóc môn Kinetin và BAP thấp (như bảng 1) đã có tác dụng kéo dài chồi. Môi trường E0 cho tỉ lệ kéo dài chồi cao nhất là 30%, chứng tỏ rằng hàm lượng auxin và cytokinin nội sinh tạo ra trong quá trình hình thành và phát triển của chồi là rất lớn. 3.4. Sự hình thành rễ [...]... vẹn của quy trình tái sinh cây bằng cách trồng cây trên đất và theo dõi sự sinh trưởng, phát triển và sinh sản của cây tái sinh, kết quả của chúng tôi trên đây đã đưa ra một triển vọng là tái sinh được giống bông 254 với tỉ lệ khá cao Ngoài ra, tái sinh qua tạo đa chồi cũng có thể áp dụng cho nhiều giống bông khác KẾT LUẬN Đã nghiên cứu phát triển được quy trình tái sinh in vitro ở cây bông bằng phương... thành rễ diễn ra khá dễ dàng đối với chồi bông trên cả hai môi trường tạo rễ (bảng 4) Môi trường R1 với hàm lượng 0,2mg/L NAA và 1g/L than hoạt tính cho sự tạo rễ tốt nhất là 100% Bảng 5: Sự hình thành rễ 3.5 Quy trình tái sinh cây bông bằng tạo đa chồi Từ những kết quả nhận được trên đây chúng tôi xây dựng quy trình tái sinh cây bằng phương pháp tạo đa chồi đối với bông giống 254 như sau: Phôi được tách... khó khăn cho việc chuyển gen thành công ở cây bông Mặt khác những giống đã được công bố là tái sinh được như Coker 312, Coker 210 là những giống hầu như không được sản xuất ở Việt Nam Vì thế việc xây dựng một quy trình tái sinh cây cho những giống bông Việt Nam là yêu cầu thực tiễn Xây dựng quy trình tái sinh cây thông qua phương pháp tạo đa chồi đối với cây bông có thể khắc phục được những khó khăn... có mô phân sinh sẵn có của cây con để tăng tỉ lệ tái sinh nên tỉ lệ biến nạp cũng đã được một phần cải thiện Quy trình tạo đa chồi từ phôi do chúng tôi thiết lập không những đã có hệ số tạo chồi tương tự, mà còn bỏ qua được giai đoạn tạo cây con 35 ngày tuổi hay quá trình nuôi cấy liên tục mô phân sinh in vitro trong 28 ngày để tạo nguồn mẫu vật, và do đó rút ngắn được thời gian tái sinh cây Mặc dù... cộng sự năm 1997 công bố đã thành công trong việc tạo đa chồi từ mấu lá mầm cây con 35 ngày tuổi với hệ số 4-5 chồi/ mẫu vật [1] Năm 1998, Hemphill và cộng sự công bố tái sinh được cây bằng cách tạo chồi, cũng duới tác động của BAP từ những mô phân sinh có sẵn của cây con 28 ngày tuổi được tạo ra trong ống nghiệm bằng cách duy trì nuôi cấy các mô phân sinh [7] Ngoài đỉnh chồi, các mẫu vật còn là các... khắc phục những khó khăn của việc tái sinh theo con đường tạo phôi sôma ở loại cây khó nuôi cấy này Hệ số chồi và tỉ lệ tái sinh khá cao chứng tỏ tính khả thi của công tác chuyển nạp gen vào cây bông Quy trình đang áp dụng để biến nạp gen thông qua Agrobacterium TÀI LIỆU THAM KHẢO: 1 Agrawal D.C 1997 In vitro induction of multiple shoots and plant regeneration in cotton (Gossypium hirsutum L.) Plant Cell... cấy đỉnh chồi kích thước 2 mm trên môi trường tạo đa chồi có 1mg/L Kinetin, 2mg/L BAP và 0,1mg/L NAA trong thời gian 8 tuần với một lần cấy chuyển, thu được các cụm chồi Tiếp theo, môi trường không có hoóc môn sinh trưởng được dùng để chồi phát triển chiều cao Cuối cùng, tạo rễ trên môi trường có 0,2 mg/L NAA Trên đối tượng bông vải, phương pháp tái sinh cây từ phôi soma còn rất hạn chế trên thế giới... bằng phương pháp tạo đa chồi từ phôi giống bông vải 254 Phôi bông được nuôi cấy trên môi trường MS có tổ hợp 0,4mg/L 2,4-D, 1,5mg/L BAP và 0,1mg/L NAA, sau đó đỉnh chồi được cấy chuyển lên môi trường có 1mg/L Kinetin, 2mg/L BAP và 0,1mg/L NAA để tạo cụm chồi Chồi phát triển kéo dài trên môi trường không có chất điểu khiển sinh trưởng Sau cùng một lượng rất nhỏ NAA được dùng để kích thích tạo rễ Kết quả... cotton (Gossypium hirsutim L.) Plant Cell Reports 17: 273-278 8 Nguyễn Hữu Bình Kế hoạch phát triển bông đến 2005-2010 và những giải pháp chủ yếu 2001 Công ty Bông Việt Nam Tổng Công ty Dệt-May Việt Nam 2 9 Quy t định số 55/2001/QĐ-TTg ngày 23/4/2001 của Thủ tướng Chính phủ 10 Rajasekaran K 1996 Regeneration of plants from cryopreserved embryogenic cell suspension and callus cultures of cotton (Gossypium. .. Trolinder, N 1987 Somatic embryogenesis and plant regeneration in cotton (Gossypium hirsutum L.) Plant Cell Reports 6:231-234 12 Umbeck P 1985 Genetically transformed cotton (Gossypium hirsutum L.) plants Biotechnology 5: 263266 SUMMARY Developing a plant regeneration system via in vitro induction of multiple shoots in cotton (Gossypium hirsutum L ) To facilitate the transformation of some important . 3.5. Quy trình tái sinh cây bông bằng tạo đa chồi Từ những kết quả nhận được trên đây chúng tôi xây dựng quy trình tái sinh cây bằng phương pháp tạo đa chồi đối với bông giống 254 như. XÂY DỰNG QUY TRÌNH TÁI SINH CÂY BÔNG (GOSSYPIUM HIRSUTUM) BẰNG CÁCH TẠO ĐA CHỒI Trương Thu Thủy, Đinh Thị Phòng, Lê thị muội, Lê Trần Bình Viện Công nghệ Sinh học (IBT) Lê quang Quy n. của quy trình tái sinh cây bằng cách trồng cây trên đất và theo dõi sự sinh trưởng, phát triển và sinh sản của cây tái sinh, kết quả của chúng tôi trên đây đã đưa ra một triển vọng là tái sinh