THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN YẾU TỐ TĂNG TRƯỞNG NGUYÊN BÀO SỢI 10 CỦA NGƯỜI (HFGF-10 -HUMAN FIBROBLAST ROWTH FACTOR -10) Ở TẾ BÀO ĐỘNG VẬT BẬC CAO Nguyễn Bích Nhi Viện Công nghệ Sinh học Masashi Suzuki National Istitute of Bioscience and Human Technology, Tsukuba, Japan ĐẶT VẤN ĐỀ Các yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi FGFs (Fibroblast Growth Factor) polypeptide thuộc nhóm cytokine, tiết tế bào động vật, có hoạt tính gây phân bào mạnh Các thành viên nhóm FGF đóng vai trị quan trọng nhiều q trình sinh lí q trình sinh trưởng, biệt hóa tế bào, hình thành mơ, thành mạch máu, sửa chữa làm lành vết thương (Mc Keehan cs., 1998) Nhiều thành viên nhóm FGF có chứa đoạn tín hiệu peptide mã hóa cho protein tiết FGF-10 thành viên thứ 10, dược phát Yamasaki cs., 1996 cDNA hFGF-10 mã hóa cho protein gồm 208 acid amin, 40 acid amin đầu (đầu N) có tính kị nước cao, đoạn có vai trị tính hiệu peptide (Yamasaki cs., 1996, Emoto cs., 1997 Do FGF-10 có khả tiết Nhiều thành viên nhóm FGF FGF-5 (Bates cs., 1991; Ozawa cs., 1998, Clements cs., 1993), FGF-6 (Asada cs), FGF-7 (MacArthur cs., 1995), FGF-9 (Santos - Ocampo cs., 1996) có chứa vị trí N-glyccosyl số thành viên nhóm FGF tinh chế dạng glycosyl hóa Để nghiên cứu, tìm hiểu tính chất FGF-10 biến đổi liên kết với mạch carbohydrate , sử dụng thiết kế vector pcDNA3.1(-) Myc-His (Invitrogen) để biểu hFGF-10 tế bào động vật có vú VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ARN tổng số từ não người (Toyobo) Vector tách dòng PCR -TRAP (GenHunter) Vector biểu pcDNA3.1(-)MycHis Version B (Invitrogen) Làm sản phẩm PCR: sử dụng PCR QiaQuick PCR Kit (Qiagen) Tách ADN plasmid sử dụng MiniPrep Kit (PE Applied Biosystem) Xác định trình tự ADN sử dụng thiết bị ABI 310 PRISM Genetic Analyzer (Perkin Elmer) KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Thiết kế cặp mồi để biểu hFGF-10 tế bào động vật có vú: Dựa vào trình tự tồn đoạn gen hFGF-10 (số đăng kí Gen Bank AB 002097 DDBJ), cặp mồi để nhân hFGF-10 thiết kế sử dụng vector pcDNA3.1(-) Myc-His để biểu tế bào động vật có vú với đầu 5' gắn thêm vị trí cắt enzyme giới hạn XhoI đầu 3' gắn vị trí cắt enzym HindIII Trình tự cặp mồi sau: Phản ứng RT-PCR (Reverse transcriptase - PCR) : Để thu nhận cDNA (complementary DNA - ADN bổ trợ) từ ARN tổng số tách từ não người cung cấp hãng Toyobo, phản ứng phiên mã ngược RT (Reverse transcriptase) tiến hành tổng thể tích 50 l với thành phần phản ứng bao gồm 10l đệm X RT, 2l mồi ngẫu nhiên -hexamer (60 ng/l), 5l DTT - dithio threitol (0.1 M), 8l hỗn hợp dNTPs (2.5 mM), 0.5l RNasin (40 U/l), 2l enzyme phiên mã ngược -MMLV Reverse transcriptase (200 U/l), 18.5l nước cất vô trùng 4l ARN tổng số (250 ng/l) Phản ứng tiến hành 37oC 75 phút Sau hỗn hợp phản ứng (cDNA tổng hợp) pha loãng 10 lần nước cất bảo quản -20oC Phản ứng PCR tiến hành sử dụng cDNA vừa tổng hợp làm mẫu (template) để nhân toàn đoạn gen hFGF-10 Thành phần phản ứng PCR tổng thể tích 25l bao gồm: 11l nước cất vơ trùng, 2.5l 10 X đệm Pfu, 2l dNTPs (2.5mM), 8l sản phẩm phản ứng RT pha loãng 10 lần, 0.5l mồi xuôi (10pmol), 0.5l mồi ngược (10pmol) 0.5l Pfu polymerase (0.5U/l) Chương trình chạy PCR: điều kiện để chạy PCR tối ưu hóa sau: Biến tính 94oC phút; 40 chu trình : 94oC 45 giây, 55oC 45 giây 72oC phút; lần kéo dài chuỗi cuối 72oC 10 phút Sản phẩm phản ứng PCR kiểm tra điện di gel agarose 1% (hình 1) Kết điện di hình cho thấy sản phẩm PCR băng đậm đặc hiệu, có kích thước khoảng 650 bp tương đương với kích thước hFGF-10 có cộng thêm vị trí cắt enzyme giới hạn thiết kế Để kiểm tra xem sản phẩm PCR nhận có phải hFGF-10 hay không, sản phẩm PCR sau tinh chế Qia Quick Kit cắt enzyme NsiI ScaI Phản ứng cắt kiểm tra tiến hành tổng thể tích 10l với thành phần sau: 1l đệm 10X NsiI (hoặc đệm NE-II ScaI), 2l sản phẩm PCR, 0.8l NsiI enzyme Hỗn hợp phản ứng ủ 37C Sản phẩm thủy phân điện di để kiểm tra gel agarose 1% để kiểm tra (hình 2) Hình1: Điện di sản phẩm PCR gel agarose 1% Đường chạy số 1: Thang ADN chuẩn bậc thang 123bp, đường chạy số 2: sản phẩm PCR; đường chạy số 3: thang ADN chuẩn /HindIII Hình Kiểm tra cắt sản phẩm PCR enzyme ScaI Đường chạy số 1: Thang ADN chuẩn bậc thang 123 bp; đường chạy số 2: sản phẩm PCR sau bị cắt ScaI Kết nhận hình cho thấy sản phẩm PCR sau bị thủy phân enzyme ScaI có điểm cắt trình tự hFGF-10 vị trí 273 sản phẩm PCR sau xử lí ScaI chia thành băng nhỏ có kích thước khoảng 273 357 bp (hình 3, giếng 2) Như sơ cho sản phẩm PCR nhận có nhiều khả hFGF10 Tách dịng hFGF-10: Để kiểm tra trình tự sản phẩm PCR, vector tách dòng (PCR-TRAP Cloning System, version 3.0- GenHunter Corporation) Sản phẩm PCR gắn vào vector TRAP tổng số 10l với thành phần sau: 2l PCR-TRAP vector chuẩn bị sẵn sàng để gắn đoạn gen (insert), 1l 10X đệm gắn (ligation buffer), 2.5l sản phẩm PCR 1l T4 -DNA ligase Phản ứng tiến hành 16C, qua đêm (khoảng 16 giờ) Sau hỗn hợp phản ứng biến nạp vào tế bào khả biến chủng vi khuẩn GH với thành phần phản ứng bao gồm: 20l tế bào khả biến GH , 4l hỗn hợp phản ứng để đá (0C) 45 phút Sốc nhiệt 42C phút để vào đá phút cho thêm vào 0.4 ml môi trường LB (Luria-Bertani) lỏng, trộn nuôi cấy lắc (200 vịng/phút) tiếp 37C Sau cấy trải dịch nuôi cấy lên đĩa petri LB đặc có bổ sung tetracycline (nồng độ cuối 20 g/ml) Để đĩa petri qua đêm tủ ấm 37C qua đêm Hôm sau kiểm tra đĩa thấy mọc khuẩn lạc trắng Kiểm tra gắn sản phẩm PCR vào vector cách phân tích khuẩn lạc Lấy khuẩn lạc đầu cho vào ống eppendorf vơ trùng có chứa 50l đệm TE (10mM Tris, 1mM EDTA pH8) có bổ sung 0.1% Tween 20 Trộn ủ 95C 10 phút Li tâm nhanh Lấy 2l dịch làm mẫu để chạy PCR với thành phần sau: 2l 10 X đệm PCR, 2ldNTPs (200 mol), 2l loại Lgh Rgh mồi cung cấp Kit, 0.2l Taq DNA polymerase Chương trình PCR sau: 30 chu trình 94C 30 giây, 52C 40 giây , 72C phút; 72C phút kết thúc 4C Sau chạy PCR, phân tích sản phẩm điện di gel agarose 1.5% (hình 3) Hình Điện di phân tích khuẩn lạc phương pháp PCR Đường chạy số 1: Thang ADN chuẩn /HindIII; đường chạy số 2,3: sản phẩm PCR khuẩn lạc 2; đường chạy số 4:thang ADN chuẩn bậc thang 123 bp Kết phân tích khuẩn lạc cho thấy mẫu ADN khuẩn lạc cho băng đặc hiệu có kích thước khoảng 770bp tương ứng với kích thước đoạn gen hFGF-10 cộng 120bp phần thêm vector TRAP hướng dẫn sử dụng vector Như ADN khuẩn lạc có mang đoạn gen cần gắn Đối với mẫu khuẩn lạc 2, sản phẩm PCR băng có kích thước nhỏ khơng với kích thước đoạn gen cần gắn ADN khuẩn lạc khơng chứa đoạn gen cần gắn Sau dã xác định khuẩn lạc có chứa đoạn gen nhân được, khuẩn lạc nuôi môi trường LB lỏng có bổ sung tetracycline tách ADN plasmid sử dụng kit MiniPrep, ADN sau kiểm tra OD260/280nm để định lượng sử dụng 500 ng để xác định trình tự Kết cho thấy sản phẩm PCR nhân có trình tự ADN hồn tồn trùng khớp với trình tự gen hFGF-10 ngân hàng gen, số đăng kí AB 002097 DDBJ Như việc tách dòng gen hFGF-10 thực Gắn gen hFGF-10 vào vector biểu pcDNA3.1()Myc-His: pcDNA3.1(-) Myc-His (Invitrogen) vector 5.5 kb thiết kế để biểu protein tái tổ hợp tế bào động vật có vú Vector có vị trí đọc để gắn đoạn gen đích với đầu C tận polypeptide có gắn đuôi Histidine (His tag) Myc (C-myc) epitope cho phép xác định tinh chế hiệu protein tái tổ hợp Promotor vector -human cylomegalovirus (CMV) cho phép biểu cao nhiều loại tế bào động vật có vú Vector biểu pcDNA3.1(-) Myc-His vector tách dịng có chứa đoạn gen hFGF-10 xử lí XhoI HindIII, sau sản phẩm vector gen xử lí enzyme kiểm tra gel agarose 1% tinh chế phương pháp gel, sử dụng Qia Quick Kit Sau tinh xác định hàm lượng, gen gắn vào vector nhờ phản ứng gắn sử dụng enzyme T4-ligase với thành phần sau: 0.75l đệm gắn T4, 3l vector xử lí (250ng/l), 3.5l gen hFGF-10 (insert) xử lí (60ng/l) 0.25l T4-ligase Phản ứng thực 16C qua đêm cấy trải trênaTiếp hỗn hợp phản ứng biến nạp vào tế bào khả biến DH5 đĩa LB có bổ sung ampicilline (50g/ml) ni tủ ấm 37C qua đêm Các khuẩn lạc nuôi nhân mơi trường LB lỏng có bổ sung ampicilline tách ADN plasmid Kiểm tra gắn gen vào vector biểu pcDNA3.1(-)Myc-His cách xử lí ADN plasmid tách enzyme XhoI HindIII Kết thể hình Hình Các ADN plasmid xử lí enzyme XhoI HindIII Đường chạy số 1-5: ADN plasmid từ 1-5 xử lí XhoI HindIII; đường chạy số 6: Thang ADN chuẩn bậc thang 123bp Kết hình cho thấy trừ plasmid số (đường chạy 4) khơng chứa đoạn insert, plasmid cịn lại có chứa đoạn gen có kích thước khoảng 650 bp tương ứng với hFGF-10 Như việc gắn hFGF-10 vào vector biểu pcDNA3.1(-)myc.his thành công ADN plasmid sử dụng để chuyển gen hFGF10 vào tế bào động vật có vú (Cos-7- tế bào thận khỉ) sử dụng hóa chất chuyển gen (Lipo Fectamin-2000, SuperFect ) KẾT LUẬN Đã tách dòng gen hFGF-10 từ ARN tổng số não người phản ứng RT-PCR Đã thiết kế vector biểu pcDNA3.1(-)Myc-His có gắn đoạn gen hFGF-10 để biểu tế bào động vật có vú TÀI LIỆU THAM KHẢO Asada M., Yoneda A., Oda Y., Ota K., Ozawa K., Fukuta K., Omae M., Orikasa N., Suzuki M., Oka S., Makino T and Imamura T (1999) Growth Factor 16, 293303 2.Bates B., Hardin J., Zhan X., Drickamer K., and Goldfarb M.(1991) Mol.Cell Biol 11,1840-1845 Clements D.A., Wang J.K., Dionne C.A and Goldfarb M (1993)Oncogene 8, 1311-1316 Emoto H., Tafashira S., Mattei M.G and Yamasaki M, (1997) J Biol Chem Vol 272, No.37, 23191-23194 Hsu Y.R., Hsu E.W., Katta V., Brankow D., Tseng J., Hu S., Morris C.F., Kenney W.C and Lu H.S (1998) Protein Expr.Purf 12, 189-200 MacArthur C.A., Lawshe A., Shankar D.B., Heikinheimo M., Shackleford G.M (1995) Cell Growth Differ 6,817-825 McKeehan W.L., Wang F and Kan M (1998) Prog.Nucleic Acid Res Mol Biol 59 135-176 Revest J.M., DeMoerlooze L and Dickson C (2000) J.Biol.Chem 275, 8083-8090 Santos-Ocampo S., Colvin J.S., Chellaiah A and Ornitz D.M (1996) J.Biol.Chem 19, 1726-1731 10 Yamasaki M., Miake A., Tagashira S and Itoh N (1996) J.Biol.Chem 271,15918-15921 11 Yoneda A., Asada M., Suzuki M and Imamura T (1999)Biotechniques 27, 576-590 SUMMARY Construction of mammalian expression vector For human fibroblast growth factor-10 (hfgf-10) Nguyen Bich Nhi Institute of Biotechnology (IBT), NCST Masashi Suzuki National Institute of Bioscience and Human Technology (NIBH), Tsukuba, Japan Full length human Fibroblast Growth Factor (hFGF-10) cDNA (650 bp) was amplified from human brain total RNA (Toyobo) by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) using synthetic oligonucleotide primers These primers contain sequences that flank both ends of the full length hFGF-10 (amino acid 1-208) with additional XhoI and HindIII sites located at their 3’ and 5' ends, respectivetly The amplified product was sub-cloned into the PCR-TRAP (GenHunter) cloning vector and the DNA sequence was verified by ABI310-PRISM Genetic Analyzer as the hFGF-10 (acession number AB 002097 in the DDBJ and GenBank Nucleotide Sequence Databases) For expression of recombinant hFGF-10 protein in mammalian cells, we used an expression vector, pcDNA3.1(-)Myc-His (Invitrogen) which is designed to introduce a C-terminal peptide containing a myc sequence and polyhistidine metal -binding sequence tags into the target protein for efficent detection and purification The amplified product was digested with XhoI and HindIII restriction enzymes, purified by QiaQuick Kit (Qiagen) and was ligated at XhoI and HindIII sites of the corresponding sites of the enzyme-digested pcDNA3.1(-)Myc-His vector to allow production of recombinant protein in mammalian cells from T7 promoter The ligation product then was transformed into the DH5- competent cells and cultured at 37C overnight The plasmid DNAs were extracted from the culture of white colonies by using MiniPrep Kit (PE Applied Biosystem) and the recombinant expression pcDNA 3.1(-) Myc-His vector bearing hFGF-10 gene was confirmed by XhoI/HindIII enzyme digestion of plasmid DNAs Người thẩm định nội dung khoa học: TS Nguyễn Thị Ngọc Dao  ... Fectamin-2000, SuperFect ) KẾT LUẬN Đã tách dòng gen hFGF -10 từ ARN tổng số não người phản ứng RT-PCR Đã thiết kế vector biểu pcDNA3.1(-)Myc-His có gắn đoạn gen hFGF -10 để biểu tế bào động vật có vú TÀI LIỆU... tổ hợp Promotor vector -human cylomegalovirus (CMV) cho phép biểu cao nhiều loại tế bào động vật có vú Vector biểu pcDNA3.1(-) Myc-His vector tách dịng có chứa đoạn gen hFGF -10 xử lí XhoI HindIII,... cứu, tìm hiểu tính chất FGF -10 biến đổi liên kết với mạch carbohydrate , sử dụng thiết kế vector pcDNA3.1(-) Myc-His (Invitrogen) để biểu hFGF -10 tế bào động vật có vú VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN