PHÂN LOẠI CHỦNG VI KHUẨN PS7-1 CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG FUSARIUM OXYSPORUM TRÊN CƠ SỞ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ NUCLEOTID GEN 16S-ARN RIBOSOM Nguyễn Thị Tuyết Nhung, Nguyễn Minh Anh, Lê Thanh Hịa, Nguyễn Ngọc Dũng Viện Cơng nghệ Sinh học Cây lúa nước đã, trồng số Việt Nam Chiến lược hướng tới nông nghiệp bền vững sinh thái Việt nam thiết lập Để góp phần thực chiến lược này, vi khuẩn có ích cho lúa đồng sông Hồng quan tâm nghiên cứu năm qua (Nguyễn Ngọc Dũng cộng sự, 2000) Một nhóm vi khuẩn hữu ích cho lúa cần khai thác vi khuẩn pseudomonad sinh huỳnh quang chúng coi tác nhân sinh học tiềm phòng chống vi nấm gây bệnh trồng (O,Sullivan cộng sự, 1992, Berg cộng sự, 2000) Các chủng pseudomonad sinh huỳnh quang vùng rễ lúa phân lập chọn lọc theo khả đối kháng Fusarium oxysporum, tác nhân gây bệnh khô vằn lúa (Nguyễn Thị Tuyết Nhung cộng sự, in) Do có đặc điểm riêng hình thành suốt qúa trình tiến hố nên gen mã axit ARN ribosom (ARNr) vi sinh vật nhân sơ, đặc biệt gen 16S- 23 S-ARNr, sử dụng công cụ việc phân loại xác định mối quan hệ di truyền chủng vi khuẩn ( Woese, 1987) Theo Ludwig Schleifer ( 2000) có tới 16000 gen 16S-ARNr từ chủng vi khuẩn xác định trình tự nucleotid Trong báo này, vị trí phân loại chủng Ps7-1 trình bày sở phân tích trình tự nucleotid gen 16S-ARN ribosom (16S-ARNr) I NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Vi sinh vật: Chủng phân lập Ps7-1 có nguồn gốc từ đất bám rễ lúa Kim Chung, Đông Anh, Hà Nội cho khả đối kháng F oxysporium cao điều kiện in vitro (Nguyễn Thị Tuyết Nhung cộng sự, in) chủng E coli DH5 sử dụng Các phương pháp phân loại: a Phương pháp phân loại theo kiểu hình: Phương pháp phân loại vi khuẩn chuẩn hoá API 20NE (BioMerieux Marcy, Pháp) sử dụng Theo nhà cung cấp, hệ thống API 20NE dùng để phân loại nhóm vi khuẩn hình que, Gram âm, khơng thuộc Họ Enterobactieraceae Ngồi đặc tính theo API 20NE, đặc điểm kỵ khí khơng bắt buộc kháng tetraxyclin xác định Đặc điểm kỵ khí khơng bắt buộc tiến hành theo phương pháp cấy thẳng đứng vào mơi trường LB rắn có chiều cao 10 cm ống nghiệm; mẫu ủ 30oC đọc kết sinh trưởng sau 24 48 ủ Tính mẫn cảm tetraxyclin (30g/ml) tiến hành theo phương pháp Krieg Doebereiner (1984) Theo đó, tế bào Ps7-1 nuôi qua đêm ria môi trường LB rắn, sau đặt đĩa giấy ( : mm) thấm đậm dung dịch tetraxyclin lên Chủng E coli DH5 sử dụng làm đối chứng Quan sát sinh trưởng vi khuẩn xung quanh đĩa giấy thấm sau 24 ủ b Phương pháp phân loại theo kiểu gen: -Thu ADN tổng số: ADN tổng số tách chiết theo phương pháp Masterson cộng (1985) -Thu nhận gen 16S-ARNr: Gen 16S-ARNr thu nhận phản ứng nhân gen (PCR) với cặp mồi có trình tự sau Mồi thuận chiều Prf: 5,-GAGTTTGATCATGGCTAA-3,., tương ứng với vị trí nucleotid 7-26 gen 16S-ARNr từ E coli; mồi nghịch chiều Prr: 5,- AGGAGGTGATCCAGCC-3,, tương ứng với vị trí 1540-1524 từ E coli, GensetOligos Singapore, cung cấp Hỗn hợp phản ứng nhân gen tích 25 l với thành phần: 16,7 l nước ion, 2,5 l đệm Taq(10x), 2,5 l dung dịch dNTP (10mM), 1,0 l dịch mồi Prf (10mM), 1,0 l dịch mồi Prr (10mM), 1,0 l dịch ADN khuôn 0,3 l Taq Polymerase Phản ứng thực với chu trình nhiệt sau: Giai đoạn đầu, ADN biến tính 95o C phút 30 giây, tiếp tục biến tính 940 C phút, mồi gắn nhiệt độ 520 C phản ứng kéo dài chuỗi 720 C phút 20 giây Giai đoạn lặp lại 30 lần chu kỳ nhiệt giống giai đoạn đầu, khác chỗ ADN biến tính lần nhiệt độ 940 C phút, tiếp sau pha cuối phản ứng kéo dài chuỗi trì 72 C 10 phút sản phẩm bảo quản 40 C Kết phản ứng kiểm tra điện di agarose 0,8% Sản phẩm nhân gen gắn vào vectơ pCR2.1 theo dẫn nhà cung cấp TA Cloning Kit, Invitrogen Vectơ pCR2.1 tiếp nhận sản phẩm PCR chuyển nạp vào dòng tế bào INVaF’ chọn lọc khuẩn lạc theo phương pháp kháng sinh thị màu (SAMBROOK RUSSELL, 2001) ADN plasmid tái tổ hợp tách chiết với hoá chất QIAprep Spin Plasmid Extraction Kit (QIAGEN Inc.) Độ dài sản phẩm dịng hố kiểm tra thạch agarose 0.8%, sau cắt ADN plasmid tái tổ hợp enzym giới hạn EcoRI Giải trình trình tự chuỗi nucleotit xử lý số liệu: Chuỗi ADN chứa gen 16S- ARNr nột phần plasmid giải trình tự máy giải trình tự tự động ABI 377 PRISM (Perkin- Elmer) Mồi xuôi M13F (5’GTTTTCCCAGTCACGAC3’) mồi ngược M13R (5’CAGGAAACAGCTATGAC3’) dùng giải trình tự chuỗi cố định vectơ nằm gần hai đầu biên ADN tái tổ hợp cần giải trình Trong trình giải trình, mồi khác ký hiệu Seq16SF (5’CAGTGGGGAATATTGGACAAT 3') nằm cách đầu 5’ đoạn gen 16S ARNr nghiên cứu khoảng 300-320 nucleotit thiết kế máy khơng có khả đọc lần hết chiều dài chuỗi Giải trình thực nhiều lần với số lượng nhiều plasmid tái tổ hợp nhằm thu kết xác Chuỗi xứ lý nucleotit chương trình SeqEd1.0.3; xếp, đối chiếu trình tự tương ứng đoạn gen hệ chương trình máy tính AsemblyLIGN 1.9; MacVector 6.5.3 (Oxford Molecular Inc.) chương trình GENDOC 2.5 (Karl Nicholas, 1997) Giám định chủng thực phương pháp truy cập Ngân hàng Gen thơng qua chương trình BLASTn có (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) Chọn chuỗi so sánh: Các chuỗi nucleotit 16S ARNr số chủng có trình tự tương ứng từ Pseudomonas spp Ngân hàng Gen thu nhận cách truy cập Ngân hàng Gen thông qua số thư mục ngân hàng sử dụng để so sánh đối chiếu với trình tự nucleotid từ chủng Ps7-1 (Bảng 1) Bảng Các chủng Pseudomonas spp dùng để so sánh Địa điểm tiến hành nghiên cứu: Công việc tách chiết ADN tổng số, PCR, dịng hố sản phẩm phần phân tích số liệu thực phịng thí nghiệm Vi sinh vật đất Phịng máy, Viện Công nghệ Sinh học (Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam) Cơng việc giải trình trình tự xử lý số liệu giám định phân tử tiến hành Viện nghiên cứu Y học Queensland (Australia) II KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Phân loại theo kiểu hình: Như nêu, hệ thống phân loại vi khuẩn chuẩn hóa API 20NE tập hợp 21 phản ứng sinh lý sinh hoá dùng để xác định vi khuẩn hình que, gram âm, khơng có nhu cầu dinh dưỡng đặc biệt, không thuộc Họ Enterobacteriaceae Kết phân loại chủng Ps7-1 theo hệ thống API 20NE cho thấy, nhóm phản ứng bản, chủng cho kết âm tính với khử nitrat, tạo indol, tổng hợp urease, thủy phân esculin tổng hợp galactosidase; cho kết dương tính lên men glucose, thủy phân gelatin tổng hợp arginin dihydrolase Trong tổng số 12 hợp chất cácbon cho, chủng Ps7-1 khơng có khả sử dụng arabinose, maltose,, malat, citrat phenol-axetat Với kết vậy, chủng Ps7-1 xác định mã số 4156534 Đối chiếu Bảng số Analytical Profile Index, 5th edition, BioMerieux S.A, 1992, mã số 4156534 không tồn Tuy vậy, vào số mã số có dẫn, chủng Ps7-1 xếp vào vị trí phân loại thuộc giống Chromobacterium mã số chủng có chữ số ban đầu từ 4150 tới 4156 xếp vào loài Ch violaceum Theo Sneath (1984), đặc điểm giống Chromobacterium kỵ khí khơng bắt buộc mẫn cảm với tetraxyclin (30g/ml Kết xác định đặc tính chủng Ps7-1 cho thấy, chủng hiếu khí bắt buộc có khả kháng tetraxyclin nồng độ nêu Theo Norberto Palleroni (1984), đặc tính vi khuẩn Chi Pseudomonas Ngoài ra, nêu, chủng Ps7-1 phân lập môi trường S1, mơi trường thể tính chọn lọc cao vi khuẩn pseudomonad sinh huỳnh quang (Gould cộng sự, 1985) Chính vậy, đến tạm thời kết luận, chủng Ps7-1 khó chủng Chromobacterium Phân loại theo kiểu gen: Gen 16S-ARNr từ chủng Ps7-1 thu nhận phản ứng nhân gen PCR; trình tự xác định đăng ký ngân hàng gen quốc tế với số thư mục AF521651 Một phần kết giám định chủng Ps7-1 phương pháp truy cập Ngân hàng Gen thơng qua chương trình BLASTn cho thấy chủng Ps7-1 có đọ tương đồng cao với 332 chủng thuộc Pseudomonas phần kết trình bày bảng Bảng Mức độ tương đồng trình tự nucleotid gen 16SARNr chủng Ps7-1 với số chủng Pseudomonas spp Căn vào kết giám định nhận từ ngân hàng gen khẳng định chủng Ps7-1 chủng thuộc Chi Pseudomonas, so sánh chuỗi trình tự nucleotid gen 16S-rARN từ chủng với trình tự từ chủng vi khuẩn có ngân hàng gen cho giá trị tin cậy cao thuộc chủng Chi Pseudomonas Để làm sáng tỏ vị trí phân loại chủng Ps7-1, mối quan hệ di truyền chủng xác định dựa thiết lập phả hệ với số chủng Pseudomonas đặc trưng hệ chương trình máy tính MEGA 2.1 ( Hình ) Hình 1: Cây phả hệ ( khơng có rễ ) chủng Pseudomonas thiết lập theo chương trình MEGA 2.1 Pficu: P ficuserectae JCM 2400T, Psyr+gly: P syringae pv glycinea MAFF 302260, Pmeli: P meliae MAFF 301463T, Psyr+pha: P syringae pv phaseolicola MAFF 302282, Pchlor: P chlororaphis DSM 50083T, Pcost: P costantinii CFBP 5705, Pman: P mandelii CIP 105273, PfluoATCC: P fluorescens ATCC 17386, Pfluor: P fluorescens CHAO Cây phả hệ cho thấy, chủng Ps7-1 với chủng P fluorescent lập nên nhóm riêng, chủng cịn lại thuộc loài Pseudomonas khác cho khoảng cách định Điều nói lên chủng Ps7-1 có họ hàng gẫn gũi vỡi loài P fluorescent Việc xác định chủng vi khuẩn dựa hệ thống API 20NE phân tích trình tự gen 16S-ARNr cho kết phân loại khác đề cập báo cáo khoa học, ví dụ chủng QC14-3-8 xác định thuộc loài P aeruginosa (91,8%) theo hệ thống API 20NE, theo phương pháp phân tích gen 16S-ARNr chủng thuộc lồi P putida (99%) (Lottmann cộng , 2000) Như vậy, khác thể mức độ loài, không xẩy định loại chi Nhưng, nêu, trường hợp phân loại chủng Ps7-1 theo hệ thống API 20NE cho kết cách biệt lớn, khơng nói hồn tồn khác, so với phương pháp phân loại tự nhiên dựa vào trình tự chuỗi nucleotid gen 16S-ARNr, theo nhà cung cấp dịch vụ API 20NE, chủng thuộc Chi Pseudomonas nhũng đối tượng phù hợp hệ thống xác định chuẩn hố Tóm lại, với đặc tính phân lập có chọn lọc, hiếu khí bắt buộc kháng tetraxyclin, kết phân tích trình tự chuỗi nucleotid gen 16S-ARNr cho thấy chủng Ps7-1 chủng Pseudomonas, khơng thuộc chi Chromobacterium có quan hệ họ hàng gần với loài P fluorescens, chủng P fluorescens ATCC 17386 chủng P fluorescens CHAO lập nên nhóm riêng Cơng trình tài trợ Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam hỗ trợ Hội đồng Khoa học Tự nhiên, Bộ Khoa học Cơng nghệ & Mơi trường, tài khóa 2002 TÀI LIỆU THAM KHẢO Anzai,Y., Kim,H., Park,J.Y., Wakabayashi,H and Oyaizu,H (2000) Int J Syst Evol Microbiol 50, 1563-1589 Berg, G., Kurze, S., Buchner, A., Wellington, E.M and Smalla, K., 2000 Successful strategy for the selection of new strawberry-associated rhizobacteria antagonistic to Verticillum wilt Can J Microbil., 46, p 1128-1137 Galdzicka, M., Plassmeyer,M.L., Blaine,L.D., Pienta,P.A and Gillevet, P.M (Chưa công bố) Gould, W.D., Hagedorn, C., Bardinelli, T.R and R.M Zablotowicz, 1985 New selective media for Enummeration and recovery of fluorescent Pseudomonads from Various Habitats Appl Env Microbiol., 49, p 28-32 Krieg, N.R and Doebereiner,J., 1984 Genus Azospirillum In: Krieg, N.R., & Holt, J.G (eds): Bergey, s Manual of Systematic Bacteriology The Williams and Wilkin Co., Baltimore Lottmann, J., Heuer, H., Vries, J., Mahn, A., Duering, K., Wackernagel, W., Smalla, K., Berg, G., 2000 Establishment of introduced antagonistic bacteria in the rhizosphere of transgewnic potatoes and their effect on the bacterial community EFMS Microbiol., Ecol., 33, 41-49 Ludwig, W and Schleifer, K.H., 2000 Phylogeny of Bacteria beyond the 16S-rRNA Standerd Vermicon http:w.w.w ermicon.de/english/news/Science/khs99111.htm Masterson, R.V., Prakash, R.K and Arthely, A.G., 1985 Conservation of symbiotic nitrogen fixation gene sequences in Rhizobium japonicum and Bradyrhizobium japonicum J Bacteriol., 163, 2-25 Moore, E.R.B., Mau,M., Arnscheidt,A., Boettger,E.C., Hutson, R.A., Collins,M.D., Van de Peer,Y., De Wachter,R and Timmis,K.N.(1996) Syst Appl Microbiol 19, 478-492 10 Munsch, P., Alatossava,T., Marttinen,N., Meyer,J.-M., Christen,R and Gardan,L (2002) Int J Syst Evol Microbiol in 11 Nguyễn Ngọc Dũng, Hồ Thị Kim Anh, Vũ Thanh, 2000 Vi khuẩn cố định nitơ vi hiếu khí khu trú rễ lúa số địa điểm thuộc đồng sông Hồng Tuyển tập Những vấn đề Nghiên cứu sinh học Hội Nghị Sinh học quốc gia, Hà Nội, Nhà XB Đại học quốc gia Hà Nội 12 Norberto, J and Palleroni, 1984 Genus Pseudomonas In: Krieg, N.R & Holt, J.G (eds): Bergey, s Manual of Systematic Bacteriology The Williams and Wilkin, Co., Baltimore 13 O.Sullivan, D.J., O.Gara, F., 1992 Traits of fluorescent Pseudomonas spp involved in suppression of plant root pathogens Microbiol Rev., 56, 662-672 14 Ramette, A., Moenne-Loccoz,Y and Defa go, G (2001) Mol Plant Microbe Interact 14 (5), 639-652 15 Sawada, H (1997) Nộp trực tiếp vào Ngân hàng gen 16 Verhille,S., Baida,N., Dabboussi,F., Izard,D and Leclerc,H (1999) Syst Appl Microbiol 22, 45-58 17 Woese, C.R., 1987 Bacterial evolution Microbiol Rev., 51, 221-271 SUMMARY TAXONOMICAL POSITION OF THE ISOLATE PS71 CAPABLE OF ANTAGONISM AGAINST FUSARIUM OXYSPORUM BASED ON THE ANALYSIS OF THE 16S-rRNA GENE NUCLEOTIDE SEQUENCE NGUYEN THI TUYET NHUNG et al To establishing the taxonomical position of the bacterial strain Ps7-1 which was isolated from the rice rhizosphere soil in Kim Chung, Dong Anh, Ha Noi on the selective medium for fluorescent pseudomonad bacteria, being gram -negative and possessed the great capable of antagonism to the fungal phytopathogene F oxysporum , the different methods have been used By the API 20NE system – a phenotypically standardized micromethod combining conventional tests and 12 assimilation tests for identification of non-fastidious Gram-negative rods not belong to the Enterobacteraceae, the train Ps7-1 was positioned with the code number 4156534 which does not be present in the catalog, nevertheles with a such code number it also could be thought that this strain may be belong to the group Chromobacterium The genotypical classification method based on the nucleotide sequence of 16s-rRNA gene has been applied to grouping the strain Ps7-1 The 16S-rRNA gene from Ps7-1 has been obtained by Polymerase Chain Reaction with primers Prf: 5,GAGTTTGATCATGGCTAA-3 and Prr: 5,AGGAGGTGATCCAGCC-3, cloned in Vector pCR2.1and automatically sequenced by ABI 377 PRISM (PerkinElmer); to sequencing used primers are M13F 5’GTTTTCCCAGTCACGAC3’, M13R 5’CAGGAAACAGCTATGAC3’ and Seq16SF 5’CAGTGGGGAATATTGGACAAT 3' The nucleotide sequence of the 16s-rRNA gene from Ps7-1 has been checked by the program SeqEd1.0.3 and registered in GenBank with the accession number AF521651 This sequence has been aligned with the registered sequences at Genbank Results of analyses showed that the isolate Ps7-1 possesses the highest homology with the P fluorescens (99%) Based on the nucleotid sequences of the 16s-rRNA gene from the choosen strains of the known Pseudomonas species, a dendogram was presented Ps7-1 and the strains P fluorescens ATCC 17386 P fluorescens CHAO built a common group Additionally, the isolate Ps7-1 is the strictly aerobic one and resistant to tetracycline; those are the main characteristics of genus Pseudomonas With such results it may be concluded that the Ps7-1 strain belongs to P fluorescens Người thẩm định nội dung khoa học: TS Trương Nam Hải  ... từ chủng vi khuẩn xác định trình tự nucleotid Trong báo này, vị trí phân loại chủng Ps7-1 trình bày sở phân tích trình tự nucleotid gen 16S-ARN ribosom (16S-ARNr) I NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Vi. .. hàng gen khẳng định chủng Ps7-1 chủng thuộc Chi Pseudomonas, so sánh chuỗi trình tự nucleotid gen 16S-rARN từ chủng với trình tự từ chủng vi khuẩn có ngân hàng gen cho giá trị tin cậy cao thuộc chủng. .. vỡi lồi P fluorescent Vi? ??c xác định chủng vi khuẩn dựa hệ thống API 20NE phân tích trình tự gen 16S-ARNr cho kết phân loại khác đề cập báo cáo khoa học, ví dụ chủng QC14-3-8 xác định thuộc loài