BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG NGUYỄN THỊ THANH THÙY NGHIÊN CỨU ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH Ở CÁ MÚ CHẤM CAM (Epinephelus coioides Hamilton, 1822) NUÔI TẠI KHÁNH HÒA ĐỐI VỚI VI KHUẨN Vibrio parahaemolyticus Chuyên ngành : Nuôi trồng Thủy sản Mã ngành : 62 62 03 01 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP KHÁNH HÒA - 2014 Công trình được hoàn thành tại Trường Đại học Nha Trang Người hướng dẫn khoa học: 1. TS. Nguyễn Hữu Dũng 2. GS.TS. Heidrun I. Wergeland Phản biện 1: ……………………………… ……………………………… Phản biện 2: ……………………………… ……………………………… Phản biện 3: ……………………………… ……………………………… Luận án được bảo vệ tại Hội đồng đánh giá luận án cấp trường họp tại Trường Đại học Nha Trang vào hồi ……… giờ, ngày …… tháng ……. năm ……… … Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư viện Quốc gia Thư viện Trường Đại học Nha Trang 1 MỞ ĐẦU 1. Sự cần thiết của luận án Cá mú chấm cam Epinephelus coioides có giá trị dinh dưỡng cao, lớn nhanh nên được nuôi phổ biến ở nhiều nước. Trong những năm gần đây, nghề nuôi cá mú đang chịu thiệt hại do dịch bệnh, thường gặp nhất là bệnh lở loét do vi khuẩn Vibrio gây ra. Cho đến nay, việc phòng trị bệnh Vibriosis cho cá mú chủ yếu bằng kháng sinh và hóa chất vẫn chưa đem lại hiệu quả ổn định. Thiệt hại do bệnh vẫn luôn là mối đe dọa cho nghề nuôi cá mú. Vì vậy, nghiên cứu cơ bản về miễn dịch học của cá mú đối với tác nhân gây bệnh góp phần cung cấp thêm những thông tin về cơ chế kháng bệnh ở cá, đặc điểm tác nhân gây bệnh, làm tiền đề cho nghiên cứu ứng dụng vaccine phòng bệnh cho cá là hướng tiếp cận mới, phù hợp với định hướng phát triển nghề nuôi cá biển công nghiệp, bền vững, thân thiện môi trường. 2. Mục tiêu và nội dung của luận án 2.1. Mục tiêu của luận án Làm rõ đặc điểm đáp ứng miễn dịch của cá mú chấm cam đối với vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus. 2.2. Nội dung nghiên cứu  Nghiên cứu đặc điểm của vi khuẩn V. parahaemolyticus gây bệnh lở loét ở cá mú chấm cam.  Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch tự nhiên của cá mú chấm cam và ảnh hưởng của chất kích thích miễn dịch β-glucan đến đáp ứng này.  Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch đặc hiệu của cá mú chấm cam đối với vi khuẩn V. parahaemolyticus bất hoạt bằng formalin. 2 3. Ý nghĩa và điểm mới của luận án:  Kết quả của luận án đóng góp những thông tin khoa học về đặc điểm đáp ứng miễn dịch của cá mú chấm cam đối với vi khuẩn Vibrio; Là cơ sở khoa học cho nghiên cứu ứng dụng sản xuất vaccine và dùng chất kích thích miễn dịch để phòng bệnh Vibiosis cho cá biển nuôi và đặc biệt là cá mú chấm cam tại Việt Nam.  Luận án là công trình đầu tiên nghiên cứu cơ bản về miễn dịch học ở cá mú tại Việt Nam; Là công trình đầu tiên nghiên cứu ảnh hưởng của β-glucan đến đáp ứng miễn dịch tự nhiên của cá mú ở Việt Nam. 4. Bố cục của luận án Luận án gồm 127 trang, 27 hình và 6 bảng, 219 tài liệu tham khảo và phụ lục. Cấu trúc luận án gồm: Mở đầu (3 trang); Chương 1: Tổng quan tài liệu (36 trang); Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu (17 trang); Chương 3: Kết quả nghiên cứu và thảo luận (46 trang); Chương 4: Kết luận và đề xuất ý kiến (2 trang); Tài liệu tham khảo (23 trang) và Phụ lục (19 trang). CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Vài nét về đối tƣợng cá mú chấm cam 1.1.1. Một số đặc điểm sinh học chủ yếu Luận án tổng quan các kết quả nghiên cứu trong và ngoài nước về đặc điểm cá mú nói chung và cá mú chấm cam nói riêng, bao gồm các đặc điểm hình thái, phân bố, sinh trưởng, dinh dưỡng, sinh sản và ấu trùng. 1.1.2. Nghề nuôi cá mú trên thế giới và Việt Nam Trên thế giới, nghề nuôi cá mú bắt đầu từ năm 1970. Tại Việt Nam, cá mú được nuôi bắt đầu từ năm 1988, tập trung ở Hải Phòng, Phú Yên, Khánh Hòa, Vũng Tàu. 3 1.1.3. Một số bệnh thƣờng gặp ở cá mú nuôi Nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới và Việt Nam đã phát hiện các bệnh do vi rút, vi khuẩn, ký sinh trùng trên cá mú nuôi. Trong đó, bệnh do vi khuẩn Vibrio là phổ biến nhất, lây lan nhanh và gây thiệt hại lớn (Sarjito et al., 2009); Sun et al., 2011; Yambot và Song, 2006; Đỗ Thị Hòa và cs, 2008 ). 1.2. Vi khuẩn Vibrio và bệnh Vibriosis trên cá biển 1.2.1 Vi khuẩn Vibrio Luận án đã tổng quan các kết quả nghiên cứu trong và ngoài nước về các đặc điểm hình thái cấu tạo, sinh lý, sinh thái, sinh hóa và độc tính của vi khuẩn Vibrio. 1.2.2 Bệnh do vi khuẩn Vibrio gây ra trên cá biển Nhiều loài cá phân bố ở các vùng biển khác nhau đều nhiễm bệnh do vi khuẩn Vibrio. Dấu hiệu chính của bệnh do Vibrio là xuất hiện các đốm đỏ, xuất huyết hoặc các vết loét trên thân. Bệnh này gây chết cá rải rác đến hàng loạt nếu nhiễm nặng. Tác nhân thường gặp là vi khuẩn V. parahaemolyticus, V. vulnificus, V. alginolyticus, V. cachariae. Cách phòng trị bệnh chủ yếu bằng hóa chất và kháng sinh nhưng chưa có kết quả ổn định. 1.3. Đặc điểm hệ miễn dịch ở cá xƣơng 1.3.1. Miễn dịch tự nhiên Nhiều nghiên cứu về các khía cạnh khác nhau của hệ miễn dịch không đặc hiệu ở cá xương đã được tổng quan bởi các tác giả Ellis (2001), Rombout et al. (2005), Magnadottir (2006),Whyte (2007), Chistiakov et al. (2007), Van Muiswinkel (2008). 1.3.2. Miễn dịch đặc hiệu Cho đến nay, các nghiên cứu tương đối đầy đủ các khía cạnh liên quan đáp ứng miễn dịch (ĐƯMD) đặc hiệu ở cá chỉ mới tập trung trên 4 các đối tượng quen thuộc như cá hồi, cá da trơn và cá chép (Rombout et al., 2005; Swain et al., 2007; Uribe et al., 2011 ). Đã có vài công trình nghiên cứu về hệ miễn dịch ở cá mú: xác định thời điểm hoàn thiện các cơ quan lympho, đặc điểm của phân tử kháng thể, thử nghiệm vaccine và chất kích thích miễn dịch (Lin et al., 2005; Kato et al., 2004; Harikrishnam et al., 2011). 1.3.3 Các nhân tố ảnh hƣởng đến đáp ứng miễn dịch ở cá Các nhân tố ảnh hưởng đến ĐƯMD ở cá bao gồm các yếu tố nội tại liên quan đến quá trình phát triển của cá và các yếu tố ngoại cảnh, trong đó, nhiệt độ có ảnh hưởng lớn nhất. 1.4. Sử dụng vaccine và các chất kích thích miễn dịch trong nghề nuôi cá 1.4.1. Nghiên cứu ứng dụng các chất kích thích miễn dịch ở cá nuôi Đã có 22 chất kích thích miễn dịch không đặc hiệu được nghiên cứu sử dụng ở cá mú. 1.4.2. Nghiên cứu và sử dụng vaccine ở cá nuôi Lịch sử nghiên cứu và sự ra đời các loại vaccine thương mại sử dụng cho cá nuôi được tổng quan từ các nghiên cứu trên thế giới, tập trung ở các loài cá nước lạnh như cá hồi, cá tuyết, hoặc cá nước ngọt như cá nheo, cá chép. 1.5. Tình hình nghiên cứu miễn dịch và vaccine cho cá ở Việt Nam Ở Việt Nam, tình hình nghiên cứu về miễn dịch và vaccine cho cá vẫn còn khá mới mẽ, chủ yếu trên các loài cá nước ngọt. Nghiên cứu đặc điểm miễn dịch trên cá biển vẫn còn bỏ ngõ, trong đó có cá mú. Mới đây, vaccine thương mại kháng bệnh do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri ở cá tra Việt Nam vừa được công bố. 5 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu 2.1.1. Đối tƣợng: Cá mú chấm cam Epinephelus coioides 2.1.2.Vật liệu: i) Cá mú chấm cam: cá mú bệnh dùng để phân lập vi khuẩn được thu tại Khánh Hòa. Cá mú chấm cam khỏe được thu mua từ trại sản xuất giống nhân tạo tại Khánh Hòa. Cá được nuôi thuần dưỡng trước khi tiến hành các thí nghiệm. ii) Vi khuẩn V. parahaemolyticus: Chủng V3 được phân lập từ cá mú bệnh lở loét thu tại Khánh Hòa; chủng V1 được cung cấp bởi Trung tâm Quan trắc cảnh báo môi trường và Phòng ngừa dịch bệnh khu vực miền Bắc; chủng V2 được cung cấp bởi Trung tâm Quan trắc cảnh báo môi trường và Phòng ngừa dịch bệnh khu vực Nam Bộ; chủng A là V. parahaemolyticus 17802 được mua từ ngân hàng chủng ATCC. iii) Chất kích thích miễn dịch: β-glucan (Macrogard-Biorigin, Na Uy). 2.1.3. Địa điểm nghiên cứu: Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản III và Phòng Nghiên cứu miễn dịch cá- Bộ môn Sinh học- Khoa toán và Khoa học tự nhiên- Trường Đại học Bergen, Na Uy. 2.1.4. Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 1/2008 đến 11/2012. 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1. Nghiên cứu đặc điểm của vi khuẩn V. parahaemolyticus  Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa Phân lập vi khuẩn và nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa dựa theo phương pháp của Whitman (2004). Định danh vi khuẩn theo khóa phân loại của Bergey và phân tích trình tự gen 16S rDNA theo Harris và Hartley (2003). 6  Phân tích thành phần protein của các chủng vi khuẩn Thành phần protein của các chủng vi khuẩn được xác định bằng kỹ thuật SDS-PAGE theo Tsang et al. (1983).  Xác định khả năng gây bệnh của V. parahaemolyticus ở cá mú chấm cam Cá mú chấm cam được gây nhiễm thực nghiệm bằng các chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus V1, V2, V3 và A ở 4 nồng độ 10 2 , 10 3 , 10 4 và 10 5 cfu/g bằng cách tiêm vào cơ. Phosphate Buffered Saline (PBS) tiệt trùng được sử dụng tiêm cho nhóm đối chứng (Mỗi nhóm cá thí nghiệm gồm 6 cá thể). Thí nghiệm được lặp lại 2 lần trong cùng thời điểm. Độc lực của mỗi chủng vi khuẩn được đánh giá qua liều gây chết 50% được tính toán theo công thức của Reed và Muench (1938). 2.2.2. Nghiên cứu ảnh hƣởng của β-glucan đến đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu ở cá mú chấm cam  Thí nghiệm gồm 4 nghiệm thức tương ứng với 3 nồng độ cho ăn β-glucan (500 ppm, 1000 ppm và 2000 ppm) và nhóm đối chứng không cho ăn β-glucan. Mật độ cá thí nghiệm là 30 con/bể. Thức ăn viên (M503, Uni-president Việt Nam) trộn β-glucan và bao bên ngoài bằng dầu mực được chuẩn bị trước mỗi bữa ăn và sử dụng cho cá ăn liên tục trong 2 tuần với khẩu phần 2% khối lượng thân mỗi ngày. Thí nghiệm được lặp lại 2 lần trong cùng thời điểm.  Thu mẫu: Ở ngày thứ nhất và ngày thứ 15 sau khi ngưng cho ăn β-glucan, thu mẫu cá (6 cá thể/nghiệm thức) để lấy máu và tiền thận (Head kidney).  Xác định công thức bạch cầu trong máu: Làm tiêu bản và đếm các loại tế bào máu theo phương pháp của Selvaraj et al. (2006). Phân loại các loại bạch cầu theo Ainsworth (1992). 7  Phân lập, nuôi cấy, khảo sát các thông số miễn dịch không đặc hiệu của bạch cầu tiền thận: Phân lập bạch cầu từ thận bằng cách ly tâm trên phân lớp gradient percoll theo Yeh et al. (2008); Khảo sát hoạt tính thực bào dựa trên khả năng bắt nuốt các hạt nhuộm huỳnh quang của bạch cầu theo Yeh et al. (2008); Khảo sát hoạt tính bùng nổ hô hấp của bạch cầu theo Cheng et al. (2007).  Khảo sát khả năng kháng bệnh của cá mú chấm cam sau khi ăn β-glucan: Tiêm cảm nhiễm V. parahaemolyticus với liều 1,07 x 10 5 cfu/g cá ở 2 thời điểm: ngày thứ nhất và ngày thứ 15 sau khi ngừng ăn thức ăn có bổ sung β-glucan. Tại mỗi thời điểm, 24 cá thể/nghiệm thức được tiêm cảm nhiễm. Theo dõi ghi nhận tỷ lệ cá chết ở mỗi nghiệm thức. 2.2.3. Nghiên cứu đặc điểm phân tử kháng thể của cá mú chấm cam  Thu huyết thanh cá mú thực hiện theo phương pháp của Aakre et al. (1994). Tinh sạch kháng thể IgM từ huyết thanh trên hệ thống sắc ký FPLC (Pharmacia, Uppsala, Sweden) theo Havarstein et al. (1988). Phân tích IgM bằng kỹ thuật SDS-PAGE theo Tsang et al. (1983).  Tạo huyết thanh thỏ kháng IgM của cá mú chấm cam: Gây miễn dịch cho thỏ qua 3 lần tiêm dưới da 0,2 mg IgM cá mú và chất bổ trợ (FCA/FIA) với tỷ lệ 1:1 (v/v), mỗi lần tiêm cách nhau 4 tuần. Thu huyết thanh sau mũi tiêm cuối cùng 2 tuần, lưu giữ huyết thanh ở -70 o C.  Phân tích liên kết đặc hiệu giữa IgM cá mú chấm cam với kháng huyết thanh thỏ bằng kỹ thuật Western Blot theo Towbin et al. (1979). 8 2.2.4. Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch đặc hiệu của cá mú chấm cam đối với vi khuẩn V. parahaemolyticus  Kháng nguyên: Vi khuẩn được bất hoạt bằng formalin 0,5% (v/v) rồi pha trong PBS hoặc kết hợp chất bổ trợ FIA (tỷ lệ 1:1) để đạt nồng độ 10 9 tế bào/mL.  Đáp ứng tạo kháng thể của cá mú chấm cam đối với kháng nguyên không bổ sung chất bổ trợ FIA: Các chủng vi khuẩn V1, V2, V3 và A sau khi bất hoạt formalin được tiêm gây miễn dịch cho 20 con cá/chủng với liều 0,1 mL/con cá, cá đối chứng được tiêm 0,1 mL PBS tiệt trùng. Sau khi gây miễn dịch 30, 45 và 60 ngày, thu huyết thanh (10 con cá/nghiệm thức/mỗi thời điểm) để định lượng kháng thể bằng kỹ thuật ELISA gián tiếp theo phương pháp của Jakobsen (1999). Thí nghiệm lặp lại 2 lần trong cùng thời điểm.  Đáp ứng tạo kháng thể và khả năng kháng bệnh của cá mú chấm cam được gây miễn dịch bằng kháng nguyên có bổ sung chất bổ trợ FIA: Thí nghiệm gồm 4 nghiệm thức: nhóm cá được gây miễn dịch bằng vi khuẩn V. parahaemolyticus V3 bất hoạt có bổ sung FIA (ký hiệu là V3F), nhóm cá được tiêm vi khuẩn V3 bất hoạt không có FIA (ký hiệu V3), nhóm đối chứng tiêm PBS (PBS-C) và đối chứng không tiêm (C). Mỗi nhóm gồm 50 con ( 49,8 ± 12,8 g). Tại các thời điểm 30, 45 và 60 sau khi gây miễn dịch, 10 cá thể/nghiệm thức được thu huyết thanh để phân tích tính đặc hiệu của kháng thể bằng kỹ thuật Western Blot và xác định hàm lượng kháng thể bằng kỹ thuật ELISA gián tiếp. Đồng thời, tại thời điểm 30 ngày và 60 ngày sau khi gây miễn dịch, 20 con/nghiệm thức/thời điểm được tiêm cảm nhiễm vi khuẩn V. parahaemolyticus lần lượt với liều 2,5 x 10 5 cfu/g và 2,0 x 10 5 cfu/g. Theo dõi ghi nhận tỷ lệ cá chết ở mỗi nghiệm thức. Tính toán [...]... coioides sinh kháng thể đặc hiệu cao hơn có ý nghĩa so với nhóm cá được tiêm kháng nguyên không bổ sung FIA và cá đối chứng sau 30 và 45 ngày tiêm gây miễn dịch (P < 0,05) Xu thế này tương ứng với số lượng vạch phản ứng kháng nguyên-kháng thể ở nhóm cá tiêm kháng nguyên có FIA nhiều hơn so với nhóm cá tiêm kháng nguyên không có FIA và đối chứng ở 2 thời điểm trên Tuy nhiên, hàm lượng kháng thể trong huyết... CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Đặc điểm vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh lở loét ở cá mú chấm cam 3.1.1 Bệnh xuất huyết lở loét ở cá mú chấm cam nuôi tại Khánh Hòa Trên 24 mẫu cá mú bệnh thu được tại Khánh Hòa trong thời gian từ tháng 3-7/2008, tần suất bắt gặp các dấu hiệu bệnh lý chính cho thấy sự khác nhau tùy thuộc vào tình trạng nhiễm bệnh Trong đó, 100 % mẫu cá bệnh có... 500, 1000 và 2000 ppm trong 2 tuần, thể hiện ở sự gia tăng số lượng tế bào bạch cầu tham gia thực bào trong máu, chỉ số thực bào và hoạt tính RB của tế bào BC phân lập từ tiền thận Trong đó, liều bổ sung β-glucan 1000 ppm vào thức ăn mang lại hiệu quả cao nhất Tuy nhiên, các thông số đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu và hiệu quả bảo vệ kháng lại V parahaemolyticus ở cá thí nghiệm đều suy giảm và không... ngày; Cột 8: nhóm đối chứng được tiêm PBS) 19 3.3.3.2 Hàm lƣợng kháng thể của cá mú chấm cam sau khi gây miễn dịch bằng V parahaemolyticus V3 bất hoạt bằng formalin ở các thời điểm khác nhau Hàm lượng kháng thể đặc hiệu trong huyết thanh cá được gây miễn dịch bằng chủng V3 kết hợp FIA cao nhất và khác biệt có ý nghĩa thống kê tại các thời điểm 30, 45 và 60 ngày sau khi gây miễn dịch (Hình 3.16) Mật độ... FIA chỉ hiệu quả đến ngày thứ 45 sau khi gây miễn dịch và suy giảm sau 60 ngày gây miễn dịch Do vậy, nghiên cứu thêm về nồng độ kháng nguyên, các chất bổ trợ khác nhau và cỡ cá gây miễn dịch thích hợp nhằm kéo dài hiệu quả bảo vệ của vaccine trên cá mú 3 Trong thành phần phân tử kháng thể IgM cá mú E coioides, ngoài 2 chuỗi nặng và chuỗi nhẹ là 78 và 25 kDa thì còn có một polypeptide 23 kDa ở vị trí... có bổ sung FIA; và các biểu hiện này có xu hướng giảm dần theo thời gian sau khi gây miễn dịch ( Hình 3.15) Hình 3.15: Biểu hiện liên kết giữa kháng thể của cá mú chấm cam với protein của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus V3 bằng kỹ thuật Western Blot (Cột 1: Marker; Cột 2,3 và 4: Kháng nguyên có bổ sung FIA sau 30, 45 và 60 ngày; Cột 5,6 và 7: Kháng nguyên không bổ sung FIA sau 30, 45 và 60 ngày; Cột... hết đặc điểm hình thái, sinh hóa, sinh lý khá tương đồng với chủng chuẩn ATCC 17802 và được định danh V parahaemolyticus dựa theo khóa phân loại của Bergey và phân tích trình tự gen 16S rDNA với mức độ tương đồng đến 99% so với chủng chuẩn 3.1.2.2 Thành phần protein của vi khuẩn V parahaemolyticus Thành phần protein của 4 chủng V parahaemolyticus tương tự nhau Trong phổ protein của các chủng vi khuẩn... 66, 47, 31, 28 và 21 kDa tương đồng với các protein mang độc tố và có tính kháng nguyên cao đã được nhiều tác giả công bố (Hình 3.5) Phát hiện này có ý nghĩa quan trọng trong việc chọn lựa các chủng vi khuẩn tiềm năng ứng dụng cho nghiên cứu sản xuất vaccine phòng bệnh cho cá biển 11 Hình 3.5: Thành phần protein của các chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus 3.1.3.Khả năng gây bệnh và độc lực của... bạch cầu (BC) trong máu của cá mú chấm cam Sau 2 tuần ăn thức ăn có bổ sung β-glucan, tỷ lệ BC tổng số, BC trung tính và BC đơn nhân trong máu cá mú chấm cam đã tăng lên và khác biệt có ý nghĩa thống kê (P . ……………………………… Luận án được bảo vệ tại Hội đồng đánh giá luận án cấp trường họp tại Trường Đại học Nha Trang vào hồi ……… giờ, ngày …… tháng ……. năm ……… … Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư viện. kháng thể bằng kỹ thuật Western Blot và xác định hàm lượng kháng thể bằng kỹ thuật ELISA gián tiếp. Đồng thời, tại thời điểm 30 ngày và 60 ngày sau khi gây miễn dịch, 20 con/nghiệm thức /thời. Yambot và Song, 2006; Đỗ Thị Hòa và cs, 2008 ). 1.2. Vi khuẩn Vibrio và bệnh Vibriosis trên cá biển 1.2.1 Vi khuẩn Vibrio Luận án đã tổng quan các kết quả nghiên cứu trong và ngoài nước về các