ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TRƯƠNG THỊ HOÀNG DIỆU TẠO VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC IN VITRO CỦA THỤ THỂ INTERLEUKIN-33 DẠNG TỰ DO ĐƯỢC BIỂU HIỆN TỪ TẾ BÀO NGƯỜI HEK293 Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60 42 70 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. NGUYỄN ĐĂNG QUÂN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2012 i LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, em xin gửi lời “CẢM ƠN THẦY!” chân thành đến TS. Nguyễn Đăng Quân, cảm ơn Thầy với những kiến thức chuyên ngành mới, những phương pháp nghiên cứu hay và tinh thần đam mê trong công việc … Không chỉ giới hạn trong luận văn này mà nó sẽ có ý nghĩa rất lớn đối với em trong những bước đi tiếp theo. Cảm ơn những người bạn trong nhóm đề tài – anh Lê Gia Bảo và bạn Nguyễn Thị Thanh Thảo, mỗi người một tính cách, mỗi hướng giải quyết vấn đề, nhưng sự hợp tác đã giúp chúng tôi khắc phục khó khăn và lần lượt hoàn thành từng thí nghiệm. Rất vui khi được làm việc cùng mọi người. Xin gửi lời cảm ơn đến tất cả các anh chị phòng CNSH Y Dược và CNSH Thủy Sản – Trung tâm Công nghệ Sinh học Tp.HCM đã giúp đỡ em trong thời gian qua. Luận văn này sẽ không thể thực hiện nếu không có nguồn kinh phí nghiên cứu khoa học của Trung tâm Công nghệ Sinh học Tp.HCM. Tôi xin chân thành cám ơn quý Trung tâm cũng như Ban Giám đốc Trung tâm đã tạo điều kiện cho tôi thực hiện đề tài này. Con vẫn luôn cố gắng sống tốt để không phụ lòng mong mỏi của Ba – Má. Cảm ơn Ba – Má của con thật nhiều! Tp. Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2012 Trương Thị Hoàng Diệu ii MỤC LỤC Lời cảm ơn i Mục lục ii Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt vi Danh mục các bảng viii Danh mục các hình ix LỜI MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2 1.1. Vai trò của IL-33 trong sinh lý và bệnh lý 2 1.1.1. Vai trò của IL-33 trong sinh lý 2 1.1.2. Vai trò của IL-33 trong bệnh lý 3 1.2. Đặc điểm sinh học của IL-33 6 1.2.1. Cấu trúc của IL-33 6 1.2.2. Tế bào sinh tổng hợp và tế bào đích của IL-33 7 1.2.3. IL-33 ngoại bào và nội bào 8 1.2.4. Con đường truyền tín hiệu của IL-33 thông qua IL-33R 9 1.3. Đặc điểm sinh học của IL-33R 10 1.3.1. Cấu trúc của IL-33R 10 1.3.2. Tương tác của IL-33 với IL-33R 11 1.3.3. IL-33R dạng tự do 12 1.4. Ức chế hoạt động của IL-33 là một liệu pháp tìềm năng điều trị các bệnh viêm – dị ứng 12 1.5. Sơ lược về các dược phẩm ức chế hoạt động cytokine dựa trên nguyên tắc tương tác cạnh tranh 14 1.6. Hệ thống tế bào động vật biểu hiện protein tái tổ hợp 16 CHƯƠNG 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 18 2.1. Vật liệu 18 2.1.1. Plasmid 18 iii 2.1.2. Hóa chất tạo dòng plasmid biểu hiện msIL-33R:Fc hIgG1 19 2.1.3. Hóa chất dùng trong nuôi cấy vi khuẩn E. coli 19 2.1.4. Hóa chất nuôi cấy tế bào HEK293 và EL-4 19 2.1.5. Hóa chất dùng để biến nạp plasmid vào E.coli và HEK293 20 2.1.6. Hóa chất li giải tế bào, định lượng protein và thủy phân nhóm đường trên glycoprotein 20 2.1.7. Hóa chất dùng cho SDS-PAGE, Western Blot và đồng kết tủa miễn dịch 20 2.1.8. Hóa chất ELISA 21 2.2. Phương pháp 22 2.2.1. Tạo plasmid biểu hiện protein tái tổ hợp msIL-33R:Fc hIgG1 22 2.2.1.1. Khuếch đại đoạn gen mã hóa cho sIL-33R của chuột 22 2.2.1.2. Phân tích DNA bằng điện di trên gel agarose 23 2.2.1.3. Tinh sạch DNA 23 2.2.1.4. Cắt hạn chế DNA bằng NotI và HindIII 24 2.2.1.5. Phản ứng nối DNA bằng ligase 25 2.2.1.6. Biến nạp plasmid vào E. coli DH5α khả nạp 25 2.2.1.7. Tách chiết plasmid từ E. coli 26 2.2.2. Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn 27 2.2.2.1. Nuôi cấy E. coli DH5α 27 2.2.2.2. Bảo quản E. coli DH5α mang plasmid 27 2.2.2.3. Tạo tế bào khả nạp E. coli DH5α bằng phương pháp hóa biến nạp 27 2.2.3. Phương pháp nuôi cấy tế bào HEK293 28 2.2.4. Phương pháp nuôi cấy tế bào EL-4 29 2.2.5. Phương pháp biến nạp plasmid vào tế bào HEK293 29 2.2.6. Phương pháp phân giải tế bào 30 2.2.7. Phương pháp Bradford định lượng protein 30 iv 2.2.8. Phương pháp thu nhận msIL-33R:Fc hIgG1từ dịch nuôi cấy tế bào HEK293 31 2.2.9. Phương pháp thủy phân nhóm đường trên glycoprotein msIL-33R:Fc hIgG1 bằng PNGase F 32 2.2.10. Phương pháp tạo IL-33 chuột đánh dấu biotin 32 2.2.11. Phương pháp SDS-PAGE, Western Blotting 33 2.2.11.1. Điện di SDS-PAGE 33 2.2.11.2. Western Blotting 35 2.2.12. Phương pháp đồng kết tủa miễn dịch (co-immunoprecipitation) 36 2.2.12.1. Đồng kết tủa miễn dịch bio-mIL33 và msIL-33R:Fc hIgG1 36 2.2.12.2. Đồng kết tủa miễn dịch bio-mIL33 và FLAG-IL33R 36 2.2.13. Phương pháp đánh giá khả năng ức chế IL-33 của msIL-33R:Fc hIgG1 trên mô hình tế bào nuôi cấy 37 2.2.14. Phương pháp ELISA định lượng mIL-2 38 CHƯƠNG 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39 3.1. Tạo dòng plasmid pmsIL33R-Fc mang gen mã hóa protein msIL-33R:Fc hIgG1 39 3.1.1. Khuếch đại, thu nhận đoạn gen mã hóa thụ thể IL-33 dạng tự do của chuột và chuẩn bị vector Signal pIgplus cho tạo dòng 39 3.1.2. Tạo plasmid Signal pIgplus tái tổ hợp mang gen mã hóa protein msIL-33R:Fc hIgG1 40 3.2. Biểu hiện và thu nhận protein tái tổ hợp msIL-33R:Fc hIgG1 từ tế bào người HEK293 42 3.3. Phân tích một số đặc điểm của protein tái tổ hợp msIL-33R:Fc hIgG1 44 3.3.1. Sự đường hóa của msIL-33R:Fc hIgG1 tái tổ hợp biểu hiện từ HEK293 44 3.3.2. Protein msIL-33R:Fc hIgG1 được biểu hiện và tiết ra môi trường ngoại bào ở dạng dimer 46 3.4. Biểu hiện IL-33 chuột có đánh dấu biotin từ vi khuẩn E.coli 48 v 3.5. Sự tương tác của msIL-33R:Fc hIgG1 với bio-mIL33 trong điều kiện in vitro 50 3.6. Sự cạnh tranh của msIL-33R:Fc hIgG1 với IL-33R biểu hiện ở bề mặt tế bào trong việc tương tác với bio-mIL33 52 3.7. Khả năng ức chế hoạt động IL-33 của msIL-33R:Fc hIgG1 trên mô hình tế bào EL-4 nuôi cấy in vitro 55 CHƯƠNG 4 – KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 59 4.1. Kết luận 59 4.2. Đề nghị 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO 60 PHỤ LỤC 71 vi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT APC Antigen Presenting Cells BMMC Bone marrow–derived mast cell bp base pair BSA Bovine serum albumin CD2 Cluster of differentiation 2 cs cộng sự CTLA-4 Cytotoxic T-Lymphocyte Antigen 4 DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxynucleotide triphosphate ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay Fc Fragment crystallizable region FCS Fetal calf serum HEK293 Human Embryonic Kidney 293 hIgG1 Human immunoglobulin G1 HRP Horseradish peroxidase IFNγ Interferon γ Ig Immunoglobulin IL Interleukin IL-1RAcP Interleukin-1 receptor accessory protein IL-33R Interleukin-33 receptor IRAK IL-1 Receptor Associated Kinase IκB Inhibitor of NF-κB JNK c-Jun N-terminal kinase KDa Kilodalton LB Luria Bertani vii LFA-3 Lymphocyte function-associated antigen 3 M Marker MAP kinase Mitogen-activated protein kinase mIL-2 Mouse interleukin-2 mIL-33 Mouse interleukin-33 mRNA Messenger ribonucleic acid msIL-33R Mouse soluble interleukin- 33 receptor MyD88 Myeloid differentiation primary response gene 88 NCBI National Center for Biotechnology Information NF-HEV Nuclear factor – high endothelial venule NFκB Nuclear factor kappa B OD Optical density PBS Phosphate buffered saline PCR Polymerase chain reaction RPMI Roswell Park Memorial Institute SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis TAB TAK1 binding protein TAK1 TGF-β-activated kinase 1 Th T helper cell TIR Toll-like Interleukin-1 Receptor TNF Tumor Necrosis Factor α TPO Thrombopoietin TRAF-6 TNF Receptor Associated Factor 6 WB Western Blot viii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Các biệt dược có bản chất là protein lai mang vùng Fc IgG1 15 Bảng 2.1. Thành phần gel polyacrylamide dùng trong SDS-PAGE 20 Bảng 2.2. Các kháng thể được sử dụng trong thí nghiệm Western Blot 21 Bảng 3.1. Đáp ứng tiết mIL-2 do tác động của mIL-33 từ tế bào EL-4 khi được xử lý với msIL-33R:Fc hIgG1 ở nhiều nồng độ khác nhau 57 ix DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc không gian IL-33 của người 6 Hình 1.2. Con đường truyền tín hiệu của IL-33 thông qua IL-33R 10 Hình 1.3. Cấu trúc không gian vùng ngoại bào của IL-33R và tương tác giữa IL-33R với IL-33 11 Hình 1.4. sIL-33R (ST2) có cấu trúc tương đồng với vùng ngoại bào của IL-33R (ST2L) và ngăn cản con đường truyền tín hiệu của IL-33 12 Hình 1.5. Mô hình ức chế IL-33 của msIL-33R:Fc hIgG1 14 Hình 2.1. Sơ đồ của các plasmid được sử dụng trong đề tài 18 Hình 3.1. Thu nhận đoạn gen mã hóa msIL-33R và vector Signal pIgplus 40 Hình 3.2. Kết quả sàng lọc các dòng plasmid tái tổ hợp 41 Hình 3.3. Biểu hiện và tinh sạch sơ bộ protein msIL-33R:Fc hIgG1 từ hệ thống tế bào người HEK293 44 Hình 3.4. Sự glycosyl hóa của msIL-33R:Fc hIgG1 được biểu hiện từ tế bào người HEK293 46 Hình 3.5. Protein msIL-33R:Fc hIgG1 được biểu hiện ở dạng dimer 48 Hình 3.6. Biểu hiện IL33 chuột đánh dấu biotin 50 Hình 3.7. Protein msIL-33R:Fc hIgG1 biểu hiện từ HEK293 tương tác với bio-mIL33 ở điều kiện in vitro 52 Hình 3.8. msIL33R:Fc hIgG1cạnh tranh với FLAG-IL33R biểu hiện trên bề mặt tế bào trong việc tương tác với bio-mIL33 54 Hình 3.9. msIL-33R:Fc hIgG1 ức chế hoạt động của IL-33 trên mô hình tế bào EL-4 nuôi cấy 57 [...]... trên Mục tiêu của nghiên cứu: tạo ra protein lai msIL-33R:Fc hIgG1 (thụ thể IL -33 dạng tự do của chuột gắn với vùng Fc IgG1 của người) biểu hiện từ tế bào HEK293 (Human Embryo Kidney) có hoạt tính sinh học ức chế hoạt động của IL -33 msIL33R:Fc hIgG1 ức chế IL -33 bằng cách bắt lấy IL -33 tự do qua đó hạn chế sự tác động của cytokine này lên tế bào đích thông qua thụ thể của nó trên bề mặt tế bào Nội dung... từ các tế bào nội mô, biểu mô và kích thích nhiều loại tế bào bạch huyết tạo ra các cytokine đóng vai trò quan trọng trong hoạt động của hệ thống miễn dịch bẩm sinh và thích ứng 1.2.3 IL -33 ngoại bào và nội bào Dựa vào chức năng mà IL -33 được chia thành hai dạng là IL -33 ngoại bào và IL -33 nội bào IL -33 ngoại bào là IL -33 được phóng thích ra ngoài tế bào và thực hiện chức năng như một cytokine tiền... Light subunit), α-internexin [69] hay biểu hiện tính chất của tế bào tạo máu [57] Trong tế bào HEK293, nhân tố tiền viêm IL-8 được sản xuất theo con đường NF-κB nhờ sự hoạt hóa TLR4 (Toll-like receptor 4) trên bề mặt tế bào [16], [42] hay nhờ sự cảm ứng của IL -33 thông qua thụ thể IL-33R và đồng thụ thể IL1RAcP được biểu hiện nhân tạo trên bề mặt tế bào [1] Hệ thống tế bào HEK293 đã được ứng dụng thành... và keratin 18 Hơn nữa, sự biểu hiện của nhiều receptor tyrosine kinase trên bề mặt tế bào cho phép tế bào đáp 16 ứng với một số kích thích như yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi, yếu tố tăng trưởng biểu mô, insulin, yếu tố tăng trưởng giống insulin, ephrin [69] Ngoài ra, tế bào HEK293 thể hiện đặc tính của tế bào thần kinh rất rõ khi biểu hiện ba trong bốn nhân tố đặc hiệu cho tế bào thần kinh là NF-M... gồm: 1 Tạo dòng plasmid pmsIL33R-Fc mang gen mã hóa protein msIL33R:Fc hIgG1 2 Biểu hiện và thu nhận protein tái tổ hợp msIL-33R:Fc hIgG1 từ tế bào người HEK293 3 Phân tích một số đặc điểm của protein tái tổ hợp msIL-33R:Fc hIgG1 4 Biểu hiện IL -33 chuột có đánh dấu biotin (bio-mIL33) từ vi khuẩn E.coli 5 Khảo sát sự tương tác của msIL-33R:Fc hIgG1 với bio-mIL33 trong điều kiện in vitro 6 Khảo sát sự... IL -33 được tiết theo cơ chế hoại tử của tế bào dưới dạng tiền phân tử, sau đó được biến đổi và tác động lên các tế bào đích qua phức hợp thụ thể của nó [41] IL -33 kích thích tế bào đích thông qua thụ thể đặc hiệu IL-33R và đồng thụ thể là IL-1RAcP (IL-1 Receptor Accessory Protein) hiện diện trên màng một số tế bào đích của nó như bạch cầu hạt ưa kiềm, bạch cầu hạt ưa acid, tương bào, tế bào giết tự. .. IL-33R với IL -33 [37] A Cấu trúc không gian của IL -33 B Cấu trúc không gian của vùng ngoại bào IL-33R C Mô hình tương tác giữa IL -33 với vùng ngoại bào IL-33R 11 1.3.3 IL-33R dạng tự do IL-33R dạng tự do (soluble IL-33R: sIL-33R) có cấu trúc giống hệt vùng ngoại bào của IL-33R sIL-33R và IL-33R cùng được mã hóa từ gen ST2 và hình thành do quá trình biến đổi sau phiên mã sIL-33R có kích thước 337 aa, có... viêm loét đại tràng và bệnh Crohn Một số báo cáo cho thấy có sự liên quan giữa IL -33 và các dạng bệnh viêm ruột IL -33 biểu hiện nhiều ở nguyên bào sợi và tế bào biểu mô ruột của các bệnh nhân bị viêm loét đại tràng và bệnh Crohn, đồng thời IL -33 và sST2 (thụ thể IL -33 dạng tự do) cũng được tìm thấy trong huyết thanh [9], [11], [54] Chuột được xử lý IL -33 có biểu hiện tăng sinh biểu mô ruột, gia tăng... Stimulating Factor) làm tăng cường hoạt động tiết IL-3, IL-5 và IL-8 của bạch cầu hạt ưa acid [15], [55] IL -33 hoạt hóa tế bào giết tự nhiên làm tăng biểu hiện và tiết IFN-γ [10] Ngoài ra, IL -33 còn tác động lên tế bào tua làm tăng cường tiết IL-6, kích thích sự biểu hiện IL-8 ở tế bào biểu mô và nội mô thông qua phức hợp thụ thể của nó trên bề mặt tế bào [60], [82] Như vậy, IL -33 được tạo ra chủ yếu từ. .. lympho bào và các cytokine IL-4, IL-5 và IL-13 trong dịch nhầy phế quản [38] Như đã trình bày ở mục 1.3.3, ngoài dạng biểu hiện trên bề mặt tế bào thì IL33R còn tồn tại ở dạng tự do (sIL-33R) sIL-33R có thể có vai trò tự nhiên là điều hòa âm hoạt động của IL -33 bằng cách cạnh tranh với thụ thể trên bề mặt tế bào trong việc tương tác với IL -33 [22], [52] Dựa trên phát hiện này, sIL-33R nhân tạo đã được . HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TRƯƠNG THỊ HOÀNG DIỆU TẠO VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC IN VITRO CỦA THỤ THỂ INTERLEUKIN-33 DẠNG TỰ DO ĐƯỢC BIỂU. glycosyl hóa của msIL-33R:Fc hIgG1 được biểu hiện từ tế bào người HEK293 46 Hình 3.5. Protein msIL-33R:Fc hIgG1 được biểu hiện ở dạng dimer 48 Hình 3.6. Biểu hiện IL33 chuột đánh dấu biotin 50 Hình. 6 1.2.2. Tế bào sinh tổng hợp và tế bào đích của IL-33 7 1.2.3. IL-33 ngoại bào và nội bào 8 1.2.4. Con đường truyền tín hiệu của IL-33 thông qua IL-33R 9 1.3. Đặc điểm sinh học của IL-33R