ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ******* HUỲNH HỒNG KHÁNH THƯ TÌM HIỂU TÍNH KHÁNG THUỐC ANTIRETROVIRUS (ARV) CỦA VIRÚT HIV TRÊN CÁC BỆNH NHÂN NHIỄM HIV Chuyên ngành: Di truyền học – Khoa Sinh học Mã số: 604270 LUẬN VĂN THẠC SĨ CHUN NGÀNH DI TRUYỀN Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Trương Thò Xuân Liên Thành phố Hồ Chí Minh, năm 2010 i MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC BIỂU ĐỒ vi DANH MỤC HÌNH vii TÓM TẮT 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 4 CHƯƠNG 1 . TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Đặc điểm sinh học của HIV 7 1.2. Cấu tạo hình thể của HIV-1 7 1.3. Tổ chức bộ gen của virút HIV 8 1.4. Chu trình nhân lên của virút HIV và những vò trí tác động của các phân tử thuốc kháng retrovirút 9 1.5. Các thuốc kháng retrovirút 12 1.6. Hiện tượng kháng thuốc ARV 13 1.7. Hiện tượng kháng chéo giữa các thuốc ARV 13 1.8. Phân loại đột biến kháng thuốc ARV 14 1.9. Cách tính điểm đột biến và mức độ kháng thuốc 14 Huỳnh Hoàng Khánh Thư Cao học Di truyền K15 ii 1.10. Tác động của thuốc và cơ chế kháng thuốc 15 1.11. Điều trò kháng retrovirút 24 1.12. Hiện tượng thất bại điều trò 25 1.13. Các phương pháp nghiên cứu tính kháng thuốc ARV ở HIV-1 32 1.14. Bối cảnh thực hiện của đề tài 35 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP 2.1. Mục tiêu nghiên cứu 38 2.2. Phương pháp tiến hành 41 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Tìm hiểu mức độ lan truyền các chủng HIVKT trong cộng đồng 46 3.1.1 Một số đặc điểm của nhóm nghiên cứu 46 3.1.2. Tình trạng kháng thuốc trên nhóm bệnh nhân mới nhiễm chưa điều trò 48 3.1.3. Đònh týp di truyền 51 3.2. Kháng thuốc trên nhóm bệnh nhân thất bại điều trò 54 3.2.1. Một số đặc điểm của nhóm nghiên cứu 55 3.2.2. Đặc điểm bệnh nhân khi bắt đầu điều trò tại phòng khám ngoại trú (OPC) 56 3.2.3. Tình hình điều trò của bệnh nhân trước khi đến OPC 57 3.2.4. Đặc điểm sử dụng ARV tại các OPC 58 3.2.5. Tuân thủ điều trò 59 Huỳnh Hoàng Khánh Thư Cao học Di truyền K15 iii 3.2.6. Chỉ đònh thất bại điều trò 59 3.2.7. Tình trạng bệnh nhân tại thời điểm thực hiện xét nghiệm kháng thuốc ARV 60 3.2.8. Đặc điểm kháng thuốc cảu bệnh nhân có nồng độ virút tự do trong máu ≥ 3 log bản sao/mL 60 3.2.9. Các yếu tố liên quan đến tình trạng kháng thuốc chung 71 3.2.10. Xác đònh týp di truyền 73 CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN 4.1. Đánh giá lan truyền các chủng HIVKT trong cộng đồng 74 4.2. Theo dõi HIVKT trong nhóm bệnh nhân thất bại điều trò 79 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận 87 Đề nghò 88 CÁC BÀI BÁO ĐÃ ĐƯC ĐĂNG 90 TÀI LIỆU THAM KHẢO 91 PHỤ LỤC viii Phụ lục 1: Giấy cam kết đồng ý tham gia chương trình nghiên cứu viii Phụ lục 2: Bảng câu hỏi điều tra nhóm bệnh nhân mới nhiễm chưa điều trò ix Phụ lục 3: Bảng câu hỏi điều tra nhóm bệnh nhân thất bại điều trò xii Huỳnh Hoàng Khánh Thư Cao học Di truyền K15 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 3TC Lamivudine ABC Abacavir AIDS Acquired Immunodeficiency Syndrome (Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải) ARV Antiretrovirus (Thuốc kháng retrovirút) ATV Atazanavir AZT Zidovudine D4T Stavudine ddI Didanosine DLV Delavirdine DNA Deoxyribonucleic acid DRV Darunavir EFV Efavirenz ETV Etravirenz FPV Fosamprenavir FTC Emtricitabine gp Glycoprotein HAART High Active Antiretrovirus Therapy (Điều trị kháng retro vi rút hiệu lực cao) HIV Human Immunodeficiency Virus (Vi rút gây suy giảm miễn dòch ở người) HIVKT HIV kháng thuốc IC Inhibitor Concentration (Nồng độ ức chế) IDV Indinavir KTC 95% Khoảng tin cậy 95% Huỳnh Hoàng Khánh Thư Cao học Di truyền K15 v LPV Lopinavir LTRs Long Terminal Repeat Sequences NFV Nelfinavir NNRTI Non-Nucleoside Reverse Transcriptase Inhibitor (Non- Nucleoside ức chế men phiên mã ngược) NRTI Nucleoside Reverse Transcriptase Inhibitor (Nucleoside ức chế men phiên mã ngược) NVP Nevirapine OD Optical Density (Mật độ quang) OPC Out Patient Clinic (Phòng khám ngoại trú) PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng tổng hợp chuỗi) PI Protease Inhibitor (Ức chế men cắt protein) RNA Ribonucleic acid RT Reverse Transcriptase (Men phiên mã ngược) RT-PCR Reverse Transcriptase- Polymerase Chain Reaction (Phản ứng phiên mã ngược tổng hợp chuỗi) SQV Saquinavir TDF Tenofovir Tp. HCM Thành phố Hồ Chí Minh Huỳnh Hoàng Khánh Thư Cao học Di truyền K15 vi DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Các loại thuốc kháng retrovirút 12 Bảng 1.2: Các đột biến kháng thuốc nhóm NRTI 16 Bảng 1.3: Các đột biến kháng thuốc nhóm NNRTI 19 Bảng 1.4: Các đột biến kháng thuốc nhóm PI 21 Bảng 1.5: Các phác đồ bậc 1 được sử dụng trên thế giới 24 Bảng 1.6: Các phác đồ được sử dụng tại Việt Nam 25 Bảng 1.7: Các tiêu chí đánh giá thất bại điều trò 26 Bảng 3.1: Đặc điểm dân số xã hội của nhóm nghiên cứu 46 Bảng 3.2: Đặc điểm tải lượng virút của nhóm đối tượng nghiên cứu 48 Bảng 3.3: Đặc điểm của nhóm bệnh nhân thất bại điều trò ARV 54 Bảng 3.4: Kiến thức của bệnh nhân về HIV/AIDS và điều trò ARV 55 Bảng 3.5: Đặc điểm bệnh nhân khi bắt đầu điều trò 56 Bảng 3.6: Mức độ xuất hiện các đột biến TAM 64 Bảng 3.7: Phân tích đơn biến một số yếu tố liên quan đến tình trạng kháng thuốc 71 Bảng 3.8: Phân tích đa biến một số yếu tố liên quan đến sự xuất hiện HIV kháng thuốc 73 DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3. 1: Phác đồ điều trò trước khi đến OPC 57 Biểu đồ 3. 2: Phác đồ được sử dụng khi bắt đầu điều trò ARV tại OPC 58 Biểu đồ 3. 3: Các chỉ tiêu đánh giá thất bại điều trò 59 Huỳnh Hoàng Khánh Thư Cao học Di truyền K15 vii Biểu đồ 3. 4: Nồng độ virút tự do trong máu 60 Biểu đồ 3. 5: Tình trạng kháng thuốc ARV 61 Biểu đồ 3. 6: Các đột biến kháng thuốc nhóm NRTI 62 Biểu đồ 3. 7: Tình trạng kháng thuốc nhóm NRTI 65 Biểu đồ 3. 8: Đột biến kháng thuốc nhóm NNRTI 66 Biểu đồ 3. 9: Tình trạng kháng thuốc nhóm NNRTI 68 Biểu đồ 3. 10: Đột biến kháng thuốc nhóm PI 69 DANH MỤC HÌNH Hình 1. 1: Cấu trúc hình thể của HIV-1 8 Hình 1. 2: Cấu trúc bộ gen của virút HIV 9 Hình 1. 3: Chu trình nhân lên của HIV 10 Hình 1. 4: Các vò trí tác động của thuốc ARV 13 Hình 1. 5: Cơ chế kháng thuốc nhóm NRTI 16 Hình 1. 6: Cơ chế kháng thuốc nhóm NNRTI 18 Hình 1. 7: Cơ chế tác động của thuốc PI và cơ chế kháng thuốc 19 Hình 1. 8: Cơ chế tác động của thuốc T-20 21 Hình 3. 1: Đột biến G190A ở bệnh nhân mang mã số R26 49 Hình 3. 2: Đột biến M46I ở bệnh nhân mang mã số R40 49 Hình 3. 3: Đột biến A71V ở bệnh nhân mang mã số R867 50 Hình 3. 4: Cây phân loại di truyền dựa trên gen protease 52 Hình 3. 5: Cây phân loại di truyền dựa trên gen reverse trancriptase 53 Hình 3. 6: Đột biến tại vò trí 184 biến đổi methionin thành valin (M184V) 63 Hình 3.7: Đột biến chèn thêm 2 codon xung quanh vò trí 69 (T69i) 64 Huỳnh Hoàng Khánh Thư Cao học Di truyền K15 1 Tóm tắt Đặt vấn đề Điều trò ARV góp phần kéo dài cuộc sống, nâng cao chất lượng sống của những bệnh nhân nhiễm HIV/AIDS và giảm sự lây nhiễm trong cộng đồng. Tuy nhiên cho đến nay đã ghi nhận nhiều trường hợp thất bại điều trò với sự xuất hiện các chủng HIV mang đột biến kháng thuốc không những hạn chế hiệu quả điều trò mà còn có nguy cơ làm lan truyền chủng HIVKT trong cộng đồng. Nghiên cứu này nhằm tìm hiểu mức độ lan truyền chủng HIVKT trong cộng đồng (mục tiêu 1) và xác đònh các đột biến kháng thuốc trong nhóm bệnh thất bại điều trò ARV (mục tiêu 2). Đối tượng và phương pháp nghiên cứu Nghiên cứu tiến hành trên nhóm người mới nhiễm chưa từng tiếp cận ARV để tìm hiểu mức độ lan truyền của các chủng HIVKT trong cộng đồng và nhóm bệnh nhân đang điều trò được đánh giá thất bại dựa theo tiêu chuẩn lâm sàng hoặc miễn dòch. Tại thời điểm thực hiện xét nghiệm kháng thuốc, nồng độ HIV-RNA tự do trong máu được xác đònh bằng kỹ thuật real-time PCR (Biocentric). Các mẫu có nồng độ virút ≥1000 bản sao/mL (3log bản sao/mL ) sẽ được giải trình tự các gen reverse transcriptase và protease liên quan đến đích tác động của thuốc ARV. Các đột biến kháng thuốc sẽ được phân tích bằng chương trình CEQ TM 8000 – Beckman Coulter và so sánh với các dữ liệu ngân hàng quốc tế Stanford. Thu thập và phân tích dữ liệu bằng Epi-data 3.0 và Stata 10.0. Huỳnh Hoàng Khánh Thư Cao học Di truyền K15 2 Kết quả 1. Mức độ lan truyền HIVKT trong cộng đồng: 77 bệnh nhân đáp ứng tiêu chuNn mới nhiễm và chưa từng tiếp xúc với ARV đã được thu dung vào nghiên cứu. Các bệnh nhân này có tuổi trung bình 22,7, số lượng TCD4 trung bình là 720 tế bào/mm 3 và nồng độ HIV-RNA trong máu là 4,8log bản sao/mL . Trong đó, 3 trường hợp mang đột biến kháng ARV là G190A trên gen reverse transcriptase và M46I, A71V trên gen protease, trong đó A71V không thuộc các đột biến có khả năng lây truyền trong cộng đồng [17] . Tần suất lan truyền chủng HIV kháng thuốc trong cộng đồng là 2,7% (KTC 95%: 0,3– 9,4%). 2. HIVKT trên bệnh nhân điều trò với ARV: 173 bệnh nhân được điều trò ARV (độ tuổi trung vò 31; 78,6% nam; 59,4% thuộc nhóm tiêm chích ma túy; 76,5% có số lượng tế bào lympho TCD4 ở thời điểm bắt đầu điều trò <100 tế bào/mm 3 ; 26,6% đã từng sử dụng ARV từ trước, thời gian điều trò ARV tại phòng khám ngoại trú (OPC) cho đến khi gửi mẫu xét nghiệm kháng thuốc trung bình là 19 tháng. Đánh giá thất bại điều trò chủ yếu dựa vào các chỉ tiêu miễn dòch học (75,1%) và/hoặc kết hợp với các tiêu chí lâm sàng (10,5%). Khi bắt đầu điều trò ARV, 94,2% bệnh nhân được điều trò theo phác đồ bậc 1, trong đó d4T/3TC/NVP chiếm 63,0%. 107 (61,8%) bệnh nhân có nồng độ HIV-RNA ≥ 3log bản sao/mL được làm xét nghiệm phát hiện HIV kháng thuốc. Kết quả phân tích cho thấy, 87,9% mang ít nhất 1 đột biến kháng chính với tỷ lệ kháng nhóm NRTI và NNRTI rất cao (86,0% và 84,1%). Kháng nhóm PI chỉ tìm thấy trên 3,7% quần thể nghiên cứu. Đối với nhóm NRTI, sự chọn lọc các đột biến chính M184V (85,9%), Q151M (14,1%), T69i (6,5%) và các đột biến TAMs (57,6%) đã dẫn đến tình trạng Huỳnh Hoàng Khánh Thư Cao học Di truyền K15 [...]... còn phụ thuộc vào các yếu tố của virút như số lượng đột biến cần để làm cho chúng trở nên kháng với các loại ARV, các týp di truyền của virút Virút HIV- 2 và các virút HIV- 1 nhóm O có tính kháng thuốc tự nhiên với một số thuốc ARV Trong các nghiên cứu in vitro, HIV- 2 có thể có thể đề kháng với một số thuốc ức chế men protease như Amprenavir và Atazanavir Tính đa dạng di truyền của virút HIV có thể cũng... quan đến tính kháng ARV Dưới áp lực của thuốc ARV, các chủng virút mang đột biến kháng thuốc sẽ chiếm ưu thế tồn tại, dẫn đến tình trạng kháng thuốc và lan truyền chủng kháng thuốc Sự Huỳnh Hoàng Khánh Thư Cao học Di truyền K15 5 kháng thuốc phụ thuộc vào nhiều yếu tố như loại thuốc sử dụng, phác đồ điều trò ARV, sự tuân thủ của bệnh nhân, liều lượng thuốc, sự ngưng thuốc, Ngoài ra tính kháng thuốc còn... trình dòch mã và cũng được kiểm soát bởi các tín hiệu của virút Hình 1.2: Cấu trúc bộ gen của virút HIV [48] a Cấu trúc bộ gen HIV- 1 và HIV- 2 b Các protein được mã hóa từ gen gag, pol và env 1.4 Chu trình nhân lên của virút HIV và những vò trí tác động của các phân tử thuốc kháng Retrovirút Sự nhân lên của HIV- 1 được diễn ra trong các tế bào đích chủ yếu là các tế bào lympho TCD4 và một số tế bào khác... sau: • Đánh giá mức độ lan truyền của virút HIV kháng thuốc trên những người mới nhiễm chưa tiếp cận ARV • Xác đònh tỷ lệ xuất hiện các chủng HIV kháng thuốc trên những bệnh nhân thất bại điều trò Huỳnh Hoàng Khánh Thư Cao học Di truyền K15 6 • Xác đònh các đột biến liên quan đến tính kháng thuốc ARV • Xác đònh một số yếu tố liên quan đến sự xuất hiện của HIV kháng thuốc Huỳnh Hoàng Khánh Thư Cao học... quá trình trưởng thành của virút Ức chế sự sát nhập DNA virút vào DNA bộ gen của tế bào chủ Ngăn cản sự hòa màng của virút vào tế bào chủ Cao học Di truyền K15 13 Hình 1 4: Các vò trí tác động của thuốc ARV [48] 1.6 Hiện tượng kháng thuốc ARV Sự kháng thuốc ARV của HIV được xác đònh khi có sự hiện diện các đột biến mang tính kháng thuốc ARV so với chủng HIV hoang dại nhạy cảm với thuốc Đây là những đột... nhiên trong các gen mã hóa cho các phân tử đích mà thuốc tác động (gen reverse transcriptase, gen protease hay integrase ) Dưới áp lực chọn lọc của thuốc ARV, virút mang các đột biến kháng thuốc dần dần chiếm ưu thế tồn tại và dẫn tới sự kháng thuốc 1.7 Hiện tượng kháng chéo giữa các thuốc ARV (cross resistance) Là tính kháng với những phân tử ARV mà virút chưa từng phơi nhiễm Các đột biến kháng thuốc xuất... việc giám sát đònh kỳ sự lan truyền các chủng HIV kháng thuốc trong cộng đồng là các vấn đề cần thiết góp phần đònh hướng chiến lược phòng chống và nâng cao hiệu quả sử dụng thuốc trong điều trò và dự phòng nhiễm HIV/ AIDS Trước thực tế đó, đề tài được thực hiện với mục tiêu chung là đánh giá tính kháng ARV và đặc điểm kháng thuốc của các chủng HIV trên bệnh nhân nhiễm HIV tại Tp HCM, bao gồm những mục... 1.1: Cấu trúc hình thể của HIV- 1[48] a Các thành phần của một hạt virút HIV- 1 b Vi ảnh điện tử của tế bào lympho sản sinh HIV- 1 c Hạt virút nảy chồi trên bề mặt tế bào lympho 1.3 Tổ chức bộ gen của virút HIV Cấu trúc di truyền của HIV- 1 bao gồm 3 gen cấu trúc chính : + Gen env (envelope) mã hóa cho gp120 và gp41 là các protein bề mặt của virút, có vai trò quan trọng trong quá trình virút xâm nhập vào tế... của enzyme phiên mã ngược RT: thuốc ức chế RT - Ức chế quá trình xâm nhập của DNA provirút vào trong nhân tế bào: tác động lên enzyme intergrase của virút Huỳnh Hoàng Khánh Thư Cao học Di truyền K15 12 - Ức chế quá trình cắt các protein tiền virút thành các protein cấu trúc và chức năng: thuốc ức chế protease 1.5 Các thuốc kháng retrovirút Các loại thuốc kháng retrovirút (ARV) hiện đang lưu hành có thể... mới có khả năng gây kháng thuốc Ví dụ: tính kháng thuốc đối với AZT xuất hiện khi xảy ra một loạt các đột biến M41L, D67N, K70R, L210W, T215Y và K219Q • Đột biến gây tính kháng chéo: một vò trí đột biến có thể gây ra tính kháng đối với nhiều thuốc khác nhau như Q151M gây kháng thuốc với AZT, ddI, d4T, ABC, … 1.9 Cách tính điểm đột biến và mức độ kháng thuốc Trình tự gen của mẫu bệnh phẩm được so sánh . sinh học của HIV 7 1.2. Cấu tạo hình thể của HIV- 1 7 1.3. Tổ chức bộ gen của virút HIV 8 1.4. Chu trình nhân lên của virút HIV và những vò trí tác động của các phân tử thuốc kháng retrovirút. NHIÊN ******* HUỲNH HỒNG KHÁNH THƯ TÌM HIỂU TÍNH KHÁNG THUỐC ANTIRETROVIRUS (ARV) CỦA VIRÚT HIV TRÊN CÁC BỆNH NHÂN NHIỄM HIV Chuyên ngành: Di truyền học – Khoa Sinh học Mã. loại ARV, các týp di truyền của virút. Virút HIV- 2 và các virút HIV- 1 nhóm O có tính kháng thuốc tự nhiên với một số thuốc ARV. Trong các nghiên cứu in vitro, HIV- 2 có thể có thể đề kháng với