Nguyễn Hồng Lộc Giáo trình CƠNG NGHỆ TẾ BÀO Nhà xuất Đại học Huế Năm 2006 PGS TS Nguyễn Hồng Lộc Giáo trình CƠNG NGHỆ TẾ BÀO Nhà xuất Đại học Huế Năm 2006 Mục lục Trang Lời nói đầu Chương Mở đầu I Cơng nghệ sinh học Công nghệ DNA tái tổ hợp Dung hợp tế bào Ứng dụng công nghệ sinh học đại II Công nghệ tế bào Chúng ta mong đợi thay đổi Quá trình sinh học xảy với tốc độ Hệ thống hoạt động điều chỉnh để đạt hiệu suất tối đa Các sản phẩm phân tách để có tinh cực đại giá thành tối thiểu III Quá trình sinh học Các ưu điểm Các nhược điểm IV Định nghĩa lên men Tài liệu tham khảo/đọc thêm Chương Sinh trưởng bất động tế bào I Xác định sinh trưởng tế bào Xác định số lượng tế bào Xác định sinh khối tế bào Các phương pháp gián tiếp II Bất động tế bào Gắn lên bề mặt Tạo thể xốp Sử dụng bao vi thể Tự kết khối III Một số thí nghiệm điển hình Đường cong sinh trưởng nấm men Đường cong sinh trưởng thực vật Bất động tế bào thực vật Tài liệu tham khảo/đọc thêm 2 3 7 8 10 11 11 11 13 14 16 16 16 18 18 18 18 20 21 22 201 Chương Động học sinh trưởng tế bào I Mở đầu II Định nghĩa III Chu kỳ sinh trưởng nuôi cấy mẻ Pha lag Pha sinh trưởng theo hàm mũ Các nhân tố ảnh hưởng đến tốc độ sinh trưởng đặc trưng Pha tĩnh pha chết IV Các ký hiệu Tài liệu tham khảo/đọc thêm Chương Thiết kế hệ lên men I Hệ lên men thùng khuấy Hệ lên men dòng nút (PFF) mẻ (batch) Hệ lên men thùng khuấy liên tục (CSTF) lý tưởng Ước lượng thông số động học Monod Hiệu suất CSTF So sánh nuôi cấy hệ lên men mẻ hệ lên men thùng khuấy liên tục II Thu hồi tế bào Thu hồi tế bào PFF Thu hồi tế bào CSTF III Các hệ lên men khác Hệ lên men cột Hệ lên men vòng IV Các ký hiệu Tài liệu tham khảo/đọc thêm Chương Nuôi cấy tế bào vi sinh vật I Tế bào vi sinh vật II Vi khuẩn Hình dạng Kiểu sinh trưởng Các điều kiện vật lý ảnh hưởng đến sinh trưởng III Vi nấm Nấm men Nấm mốc IV Môi trường nuôi cấy Môi trường tự nhiên 23 23 24 26 26 28 29 31 31 32 33 33 35 38 41 43 45 46 46 49 51 52 54 55 57 58 58 61 61 61 61 62 63 63 64 65 202 Môi trường tổng hợp Khử trùng Nuôi cấy V Sản xuất kháng sinh Sản xuất penicillin Sản xuất streptomycin VI Sản xuất thuốc công nghệ DNA tái tổ hợp Insulin Interferon Hormone Vaccine Một số loại thuốc khác VII Sản xuất enzyme Tài liệu tham khảo/đọc thêm Chương Nuôi cấy tế bào động vật I Mở đầu Các ưu điểm nuôi cấy tế bào động vật Một số hạn chế nuôi cấy tế bào động vật II Tế bào động vật Các tế bào dịch huyền phù Các tế bào dính bám III Môi trường nuôi cấy IV Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật Hệ thống sản xuất Tối ưu hóa mơi trường dinh dưỡng tế bào vật chủ V Các kháng thể đơn dòng Dung hợp tế bào Thử nghiệm kháng thể IV Sản xuất thuốc DNA vaccine Interferon Hoạt tố plasminogen mô DNA vaccine VII Tế bào động vật sử dụng cấy ghép VIII Tạo quan từ tế bào động vật ni cấy IX Mơ hình thực nghiệm Tài liệu tham khảo/đọc thêm 65 65 66 66 66 68 69 69 70 70 71 72 74 76 77 77 78 78 80 80 80 81 83 84 86 87 88 90 91 91 92 92 94 97 98 99 203 Chương Nuôi cấy tế bào thực vật I Mở đầu II Tế bào thực vật III Các loại nuôi cấy tế bào mô thực vật Sinh trưởng khơng phân hóa Sinh trưởng có phân hóa IV Mơi trường ni cấy V Sản xuất chất thứ cấp Các chất thứ cấp dùng thực phẩm Các chất thứ cấp dùng dược phẩm VI Sản xuất protein tái tổ hợp GM-CSF người Kháng thể IgG1 chuột Interleukin VII Chọn dòng tế bào biến dị soma VIII Dung hợp protoplast hay lai vơ tính tế bào thực vật Tài liệu tham khảo/đọc thêm Chương Công nghệ DNA tái tổ hợp I DNA RNA II Tạo dịng gen Các trình tự DNA Sự kết hợp phân tử DNA III Khả ổn định vi sinh vật tái tổ hợp Động học lên men nuôi cấy tái tổ hợp Nuôi cấy hệ thống lên men thùng khuấy liên tục Các phương pháp ổn định IV Biến đổi di truyền tế bào thực vật Kỹ thuật gen Biến nạp gen V Biến đổi di truyền tế bào động vật Kỹ thuật gen Biến nạp gen VI Các ký hiệu Tài liệu tham khảo/đọc thêm Chương Tiệt trùng I Các phương pháp tiệt trùng Nhiệt 100 100 102 104 104 105 107 108 111 114 116 117 119 119 120 120 122 123 123 127 127 129 131 133 136 138 139 140 143 144 144 145 149 150 151 151 151 204 Hóa chất Tia cực tím Sóng siêu âm Lọc II Động học tượng chết nhiệt III Tiêu chuẩn thiết kế IV Tiệt trùng mẻ V Tiệt trùng liên tục Bộ phận đun nóng Bộ phận giữ nóng Bộ phận làm lạnh Tiệt trùng khơng khí VI Các ký hiệu Tài liệu tham khảo/đọc thêm Chương 10 Khuấy trộn thơng khí I Mở đầu Con đường chuyển khối II Các khái niệm chuyển khối Sự khuếch tán phân tử chất lỏng Hệ số chuyển khối Cơ chế chuyển khối III Xác định vùng phân giới IV Tắc nghẽn khí Phun khí khuấy trộn khơng học Phun khí khuấy trộn học V Xác định tốc độ hấp thụ oxygen Phương pháp oxy hóa sodium sulfite Kỹ thuật tách khơng khí Xác định trực tiếp Kỹ thuật động lực học VI Các ký hiệu Tài liệu tham khảo/đọc thêm Phụ lục Một số thuật ngữ Mục lục 152 152 152 152 153 154 154 156 157 157 161 161 166 168 169 169 171 171 171 173 175 176 177 178 178 179 181 182 183 183 184 186 187 201 205 Lời nói đầu Công nghệ tế bào phận quan trọng công nghệ sinh học, chủ yếu nghiên cứu q trình ni cấy tế bào động-thực vật vi sinh vật để sản xuất sinh khối, sản xuất hợp chất có hoạt tính sinh học (enzyme, vaccine, chất thứ cấp…), để làm mơ hình thực nghiệm khảo sát tác động hoá chất, làm nguyên liệu ghép tế bào quan… Mặc dù, kỹ thuật nuôi cấy tế bào phát triển vào nửa đầu kỷ 20, đến ứng dụng chúng có bước tiến vượt bậc nhờ đóng góp cơng nghệ DNA tái tổ hợp Bên cạnh giáo trình như: sinh học phân tử, nhập môn công nghệ sinh học, công nghệ DNA tái tổ hợp, cơng nghệ chuyển gen… giáo trình cơng nghệ tế bào giúp sinh viên tiếp cận thêm lĩnh vực khác công nghệ sinh học thông qua việc cung cấp kiến thức vấn đề sau: - Sinh trưởng động học sinh trưởng tế bào - Thiết kế hệ lên men - Nuôi cấy tế bào ứng dụng chúng Giáo trình cơng nghệ tế bào biên soạn theo hướng khảo sát trình sinh học mang tính cơng nghệ nhiều trình lên men ứng dụng cho tế bào vi sinh vật, lẫn tế bào động-thực vật thiết bị ni cấy (bioreactor/fermenter) Do đó, số ứng dụng khác kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào nói chung chúng tơi khơng đưa vào giáo trình Lĩnh vực cơng nghệ tế bào rộng đa dạng, giáo trình xuất lần nên khó tránh khỏi thiếu sót chưa đáp ứng yêu cầu bạn đọc Vì thế, chúng tơi mong nhận nhiều ý kiến đóng góp để lần xuất sau hồn thiện Tác giả Chương Mở đầu I Công nghệ sinh học Đến có nhiều định nghĩa cách diễn đạt khác công nghệ sinh học tùy theo tác giả tổ chức Tuy nhiên, cơng nghệ sinh học (biotechnology) định nghĩa cách tổng quát sau: “Công nghệ sinh học q trình sản xuất quy mơ công nghiệp mà nhân tố tham gia trực tiếp định tế bào sống (vi sinh vật, thực vật động vật) Mỗi tế bào sống thể sinh vật hoạt động lĩnh vực sản xuất xem lò phản ứng nhỏ” Nếu công nghệ sinh học định nghĩa theo hướng khơng thể thừa nhận lĩnh vực khoa học Bởi vì, từ xa xưa loài người biết sử dụng vi sinh vật để lên men bánh mì thực phẩm, cho dù họ chế biến đổi sinh học Loài người biết từ lâu việc lai tạo động vật thực vật để cải thiện suất vật nuôi trồng tốt Vì thế, cơng nghệ sinh học định nghĩa xem công nghệ sinh học truyền thống Tuy nhiên, năm gần thuật ngữ công nghệ sinh học thường sử dụng nhằm đề cập đến kỹ thuật DNA tái tổ hợp dung hợp tế bào, xem lĩnh vực công nghệ sinh học đại Công nghệ DNA tái tổ hợp (DNA recombinant technology) Là kỹ thuật cho phép thao tác trực tiếp nguyên liệu di truyền tế bào riêng biệt, sử dụng để phát triển vi sinh vật sản xuất sản phẩm thể hữu ích khác Những kỹ thuật gọi kỹ thuật di truyền (genetic engineering), công nghệ di truyền (genetic technology), thao tác gen (gene manipulation), kỹ thuật gen (gene engineering) hay công nghệ gen (gene Công nghệ tế bào technology) Mục tiêu cơng nghệ DNA tái tổ hợp gắn gen ngoại lai (foreign gene) mã hóa cho sản phẩm mong muốn vào dạng DNA mạch vịng (plasmid vector) sau đưa chúng vào thể vật chủ, cho gen ngoại lai biểu để sản xuất sản phẩm từ thể Dung hợp tế bào (cell fusion) Là trình hình thành tế bào lai đơn (single hybrid cell) với nhân tế bào chất từ hai loại tế bào riêng biệt để tổ hợp đặc điểm mong muốn hai loại tế bào Chẳng hạn, tế bào đặc biệt hệ thống miễn dịch sản xuất kháng thể hữu ích Tuy nhiên, tế bào thường khó ni cấy tốc độ sinh trưởng chúng chậm Mặt khác, tế bào khối u định có đặc điểm phân chia nhanh Bằng cách dung hợp hai tế bào này, tế bào lai hybridoma tạo mang hai tính trạng Các kháng thể đơn dòng (monoclonal antibodies-Mabs) sản xuất từ tế bào lai, dùng để chẩn đoán, điều trị bệnh tinh protein Ứng dụng công nghệ sinh học đại Các ứng dụng công nghệ sinh học đại nhiều (Bảng 1.1) Các dược phẩm đắt triền trước insulin để chữa bệnh đái tháo đường, hormone sinh trưởng người để điều trị bệnh còi trẻ em, interferon để chống viêm nhiễm, vaccine phòng bệnh kháng thể đơn dịng dùng để chẩn đốn sản xuất tế bào biến đổi di truyền tế bào lai rẻ tiền với số lượng lớn Các giống bệnh khoẻ mạnh hơn, vật nuôi dùng làm thực phẩm có sản lượng cao phát triển, lồi trồng quan trọng biến đổi di truyền để có tính trạng chống chịu stress, chống chịu chất diệt cỏ kháng côn trùng Hơn nữa, cơng nghệ DNA tái tổ hợp ứng dụng để phát triển vi sinh vật biến đổi di truyền (genetically modification) cho chúng sản xuất hợp chất hóa học khác với sản lượng cao vi sinh vật bình thường Cơng nghệ tế bào Bảng 1.1 Các ứng dụng công nghệ sinh học đại Lĩnh vực Các sản phẩm ứng dụng Dược phẩm Kháng sinh, kháng nguyên (kích thích đáp ứng kháng thể), endorphin (chất dẫn truyền thần kinh), γglobulin (ngăn cản viêm nhiễm), hormone sinh trưởng người (điều trị trẻ em bị bệnh còi), albumin huyết người (điều trị chấn thương thể), nhân tố điều hòa miễn dịch, insulin, interferon (điều trị bệnh viêm nhiễm), interleukin (điều trị bệnh nhiễm trùng ung thư), lymphokine (phản ứng miễn dịch điều chỉnh), kháng thể đơn dòng (chẩn đốn phân phối thuốc), peptide hoạt hóa thần kinh (bắt chước peptide điều khiển đau thể), nhân tố hoạt hóa plasminogen mơ (hịa tan cục máu đơng), vaccine Chăn ni-Thú y Phát triển giống bệnh mạnh khoẻ hơn, gia súc cho thịt có sản lượng cao Trồng trọt Chuyển tính trạng chống chịu stress, kháng trùng chất diệt cỏ vào lồi trồng, phát triển giống trồng có khả tăng trình quang hợp cố định đạm, phát triển thuốc trừ sâu sinh học vi khuẩn nhân khơng đóng băng (non-ice nucleating) Các hóa chất đặc biệt Các amino acid, enzyme, vitamin, lipid, chất thơm hydroxyl hóa, polymer sinh học Các ứng dụng mơi trường Ngâm chiết khống, đặc kim loại, kiểm sốt nhiễm, phân hủy chất thải độc thu hồi dầu loang Các hóa chất thương mại Acetic acid, acetone, butanol, ethanol, nhiều sản phẩm khác từ trình biến đổi sinh khối Điện tử sinh học Biosensor, biochip Công nghệ tế bào II Công nghệ tế bào Các công nghệ DNA tái tổ hợp dung hợp tế bào khởi đầu nghiên cứu túy kết cuối phát triển thành loại tế bào sản xuất sản phẩm với số lượng ỏi qui mơ phịng thí nghiệm Tuy nhiên, kết nói lại có ý nghĩa thương mại địi hỏi phải phát triển thành quy trình cơng nghiệp với cơng nghệ khả thi có hiệu kinh tế Để phát triển q trình sản xuất quy mơ phịng thí nghiệm thành quy trình cơng nghiệp lớn, khơng thể đơn tăng kích thước bình ni cấy (vessel) lên Ví dụ: Ở quy mơ phịng thí nghiệm 100 mL, bình tam giác nhỏ nuôi máy lắc phương thức lý tưởng để nuôi cấy tế bào Nhưng hoạt động quy mô lớn 2.000 L, sử dụng bình ni khác tích lớn lắc nó, mà cần phải thiết kế hệ lên men (fermenter) hay gọi nồi phản ứng sinh học (bioreactor) hiệu để nuôi cấy tế bào điều kiện tối ưu Vì thế, công nghệ tế bào (một lĩnh vực cơng nghệ sinh học) có vai trị quan trọng thương mại hóa sản phẩm Để minh họa vai trị cơng nghệ tế bào, xem q trình sinh học đặc trưng bao gồm tế bào vi khuẩn trình bày hình 1.1 Các ngun liệu thơ (thường sinh khối) xử lý trộn với thành phần cần thiết khác để tế bào sinh trưởng tốt hỗn hợp dịch lỏng, môi trường nuôi cấy khử trùng để loại bỏ tất thể sống đưa vào bình ni cấy hình trụ lớn, thiết bị đặc trưng với cánh khuấy, vách ngăn, hệ thống thơng khí phận cảm biến để điều chỉnh điều kiện lên men Một chủng vi sinh vật khiết đưa vào bình ni cấy Các tế bào khởi đầu sinh sản theo hàm mũ sau thời gian định pha lag đạt tới nồng độ tế bào cực đại môi trường bị sử dụng hết Sự lên men dừng lại thành phần hút để thu hồi sản phẩm tinh chúng Quá trình hoạt động theo kiểu lên men mẻ (batch culture) liên tục (continuous culture) Khi tiến hành trình sinh học (bioprocessing) quy mô lớn cần lưu ý: - Phải thu chất xúc tác sinh học tốt (vi sinh vật, tế bào động vật, tế bào thực vật, enzyme) cho q trình mong muốn Cơng nghệ tế bào - Tạo môi trường tốt cho xúc tác cách thiết kế bioreactor/fermenter thích hợp cho hoạt động phương thức tối ưu - Phân tách sản phẩm mong muốn từ hỗn hợp phản ứng phương thức kinh tế Các nhiệm vụ đặt bao gồm thiết kế phát triển trình sinh học Các vấn đề địi hỏi cho công việc sau: Nuôi cấy stock Nguyên liệu thô Nuôi cấy lắc Chuẩn bị môi trường Hệ lên men kết hạt Khử trùng Hệ lên men sản xuất Khơng khí Thu hồi Tinh Các sản phẩm Xử lý nước thải Hình 1.1 Một trình sinh học đặc trưng Chúng ta mong đợi thay đổi Để trả lời câu hỏi này, cần phải có hiểu biết khoa học q trình cơng nghệ Đó vi sinh vật học, hóa sinh học, di truyền học, sinh học phân tử Chúng ta cần phải tìm hiểu vấn đề phạm vi định Điều quan trọng chất xúc tác sinh học chọn lọc sửa đổi di truyền phải thích hợp cho hoạt động sản xuất quy mơ lớn Cơng nghệ tế bào Q trình sinh học xảy với tốc độ Nếu q trình định sản xuất sản phẩm, điều quan trọng cần biết q trình xảy với tốc độ Động học trình chi phối tốc độ phản ứng ảnh hưởng điều kiện vật lý hóa học định Chúng ta cần nắm vững hóa động học (chemical kinetics) để thiết kế nồi phản ứng (reactor) thích hợp Các kỹ thuật tương tự ứng dụng để giải động học enzyme (enzyme kinetics) động học tế bào (cell kinetics) Để thiết kế hệ lên men hiệu cho chất xúc tác sinh học hoạt động, điều quan trọng cần biết tốc độ phản ứng bị ảnh hưởng điều kiện hoạt động không giống Điều bao gồm nghiên cứu nhiệt động học (thermodynamics), tượng vận chuyển, tương tác sinh học, khả ổn định dòng tế bào vi sinh vật (hoặc tế bào động vật thực vật) dùng làm nguyên liệu sản xuất Hệ thống hoạt động điều chỉnh để đạt hiệu suất tối đa Để hoạt động điều chỉnh hệ thống tối ưu, cần phải phát triển cảm biến trực tuyến (on-line sensor) xác Thuật toán tối ưu trực tuyến cần xây dựng tối ưu hóa để tăng cường khả hoạt động trình sinh học đảm bảo trình hoạt động cách kinh tế Các sản phẩm phân tách để có tinh cực đại giá thành tối thiểu Đối với bước này, trình bio-downstream (phân tách sinh học), sử dụng kỹ thuật phân tách khác phát triển q trình hóa học chưng cất, hấp thụ, tách chiết, hấp phụ, sấy khô, lọc, kết tủa ngâm chiết Hơn nữa, song song với kỹ thuật phân tách tiêu chuẩn này, cần thiết phát triển kỹ thuật thích hợp để phân tách nguyên liệu sinh học Nhiều kỹ thuật phát triển để phân tách phân tích nguyên liệu sinh học quy mơ phịng thí nghiệm, sắc ký (chromatography), điện di (electrophoresis) thẩm tách (dialysis) Các kỹ thuật cần nghiên cứu thêm cho chúng hoạt động hiệu quy mô công nghiệp Công nghệ tế bào III Quá trình sinh học Các ứng dụng cơng nghiệp q trình sinh học sử dụng tế bào sống thành phần chúng để thực thay đổi vật lý hóa học So với q trình hóa học truyền thống, q trình sinh học có ưu điểm nhược điểm sau: Các ưu điểm - Điều kiện phản ứng nhẹ nhàng Điều kiện phản ứng cho q trình sinh học nhẹ nhàng-ơn hịa Đặc trưng nhiệt độ phịng, áp suất khí pH mơi trường trung tính Kết quả, hoạt động nguy hiểm điều kiện sản xuất phức tạp so với q trình hóa học đặc biệt - Tính đặc hiệu Một chất xúc tác enzyme có tính đặc hiệu cao xúc tác phản ứng hóa học Sự đa dạng enzyme có xúc tác cho phạm vi rộng phản ứng khác - Tính hiệu lực Tốc độ phản ứng xúc tác enzyme thường nhanh nhiều so với phản ứng thực nhờ chất xúc tác sinh học Chỉ lượng nhỏ enzyme yêu cầu đủ để sản xuất hiệu mong muốn - Các tài ngun đổi Ngun liệu thơ chủ yếu trình sinh học sinh khối (biomass) cung cấp khung carbon lẫn lượng cần cho tổng hợp hóa chất hữu - Công nghệ DNA tái tổ hợp Là kỹ thuật sửa đổi hệ thống di truyền nhằm nâng cao suất sinh học Sự phát triển kỹ thuật hứa hẹn khả khổng lồ để cải thiện trình sinh học Các nhược điểm - Các hỗn hợp sản phẩm phức tạp Trong trường hợp nuôi cấy tế bào (vi sinh vật, thực vật động vật) Các phản ứng đa enzyme xảy chuỗi song song, hỗn hợp sản phẩm cuối chứa khối lượng tế bào, nhiều sản phẩm trao đổi chất phụ, phần lại chất dinh dưỡng ban đầu Khối lượng tế bào chứa thành phần khác tế bào - Các môi trường nước lỗng Các thành phần có giá trị thương mại sản xuất với lượng nhỏ môi trường nước nên phân Công nghệ tế bào tách chúng đắt tiền Bởi sản phẩm trình sinh học thường mẫn cảm với nhiệt, kỹ thuật phân tách truyền thống sử dụng mà phải phát triển kỹ thuật phân tách cho mục đích sản xuất quy mô lớn - Sự nhiễm bẩn Hệ thống lên men dễ dàng bị nhiễm bẩn, nhiều vi khuẩn nấm mốc sinh trưởng mạnh hầu hết môi trường nuôi cấy Vấn đề trở nên khó khăn ni cấy tế bào động vật thực vật chúng cần thời gian sinh trưởng dài ngày tốc độ sinh trưởng chúng chậm nhiều so với tốc độ sinh trưởng vi khuẩn nấm mốc môi trường nhiễm bẩn - Khuynh hướng hay biến đổi Các tế bào có khuynh hướng đột biến thay đổi mơi trường vài đặc điểm gây thiệt hại cho thành cơng q trình sản xuất Các enzyme tương đối mẫn cảm phân tử không ổn định đòi hỏi cẩn thận sử dụng chúng IV Định nghĩa lên men Thông thường, lên men (fermentation) định nghĩa trình sản xuất ethanol lactic acid từ glucose (C6H12O6) - Quá trình sản xuất ethanol Là trình mà số nấm men phân giải loại đường môi trường yếm khí để sản xuất rượu ethanol - Quá trình sản xuất lactic acid Là trình mà số enzyme lactodehydrogenase phân giải chất trung gian NADH (trong đường phân yếm khí) thành lactic acid không thành ethanol Lên men lactic dùng công nghệ chế biến sữa để làm phomát sữa chua nấm men C6H12O6 2C2H5OH + 2CO2 enzyme C6H12O6 2CH3CHOHCOOH Tuy nhiên, ngày người ta mở rộng định nghĩa cho khái niệm sau: “Lên men trình sử dụng enzyme biến đổi hợp chất hữu cơ” theo Webster’s New College Dictionary (A Merriam-Webster Công nghệ tế bào 1977) định nghĩa mà chúng tơi sử dụng giáo trình dùng để mơ tả q trình ni cấy tế bào vi sinh vật, động vật thực vật hệ lên men hay nồi phản ứng sinh học Tài liệu tham khảo/đọc thêm Atkinson B and Mavituna F 1991 Biochemical Engineering and Biotechnology Handbook 2nd ed Stockton Press, New York, USA Flickinger MC and Drew SW 1999 Encyclopedia of Bioprocess Technology: Fermentation, Biocatalysis and Bioseparation John Wiley & Sons, New York, USA Lee JM 2001 Biochemical Engineering Prentice Hall, Inc USA Ratledge C and Kristiansen B 2002 Basic Biotechnology Cambridge University Press, UK Shuler ML and Kargi F 2002 Bioprocess Engineering-Basic Concepts 2nd ed Prentice Hall, Inc New Jersey, USA Công nghệ tế bào 10 Chương Sinh trưởng bất động tế bào I Xác định sinh trưởng tế bào Trong hệ thống sinh học, sinh trưởng định nghĩa tăng thành phần hóa học Tăng đơn khối lượng phản ánh đầy đủ sinh trưởng, tế bào tăng hàm lượng sản phẩm dự trữ chúng glycogen, poly-βhydroxybutyrite Sự sinh trưởng cân (balanced growth) định nghĩa sinh trưởng mà suốt q trình nhân đơi sinh khối xảy với nhân đôi tất đặc tính xác định khác quần thể protein, DNA, RNA nước nội bào Mặt khác, trình ni cấy trải qua sinh trưởng cân trì thành phần hóa học khơng đổi Trong mơi trường dinh dưỡng thích hợp mà sau tế bào trở nên thích nghi trạng thái sinh trưởng cân Tiếp theo trình sinh trưởng, cần phải xác định số lượng tế bào Sự sinh trưởng tế bào xác định số lượng tế bào, sinh khối tế bào hoạt tính tế bào Xác định số lượng tế bào 1.1 Đếm kính hiển vi Số lượng tế bào quần lạc đếm kính hiển vi cách đếm tế bào đưa vào buồng đếm đặc biệt Có hai loại buồng đếm dùng để đếm số lượng tế bào mẫu dịch lỏng: - Haemocytomete Buồng đếm tế bào máu dùng cho tế bào có đường kính ≥ µm (Hình 2.1) - Petroff-Hausser counting chamber Buồng đếm Petroff-Hausser dùng chủ yếu cho vi khuẩn Cả hai loại buồng đếm có đường kẻ ô vuông đặc trưng bề mặt kính (lam kính) Khung đỡ mặt đếm (grid) giữ kính phủ (cover glass) cách đếm khoảng cách biết (ví dụ: 0,1 mm) cho thể tích vng biết xác Một mẫu dịch huyền phù tế bào cần đếm cho chảy qua phủ làm Cơng nghệ tế bào 11 đầy buồng đếm Sau đó, đếm số lượng tế bào đơn vị diện tích đường kẻ kính hiển vi Các dịch huyền phù đậm đặc đếm chúng pha lỗng thích hợp Một số ưu điểm phương pháp đếm trực tiếp: - Chỉ cần thiết bị tối thiểu - Các kết thu nhanh - Có thể quan sát đặc điểm hình thái thể Đưa mẫu vào Tấm kính phủ Độ sâu mẫu 0,1 mm Buồng đếm Khung đỡ kính Hình 2.1 Buồng đếm haemocytometer Một số nhược điểm phương pháp đếm trực tiếp: - Thường khó phân biệt tế bào chết tế bào sống - Khơng thích hợp cho dịch huyền phù có mật độ thấp - Các tế bào có kích thước nhỏ thường khó quan sát kính hiển vi khơng thấy đếm - Phương pháp đếm thực tế gây mỏi mệt nhầm lẫn q trình đếm - Khơng thích hợp tế bào xếp thành cụm mycelium (thể sợi nấm) 1.2 Đếm tế bào phát triển đĩa nuôi cấy (petri dish) Các tế bào phát triển định nghĩa tế bào phân chia tạo khuẩn lạc Có hai cách để thực phương pháp đếm đĩa petri: phương pháp đĩa trải (spread plate) phương pháp đĩa rót (pour plate) Với phương pháp đĩa trải, thể tích nhỏ 100 µL trải khắp bề mặt agar Với phương pháp đĩa rót, mẫu vật trộn với agar nóng Cơng nghệ tế bào 12 chảy (đã để nguội đến khoảng 60oC) rót đĩa vơ trùng Các đĩa sau ni xuất khuẩn lạc, số lượng khuẩn lạc đếm trực tiếp Điều quan trọng số lượng khuẩn lạc phát triển đĩa phải không lớn không nhỏ Để thu số lượng tế bào thích hợp đơn vị diện tích mẫu vật phải pha loãng Trường hợp cần pha loãng nhiều, người ta thường sử dụng kỹ thuật pha loãng (serial dilution) Ví dụ: để thực pha lỗng 1/106, thực ba lần pha lỗng liên tiếp 1/100 sáu lần pha loãng liên tiếp 1/10 1.3 Đếm máy đếm Để tránh đơn điệu đếm trực tiếp kính hiển vi, sử dụng phương pháp đếm máy đếm Kỹ thuật cho phép không đếm số lượng tế bào, mà cịn đo kích thước tế bào Nhược điểm phương pháp khơng thể phân biệt tế bào phần tử bẩn khác Kỹ thuật khó sử dụng với thể dạng chuỗi không đem lại kết tốt với thể dạng hệ sợi (ví dụ nấm) Xác định sinh khối tế bào 2.1 Trọng lượng khô tế bào Trọng lượng khô tế bào xác định trực tiếp cách lấy lượng tối thiểu dịch huyền phù tế bào để ly tâm Sau đổ thể nổi, tế bào rửa nước cất để loại bỏ tất chất hòa tan Dịch huyền phù ly tâm lần tế bào sau kết đặc lại sấy khô tủ sấy cân để xác định trọng lượng Đây phương thức trực tiếp để xác định số lượng sinh khối tế bào Tuy nhiên, cách xác định tốn nhiều thời gian dễ bỏ qua thay đổi nhỏ sinh khối tế bào Kỹ thuật sử dụng dịch huyền phù dày đặc tế bào phải rửa hoàn toàn khỏi chất ngoại sinh bám vào 2.2 Độ đục dịch huyền phù tế bào Sinh khối tế bào xác định phương pháp quang học thông qua xác định lượng ánh sáng bị tán xạ dịch huyền phù tế bào Kỹ thuật dựa sở lập luận phần tử nhỏ tán xạ ánh sáng cách tương xứng, giới hạn định, tới nồng độ chúng Khi tia sáng xuyên qua dịch huyền phù tế bào, lượng ánh sáng truyền Cơng nghệ tế bào 13 qua bị giảm kết tán xạ, phương pháp xác định mật độ tế bào Việc đo độ đục dịch huyền phù tế bào thường thực máy quang phổ để đọc đơn vị hấp thụ (A) Khả hấp thụ (absorbency) định nghĩa số logarithm tỷ lệ cường độ ánh sáng va chạm vào dịch huyền phù tế bào (Io) cường độ ánh sáng truyền qua dịch huyền phù (I): A = log Io I Đường cong chuẩn (standard curve) thu cách đo độ hấp thụ (A) mẫu với nồng độ tế bào biết trước Việc đo thường thực bước sóng từ 600-700 nm Các phương pháp gián tiếp Phương pháp gián tiếp để xác định sinh khối tế bào dựa phép tính hệ số tỷ lượng toàn phần (overall stoichiometry) cho sinh trưởng tạo thành sản phẩm, trình bày dạng chung sau: nguồn carbon + nguồn nitrogen + phosphate + O2 → sinh khối tế bào + CO2 + H2O + sản phẩm + nhiệt Sự thay đổi sinh khối tế bào kiểm sốt gián tiếp cách xác định tiêu thụ chất dinh dưỡng, tạo thành sản phẩm, thành phần tế bào, giải phóng nhiệt tính chất vật lý khác dịch nuôi cấy tế bào 3.1 Sự tiêu thụ chất dinh dưỡng Cần chọn chất dinh dưỡng mà chất không sử dụng để tổng hợp sản phẩm trao đổi chẩt Phosphate, sulfate magnesium chọn lựa tốt Khi sinh khối tế bào sản phẩm chính, nồng độ nguồn carbon cịn lại mơi trường đo để đánh giá sinh khối tế bào Công nghệ tế bào 14 ... pháp tiệt trùng Nhiệt 10 0 10 0 10 2 10 4 10 4 10 5 10 7 10 8 11 1 11 4 11 6 11 7 11 9 11 9 12 0 12 0 12 2 12 3 12 3 12 7 12 7 12 9 13 1 13 3 13 6 13 8 13 9 14 0 14 3 14 4 14 4 14 5 14 9 15 0 15 1 15 1 15 1 204 Hóa chất Tia cực... 15 2 15 2 15 2 15 2 15 3 15 4 15 4 15 6 15 7 15 7 16 1 16 1 16 6 16 8 16 9 16 9 17 1 17 1 17 1 17 3 17 5 17 6 17 7 17 8 17 8 17 9 18 1 18 2 18 3 18 3 18 4 18 6 18 7 2 01 205 Lời nói đầu Cơng nghệ tế bào phận quan trọng công nghệ. .. sinh trưởng thực vật Bất động tế bào thực vật Tài liệu tham khảo/đọc thêm 2 3 7 8 10 11 11 11 13 14 16 16 16 18 18 18 18 20 21 22 2 01 Chương Động học sinh trưởng tế bào I Mở đầu II Định nghĩa III