3.2 Tạo thành sản phẩm Điều quan trọng cần kiểm tra sản phẩm tạo thành có kết hợp với sinh trưởng hay không Một số sản phẩm tạo thành sau sinh khối tế bào đạt tới pha tĩnh (stationary phase) chu kỳ sinh trưởng thế, khơng kết hợp với sinh trưởng Sự giải phóng CO2 xác định có quan hệ tỷ lượng sinh trưởng tế bào Một sản phẩm hoàn toàn chung cho phản ứng lên men ion H+ Lượng kiềm bổ sung vào dịch lên men trì độ pH thích hợp cho sinh trưởng 3.3 Các thành phần tế bào Đối với nuôi cấy trải qua sinh trưởng cân bằng, thành phần tế bào thuộc nhóm đại phân tử protein, RNA DNA xác định thay cho sinh khối tế bào Tuy nhiên, cần phải thận trọng tỷ lệ nguyên liệu tế bào thay đổi theo thời gian nuôi cấy không trải qua sinh trưởng cân 3.4 Giải phóng nhiệt Sự sinh trưởng tế bào phát nhiệt Lượng nhiệt phát tùy thuộc vào hiệu suất sử dụng lượng carbon Vì thế, việc xác định nhiệt độ hệ lên men kết hợp gián tiếp với sinh trưởng tế bào Tuy nhiên, lượng nhiệt tồn phần tích lũy hệ lên men phụ thuộc vào hiệu phối hợp nguồn sinh nhiệt nhiệt khác như: nhiệt từ trình khuấy bay hơi, nhiệt tiêu hao xung quanh thành hệ lên men nhiệt nhạy (sensible heat) luồng khơng khí Vì thế, để xác định sinh trưởng giải phóng nhiệt, cần phải thiết lập cân lượng hệ lên men công việc không dễ dàng 3.5 Độ nhớt Sinh trưởng thể hệ sợi (nấm) tạo thành polysaccharide làm tăng độ nhớt dịch lên men (fermentation broth) Vì thế, việc xác định độ nhớt dịch lên men hữu ích q trình lên men quy mô công nghiệp Độ nhớt biểu kiến đo tốc độ dịch chuyển cố định dùng để đánh giá nồng độ tế bào nồng độ sản phẩm Công nghệ tế bào 15 II Bất động tế bào Phương pháp bất động (immobilization) tế bào hồn chỉnh có nhiều ưu điểm kỹ thuật nuôi cấy truyền thống Bằng cách bất động tế bào, việc thiết kế quy trình đơn giản tế bào gắn với phần tử lớn bề mặt phân tách dễ dàng khỏi dòng sản phẩm Điều đảm bảo hoạt động liên tục hệ lên men không bị nguy rửa trơi tế bào Sự bất động cung cấp điều kiện có lợi cho phân hóa tế bào truyền đạt thông tin tế bào, cách thúc đẩy sản phẩm có sản lượng chất trao đổi thứ cấp cao Sự bất động bảo vệ tế bào cách làm giảm cố liên quan tới lực trượt (shear forces) gây tổn thương tế bào Các phương pháp bất động tế bào phân chia thành bốn nhóm tóm tắt bảng 2.1 Gắn lên bề mặt Các tế bào gắn lên bề mặt mảnh gỗ nhỏ, collagen, microcarrier, nhựa tổng hợp trao đổi ion (resin) Một ví dụ kiểu bất động sử dụng microcarrier cho tế bào động vật Ưu điểm microcarrier cung cấp diện tích bề mặt lớn để gắn tế bào Vật liệu cho microcarrier bao gồm nhựa tổng hợp trao đổi ion, hạt nhỏ dựa sở dextran bọc gelatin, hạt polyacrylamide, hạt polystyrene, hạt thủy tinh rỗng, hạt cellulose hình trụ, giọt floruacarbon nhỏ ổn định polylysine Hiện nay, microcarrier dựa dextran sử dụng rộng rãi để bất động tế bào động vật Tạo thể xốp Phương pháp cho phép tế bào khuếch tán thể xốp có sẵn cordierite pore glass (hạt thủy tinh có nhiều lỗ rỗng nhỏ), chúng sinh trưởng giữ lại Ưu điểm phương pháp vật liệu tạo thể xốp có sẵn chống chịu phân hủy bình ni có khuấy từ loại vật liệu tạo thể xốp khác (alginate, acrylamide…), thể xốp thường khơng có hại tế bào Tuy nhiên, phương pháp gặp khó khăn việc hướng tới nồng độ cao tế bào thể tích lỗ thủy tinh (pore) bị giới hạn chúng làm sẵn loại vật liệu tạo thể xốp đặc trưng Công nghệ tế bào 16 Bảng 2.1 Các phương pháp bất động tế bào Phương pháp Vật liệu Gắn lên bề mặt Mảnh gỗ mỏng, collagen1, microcarrier2, nhựa trao đổi ion, oxide kim loại Tạo thể xốp Cordierite, pore glass, acrylamide, alginate, collagen, κ-carrageenan Bao vi thể Polylysine, ethylcellulose, emulsion3, màng tổng hợp Tự kết khối Các tiểu thể hệ sợi, polyelectrolytes4, nhân tố liên kết ngang Một phương thức khác bọc tế bào thể xốp tạo thành điều kiện in situ Các vật liệu thuộc gelatin khác acrylamide, alginate, collagen, κ-carrageenan, trộn với dịch huyền phù tế bào tạo gel dạng kích thước khác Một phương thức đơn giản khác tạo hạt hình cầu dạng gel alginate-calcium sau: Các tế bào dịch huyền phù sau cô lại trộn với alginate để tạo nồng độ alginate cuối từ 1-3% (w/v) hỗn hợp alginate-tế bào bơm kim tiêm thuốc vào dung dịch calcium chloride Các hạt tạo thành tức thời có đường kính từ 1-5 mm tùy thuộc vào nồng độ tế bào alginate dung dịch kích thước mũi kim tiêm Cần lưu ý thêm phải trì vơ trùng suốt q trình bất động tế bào Nhược điểm việc sử dụng alginate để bất động tế bào để lọt tế bào từ phân chia tế bào xuất bên hạt riêng rẽ Việc lọt tế bào giảm thiểu cách tăng nồng độ alginate calcium chlorite hạt cách tạo hạt Collagen: chất tạo keo Microcarrier: tiểu thể có kích thước hiển vi (thường hạt polymer đường kính khoảng 200 µm) để tế bào nuôi cấy dịch huyền phù gắn vào sinh trưởng Emulsion: dạng nhũ tương Polyelectrolytes: chất đa điện phân Công nghệ tế bào 17 nhỏ Tuy nhiên, việc tăng nồng độ alginate calcium chloride hạt làm giảm tốc độ khuếch tán chất thông qua gel ảnh hưởng đến khả sống sót tế bào bao bọc Sử dụng bao vi thể Các tế bào bất động bao vi thể (microcapsule) có màng màng bán thấm không cố định cố định Ưu điểm kỹ thuật đóng vỏ bao tạo diện tích bề mặt lớn cho tiếp xúc chất tế bào Màng bán thấm cho qua cách chọn lọc thành phần có trọng lượng phân tử thấp Các màng dạng sợi rỗng tạo thành cấu trúc hình ống thường hàng bó sợi song song bên buồng hình trụ Các tế bào giữ lại thành sợi rỗng môi trường dinh dưỡng thơng khí ln chuyển quanh sợi Loại màng cung cấp thêm bảo vệ chống nhiễm bẩn môi trường Tuy nhiên, nhược điểm hệ thống màng giá thành cao, tắc nghẽn màng làm trở ngại cho việc chuyển khối gây khó khăn việc thơng khí Tự kết khối Các tế bào tự kết khối kết thành cụm len xem tế bào bất động kích thước lớn chúng có ưu điểm tương tự bất động phương pháp khác Trong nấm mốc tạo tiểu thể tự nhiên, tế bào vi khuẩn nấm men lại cần đến kết cụm Các nhân tố kết thành cụm nhân tạo nhân tố liên kết ngang (cross-linkers) bổ sung để tăng cường q trình III Một số thí nghiệm điển hình Đường cong sinh trưởng nấm men Trong thí nghiệm này, chủng nấm men ni cấy bình tam giác thuỷ tinh, thay đổi nồng độ tế bào kiểm soát cách dùng ba kỹ thuật khác nhau: đếm kính hiển vi, xác định khối lượng khô, độ đục dịch huyền phù tế bào Công nghệ tế bào 18 1.1 Nguyên liệu - Một chủng nấm men sinh trưởng ni cấy dịch huyền phù Chúng ta thu chủng nấm men từ phịng thí nghiệm vi sinh vật mua chủng đặc biệt từ công ty - Glucose, dịch chiết nấm men, NH4Cl, MgSO4, CaCl2 chất chống tạo bọt để pha môi trường - Hai bình tam giác 125 mL - Pipette vơ trùng - Đèn Bunsen - Nồi khử trùng - Tủ ấm - Hemocytometer - Ly tâm - Cân hóa chất - Máy quang phổ 1.2 Phương thức tiến hành - Chuẩn bị mơi trường ni cấy theo bảng 2.2 Rót 50 mL/bình vào bình tam giác loại 125 mL Bảng 2.2 Môi trường sinh trưởng đặc trưng nấm men Glucose 100 g Dịch chiết nấm men 8,5 g NH4Cl 1,32 g MgSO4 0,11 g CaCl2 0,06 g Chất chống tạo bọt 0,2 mL Nước Công nghệ tế bào bổ sung vừa đủ L 19 - Nút bình tam giác số vật liệu sau: giấy nhôm, nút plastic chịu nhiệt, nắp inox, không thấm nước - Khử trùng bình tam giác đựng mơi trường 121oC 20 phút - Tiếp mẫu (inoculate) mL dịch ni cấy nấm men trước vào bình tam giác chứa mơi trường vơ trùng Tiến hành cẩn thận để khỏi bị nhiễm bẩn pipette, nắp đậy bình tam giác suốt trình tiếp mẫu Để giảm thiểu hội nhiễm bẩn, nên đốt nắp đậy cổ bình tam giác sau lấy nắp để cấy nấm men vào - Đặt bình tam giác vào tủ ấm 37oC - Lấy mL mẫu khoảng thời gian khác q trình ni cấy để xác định nồng độ tế bào cách đếm kính hiển vi, xác định trọng lượng khô đo độ đục (mật độ quang) máy quang phổ Thời gian lấy mẫu phải xếp thu cho đường cong sinh trưởng tốt thể ba phase sinh trưởng (xem chương 3) Trước lấy mẫu phải trộn tất thành phần bình tam giác cách lắc Đường cong sinh trưởng thực vật 2.1 Nguyên liệu - Một dòng tế bào dịch huyền phù thực vật sinh trưởng tốt Phương thức sau dựa sở nuôi cấy tế bào thuốc Nếu chọn dịng tế bào khác cần thay đổi mơi trường - Hỗn hợp muối khống Murashige-Skoog (1962) (Bảng 7.2), 2,4dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), KH2PO4, inositol, thiamine.HCl, sucrose để pha chế mơi trường - Hai bình tam giác 125 mL - Pipette loại miệng rộng vô trùng (10 mL) - Tủ nuôi tế bào thực vật kèm máy lắc - Cân hóa chất - Ly tâm - Eppendorf tube 2.2 Phương thức tiến hành - Chuẩn bị mơi trường muối khống Murashige-Skoog, 0,2 mg/L 2,4-D, 0,18 g/L KH2PO4, 0,1 g/L inositol, mg/L thiamine.HCl 30 g/L Công nghệ tế bào 20 sucrose5 Điều chỉnh pH tới 5,8 KOH 1N phân phối môi trường vào hai bình tam giác loại 125 mL, cho bình tam giác chứa 30 mL - Đậy nắp bình tam giác khử trùng 121oC 20 phút - Cấy vào bình tam giác chứa 30 mL môi trường với 1,5 mL dịch huyền phù tế bào ngày tuổi đặt tủ nuôi tế bào thực vật có máy lắc lắc 150 vịng/phút, nhiệt độ nuôi 27oC, chiếu sáng giờ/ngày cường độ 2.000 lux - Lấy 1,5 mL dịch nuôi cấy ngày trộn kỹ cho vào Eppendorf tube để cân, ly tâm tube 9.000 vòng/phút 4-5 phút loại thể Cân lại tube tính tốn phần trăm trọng lượng tế bào ẩm Đặt tube tủ sấy 70oC hai ngày cân lại để tính tốn trọng lượng khơ - Vẽ đồ thị thay đổi nồng độ tế bào khô tươi (ẩm) theo thời gian Bất động tế bào thực vật 3.1 Nguyên liệu - 30 mL tế bào dịch huyền phù thuốc sinh trưởng phương pháp mơ tả thí nghiệm trước - Alginate - CaCl2 - Bơm nhu động - Nồi áp suất - Cân hóa chất 3.2 Phương thức tiến hành - Trộn 0,875 g alginate, mL môi trường nuôi cấy thực vật 25 mL nước khử trùng - Đợi cho 30 mL dịch nuôi cấy huyền phù tế bào thực vật lắng xuống, loại bỏ thể Bước thường khoảng 10 phút - Bổ sung hỗn hợp alginate trộn với tế bào lại Mơi trường có tính chất tham khảo Thơng thường lồi thực vật khác với mục đích ni cấy khác nhau, có nhu cầu dinh dưỡng khác Khi đó, phải thiết kế môi trường nuôi cấy có tính đặc hiệu cao Cơng nghệ tế bào 21 - Bơm hỗn hợp alginate-tế bào qua ống silicon vô trùng (1,6 mm ID) cung cấp giọt vào bình tam giác chứa 200 mL dung dịch vô trùng CaCl2 0,12 M Các giọt nhỏ phản ứng với CaCl2 để tạo hạt hình cầu có đường kính khoảng 3,75-4,5 mm - Giữ hạt dung dịch CaCl2 khoảng để đảm bảo phản ứng kết tủa xảy hồn tồn - Cấy vào bình tam giác chứa 30 mL môi trường thực vật với khoảng 30 hạt tế bào thực vật bất động đặt tủ ni tế bào thực vật có máy lắc lắc 150 vịng/phút, nhiệt độ ni 27oC, chiếu sáng 8giờ/ngày cường độ 2.000 lux - Chúng ta xác định nồng độ tế bào khơ ẩm tế bào tự dịch huyền phù tế bào bất động suốt q trình ni cấy mẻ Để xác định nồng độ tế bào tế bào bất động, cần phải hòa tan hạt potassium phosphate M 24 Tài liệu tham khảo/đọc thêm Atkinson B and Mavituna F 1991 Biochemical Engineering and Biotechnology Handbook 2nd ed Stockton Press, New York, USA Flickinger MC and Drew SW 1999 Encyclopedia of Bioprocess Technology: Fermentation, Biocatalysis and Bioseparation John Wiley & Sons, New York, USA Lee JM 2001 Biochemical Engineering Prentice Hall, Inc USA Ratledge C and Kristiansen B 2002 Basic Biotechnology Cambridge University Press, UK Shuler ML and Kargi F 2002 Bioprocess Engineering-Basic Concepts ed Prentice Hall, Inc New Jersey, USA nd Vogel HC and Todaro CL 1997 Fermentation and Biochemical Engineering Handbook (Principles, Process Design, and Equipment) 2nd ed Noyes Publications New Jersey, USA Công nghệ tế bào 22 Chương Động học sinh trưởng tế bào I Mở đầu Hiểu biết đầy đủ động học sinh trưởng tế bào thực vật, động vật vi sinh vật cần thiết để thiết kế hoạt động hệ lên men Động học tế bào có quan hệ với tốc độ sinh trưởng tế bào chịu ảnh hưởng điều kiện vật lý hóa học Động học tế bào kết hệ thống phản ứng hóa sinh trình vận chuyển phức tạp, bao gồm nhiều pha hệ thống nhiều thành phần Trong suốt thời gian sinh trưởng, hỗn hợp không đồng tế bào già non thay đổi liên tục tự thích nghi với mơi trường dinh dưỡng yếu tố thay đổi liên tục điều kiện vật lý hóa học Nói chung, mơ hình tốn học xác động học sinh trưởng khơng có Thậm chí mơ hình thực tế khó tiếp cận chứa nhiều thơng số khơng thể xác định Vì thế, cần giả định đạt mơ hình đơn giản hữu ích cho việc thiết kế hệ thống lên men (xem chương 4) dự báo hiệu suất Các mơ hình khác phát triển sở giả định thành phần quần thể tế bào trình bày bảng 3.1 Ngồi giả định tế bào, môi trường thiết kế cho thành phần giới hạn tốc độ phản ứng, tất thành phần khác diện nồng độ đủ cao mà thay đổi nhỏ chúng không ảnh hưởng rõ rệt đến tốc độ phản ứng Các hệ thống lên men kiểm sốt cho thơng số môi trường pH, nhiệt độ nồng độ oxygen hịa tan trì mức độ khơng đổi Trong chương này, phương trình động học tế bào bắt nguồn từ mơ hình phân phối, khơng cấu trúc Các phương trình ứng dụng để thiết kế phân tích hệ lên men lý tưởng Công nghệ tế bào 23 Bảng 3.1 Các mơ hình khác động học tế bào Các thành phần tế bào Quần thể (distributed) Bị cô lập (segregated) Được cấu trúc (unstructured) Được phân phối Không cấu trúc (structured) Các tế bào đại diện thành phần đơn, phân phối không đồng trình ni cấy Các tế bào bao gồm nhiều thành phần phức tạp phân phối không đồng trình ni cấy Các tế bào đại diện thành phần đơn, tạo thành hỗn hợp không đồng Các tế bào bao gồm nhiều thành phần phức tạp tạo thành hỗn hợp không đồng II Định nghĩa Trước tiên, định nghĩa số thuật ngữ dùng cho sinh trưởng tế bào Nếu đề cập đến nồng độ tế bào mà không kèm theo ghi đặc điểm nào, hiểu theo nhiều nghĩa khác Đó số lượng tế bào, trọng lượng tươi tế bào, trọng lượng khô tế bào đơn vị thể tích Trong chương này, thống thuật ngữ sau: CX: nồng độ tế bào, trọng lượng khô tế bào đơn vị thể tích CN: mật độ số lượng tế bào, số lượng tế bào đơn vị thể tích ρ: mật độ tế bào, trọng lượng tươi tế bào đơn vị thể tích khối lượng tế bào Từ đó, định nghĩa tốc độ sinh trưởng tế bào theo số cách khác sau: dCX/dt: thay đổi nồng độ khô tế bào theo thời gian rX: tốc độ sinh trưởng tế bào sở trọng lượng khô dCN/dt: thay đổi mật độ số lượng tế bào theo thời gian rN: tốc độ sinh trưởng tế bào sở số lượng δ: tốc độ phân chia tế bào sở số lượng d log C N / dt Công nghệ tế bào 24 Dường dC X / dt rX luôn giống nhau, Giá trị dC X / dt thay đổi nồng độ tế bào hệ lên men, yếu tố bao gồm hiệu tốc độ dòng chảy vào ra, tái sinh tế bào, điều kiện hoạt động khác hệ lên men Trong rX tốc độ sinh trưởng thực tế tế bào Hai giá trị giống trường hợp hoạt động lên men mẻ Tốc độ sinh trưởng dựa số lượng tế bào tốc độ sinh trưởng dựa trọng lượng tế bào không thiết phải giống nhau, kích thước trung bình tế bào khác chuyển từ pha sinh trưởng đến pha sinh trưởng khác Khi sinh khối tế bào riêng biệt tăng lên mà phân chia, tốc độ sinh trưởng dựa trọng lượng tế bào tăng lên, tốc độ sinh trưởng dựa số lượng tế bào lại giữ nguyên Tuy nhiên, suốt thời gian sinh trưởng theo hàm mũ, pha sinh trưởng mà quan tâm quan điểm cơng nghệ, tốc độ sinh trưởng dựa số lượng tế bào tốc độ sinh trưởng dựa trọng lượng tế bào giả định tương đương Trong số trường hợp tốc độ sinh trưởng bị nhầm lẫn với tốc độ phân chia, khái niệm định nghĩa tốc độ phân chia tế bào đơn vị thời gian Nếu tất tế bào bình ni cấy thời điểm t = (CN = CNo) phân chia sau thời gian định, quần thể tế bào tăng lên C N ×2 lần Nếu tế bào phân chia n lần sau thời gian t, số lượng tổng số tế bào là: C N = C N × 2n (3.1) Và tốc độ phân chia trung bình là: δ = n t (3.2) Vì n = log C N − log C N theo phương trình 3.1, nên tốc độ phân chia trung bình là: δ = ( log C N − log C N t ) (3.3) Và tốc độ phân chia thời gian t là: Công nghệ tế bào 25 δ= d log C N dt (3.4) Vì thế, tốc độ sinh trưởng (được định nghĩa thay đổi số lượng tế bào theo thời gian) độ dốc đường cong CN theo t Trong đó, tốc độ phân chia độ dốc đường cong log2CN theo t Như giải thích, tốc độ phân chia số suốt thời gian sinh trưởng theo hàm mũ, tốc độ sinh trưởng lại khơng Vì thế, hai khái niệm không nhầm lẫn với III Chu kỳ sinh trưởng nuôi cấy mẻ Nếu nuôi cấy vi sinh vật đơn bào môi trường vô trùng đo mật độ số lượng tế bào theo thời gian đồ thị ta thấy có sáu pha sinh trưởng chết tế bào (Hình 3.1), là: - Pha lag Là thời gian thay đổi số lượng tế bào không - Pha sinh trưởng nhanh Số lượng tế bào bắt đầu tăng tốc độ phân chia đạt đến cực đại - Pha sinh trưởng theo hàm mũ Số lượng tế bào tăng theo hàm mũ tế bào bắt đầu phân chia, tốc độ sinh trưởng tăng lên suốt pha này, tốc độ phân chia tỷ lệ với d ln C N / dt , số giá trị cực đại nó, minh họa hình 3.1 - Pha sinh trưởng chậm Khi tốc độ sinh trưởng đạt đến cực đại, giai đoạn pha sinh trưởng chậm hai tốc độ sinh trưởng tốc độ phân chia giảm - Pha tĩnh Quần thể tế bào đạt đến giá trị cực đại không tăng thêm - Pha chết Sau chất dinh dưỡng tế bào cạn kiệt, tế bào bắt đầu chết số lượng tế bào sống sót giảm Pha lag Pha lag (hoặc pha tĩnh khởi đầu tiềm tàng) thời kỳ khởi đầu q trình ni cấy, suốt thời kỳ thay đổi số lượng tế bào không không đáng kể Mặc dù số lượng tế bào không tăng lên, Công nghệ tế bào 26 tế bào sinh trưởng cách tăng kích thước suốt thời kỳ A B C D E F 12 ln C N 10 t 1,5 1,0 C N × 10−5 0,5 t 0,3 0,2 0,1 d ln C N dt t -0,1 -0,2 Hình 3.1 Đường cong sinh trưởng đặc trưng thể đơn bào (A) pha lag, (B) pha sinh trưởng nhanh, (C) pha sinh trưởng theo hàm mũ, (D) pha sinh trưởng chậm, (E) pha tĩnh, (F) pha chết Độ dài pha lag tùy thuộc vào nhiều nhân tố, chẳng hạn loại tuổi thể vi sinh vật (hoặc tế bào động-thực vật), điều kiện nuôi cấy Pha lag thường xuất tế bào phải điều chỉnh với môi trường trước sinh trưởng bắt đầu Nếu vi sinh vật cấy từ mơi trường có nồng độ chất dinh dưỡng thấp vào mơi trường có nồng độ chất Công nghệ tế bào 27 dinh dưỡng cao, pha lag thường kéo dài Nếu chuyển từ nơi có nồng độ cao đến nơi có nồng độ thấp thường khơng xuất pha lag Một nhân tố quan trọng khác ảnh hưởng đến độ dài pha lag lượng mẫu đưa vào nuôi cấy (inoculum size) Nếu lượng nhỏ tế bào đưa vào thể tích lớn chúng có pha lag dài Ở trường hợp nuôi cấy tế bào quy mơ lớn, thời gian pha lag ngắn tốt Vì thế, để đưa mẫu vào (cịn gọi tiếp mẫu) quy trình lên men cơng nghiệp, cần phải có dãy nồi lên men có lượng mẫu lớn dần để giảm thiểu ảnh hưởng pha lag Vào giai đoạn kết thúc pha lag, sinh trưởng tế bào bắt đầu, tốc độ phân chia tế bào tăng lên từ từ đạt đến giá trị cực đại thời kỳ sinh trưởng theo hàm mũ, trình bày tăng lên góc uốn cong B hình 3.1 Thời kỳ chuyển tiếp gọi chung pha sinh trưởng nhanh thường xem phần pha lag Pha sinh trưởng theo hàm mũ (pha logarithm) Ở thể đơn bào, nhân đôi tăng dần số lượng tế bào cho kết tốc độ sinh trưởng tăng lên liên tục quần thể Nuôi cấy vi khuẩn trải qua sinh trưởng cân kiểu phản ứng hóa học bậc tự xúc tác Vì thế, tốc độ tăng trưởng quần thể tế bào thời điểm tỷ lệ với mật độ số lượng (C N ) tế bào diện thời điểm rN = dC N = µC N dt (3.5) Trong đó: số µ biết tốc độ sinh trưởng đặc trưng (giờ ) Không nên nhầm lẫn tốc độ sinh trưởng đặc trưng với tốc độ sinh trưởng (có đơn vị ý nghĩa khác hẳn) Tốc độ sinh trưởng thay đổi mật độ số lượng tế bào theo thời gian, tốc độ sinh trưởng đặc trưng là: -1 à= dC N d ln C N ì = CN dt dt (3.6) Đó thay đổi theo logarithm tự nhiên mật độ số lượng tế bào theo thời gian So sánh phương trình (3.4) (3.6) cho thấy: Cơng nghệ tế bào 28 µ= d ln C N ⎛ d log C N ⎞ = ln 2⎜ ⎟ = δ ln dt dt ⎝ ⎠ (3.7) Vì vậy, tốc độ sinh trưởng đặc trưng µ ln2 lần tốc độ phân chia δ Nếu µ số theo thời gian suốt thời kỳ sinh trưởng theo pha hàm mũ, phương trình (3.5) lấy tích phân từ t0 tới t đó: CN ∫ C N0 t dC N = ∫ µ dt CN t0 (3.8) Hay: C N = C N exp[µ(t − t )] (3.9) Trong đó: C N mật độ số lượng tế bào t0 sinh trưởng hàm mũ bắt đầu Phương trình (3.9) cho thấy tăng lên số lượng tế bào theo hàm mũ thời gian Thời gian cần thiết để gấp đôi quần thể, gọi thời gian nhân đôi (td), ước lượng từ phương trình (3.9), cách đặt C N = 2C N t0 = , giải theo t ta có: td = ln = µ δ (3.10) Thời gian nhân đơi tỷ lệ nghịch với tốc độ sinh trưởng đặc trưng số nghịch đảo tốc độ phân chia Các nhân tố ảnh hưởng đến tốc độ sinh trưởng đặc trưng 3.1 Nồng độ chất Một phương trình sử dụng rộng rãi thể ảnh hưởng nồng độ chất (chất dinh dưỡng) lên µ phương trình Monod: µ= Cơng nghệ tế bào µ max C S K S + CS (3.11) 29 Trong đó: C S nồng độ chất giới hạn (limiting substrate) môi trường K S hệ số hệ thống Mối quan hệ trình bày đồ thị hình 3.2 Giá trị K S tương đương với nồng độ chất dinh dưỡng tốc độ sinh trưởng đặc trưng giá trị cực đại (µmax) Theo phương trình Monod, tăng lên sau nồng độ chất dinh dưỡng µ đạt đến µ max không ảnh hưởng đến tốc độ sinh trưởng đặc trưng, trình bày hình 3.2 Tuy nhiên, tốc độ sinh trưởng đặc trưng giảm xuống nồng độ chất dinh dưỡng tăng lên vượt mức độ định 3.2 Nồng độ sản phẩm Khi tế bào sinh trưởng, chúng sản xuất sản phẩm trao đổi chất tích lũy mơi trường Sinh trưởng vi sinh vật thường bị ức chế sản phẩm này, ảnh hưởng sản phẩm bổ sung vào phương trình Monod sau: µ = µ max ⎜ ⎜ ⎛ ⎞ ⎛ KP ⎟×⎜ ⎟ ⎜K +C P ⎠ ⎝ P ⎛ CS µ = µ max ⎜ ⎜K +C S ⎝ S ⎞ ⎛ C ⎟ × ⎜1 − P ⎟ ⎜ C Pm ⎠ ⎝ CS ⎝ K S + CS ⎞ ⎟ ⎟ ⎠ (3.12) hoặc: ⎞ ⎟ ⎟ ⎠ n (3.13) Trong đó: KP hệ số nồng độ sản phẩm CP nồng độ sản phẩm Cả hai phương trình mơ tả ức chế sản phẩm tốt CPm ký hiệu nồng độ cực đại sản phẩm, yếu tố làm cho tế bào sinh trưởng ức chế sản phẩm 3.3 Các điều kiện khác Tốc độ sinh trưởng đặc trưng tế bào bị ảnh hưởng pH môi trường, nhiệt độ cung cấp oxygen Nhiệt độ pH tối ưu loại tế bào khác (động-thực vật vi sinh vật) khác Công nghệ tế bào 30 1,2 µ max Hình 3.2 Sự phụ thuộc tốc độ sinh trưởng đặc trưng vào nồng độ chất dinh dưỡng giới hạn sinh trưởng µmax = 0,935/gi; KS = 0,22ì10-4 mol/L 0,8 0,4 KS CS × 104 , M Pha tĩnh pha chết Sinh trưởng quần thể tế bào thường bị hạn chế sử dụng hết tồn chất dinh dưỡng có sẵn tích lũy sản phẩm độc trao đổi chất Kết tốc độ sinh trưởng giảm sinh trưởng cuối dừng lại Ở thời điểm nuôi cấy gọi pha tĩnh Giai đoạn chuyển tiếp pha hàm mũ pha tĩnh bao gồm thời kỳ sinh trưởng không cân suốt thời kỳ thành phần khác tế bào tổng hợp tốc độ không Kết tế bào pha tĩnh có thành phần hóa học khác với tế bào pha hàm mũ Pha tĩnh thường pha chết mà thể quần thể bị chết Sự chết xuất suy yếu việc bảo quản lượng tế bào, tích lũy sản phẩm độc tố Giống sinh trưởng, chết hàm mũ Trong số trường hợp, thể khơng chết mà cịn phân hủy, q trình cịn gọi phân giải IV Các ký hiệu C N0 nồng độ, khối lượng đơn vị thể tích ni cấy, kg/m3 mật độ số lượng tế bào, số lượng tế bào/m3 mật độ số lượng tế bào thời điểm t0, số lượng tế bào/m3 CP CPm nồng độ sản phẩm nồng độ cực đại sản phẩm C CN Công nghệ tế bào 31 CS CX dCX/dt dCN/dt KP KS n r rX rN t td δ δ µ µ max ρ nồng độ chất nồng độ tế bào, trọng lượng khơ tế bào thể tích kg/m3 thay đổi nồng độ khô tế bào theo thời gian thay đổi mật độ số lượng tế bào theo thời gian hệ số nồng độ sản phẩm hệ số hệ thống cho động học Monod, kg/m3 số lượng tế bào tốc độ tốc độ sinh trưởng tế bào sở trọng lượng khô tốc độ sinh trưởng tế bào sở số lượng thời gian, s thời gian nhân đôi, s tốc độ phân chia tế bào, s-1 tốc độ phân chia tế bào trung bình, s-1 tốc độ sinh trưởng đặc trưng, s-1 kg/m3/s tốc độ sinh trưởng cực đại, s-1 kg/m3/s mật độ tế bào, kg/m3 Tài liệu tham khảo/đọc thêm Asenjo JA and Merchuk JC 1995 Bioreactor System Design Marcel Dekker, Inc New York, USA Atkinson B and Mavituna F 1991 Biochemical Engineering and Biotechnology Handbook 2nd ed Stockton Press, New York, USA Chia TF 2003 Engineering Applications in Biology Updated 1st ed McGraw-Hill Education, Singapore Flickinger MC and Drew SW 1999 Encyclopedia of Bioprocess Technology: Fermentation, Biocatalysis and Bioseparation John Wiley & Sons, New York, USA Lee JM 2001 Biochemical Engineering Prentice Hall, Inc USA Ratledge C and Kristiansen B 2002 Basic Biotechnology Cambridge University Press, UK Shuler ML and Kargi F 2002 Bioprocess Engineering-Basic Concepts 2nd ed Prentice Hall, Inc New Jersey, USA Vogel HC and Todaro CL 1997 Fermentation and Biochemical Engineering Handbook (Principles, Process Design, and Equipment) 2nd ed Noyes Publications New Jersey, USA Công nghệ tế bào 32 Chương Thiết kế hệ lên men I Hệ lên men thùng khuấy Nồi phản ứng sinh học (bioreactor) hay gọi hệ lên men (fermenter) loại thiết bị mà biến đổi hóa sinh tiến hành tế bào sống thành phần tế bào in vivo (enzyme) Trong chương này, nồi phản ứng sinh học để nuôi cấy tế bào sống gọi hệ lên men để phân biệt nồi phản ứng sinh học dùng cho enzyme Trong phịng thí nghiệm, tế bào thường ni cấy bình tam giác máy lắc Lắc nhẹ bình tam giác hiệu để tạo dịch huyền phù tế bào, tăng cường oxy hóa thơng qua bề mặt chất lỏng trợ giúp chuyển khối (mass transfer) chất dinh dưỡng mà không gây nguy hiểm cho cấu trúc tế bào bọt vách ngăn đun nóng làm lạnh turbin dẹt khơng khí vơ trùng Hình Sơ đồ hệ lên men dùng cho sản xuất penicillin Đối với hoạt động sản xuất quy mơ lớn, hệ thống lên men thùng khuấy (stirred-tank fermenter, STF) sử dụng rộng rãi để thiết kế cho trình lên men cơng nghiệp Nó dùng cho hai trường hợp lên men hiếu khí (aerobic) yếm khí (anaerobic) phạm vi rộng loại tế bào khác bao gồm vi sinh vật, động vật thực vật Công nghệ tế bào 33 Hình 4.1 giới thiệu sơ đồ hệ lên men dùng sản xuất penicillin Cường độ pha trộn (mixing intensity) khác cách chọn loại cánh khuấy (impeller) thích hợp tốc độ khuấy khác Việc sục khí khuấy học hệ lên men tốt cho nuôi cấy dịch huyền phù tế bào, oxy hóa, pha trộn mơi trường truyền nhiệt STF dùng cho mơi trường có độ nhớt cao Nó hệ lên men quy mô lớn phát triển công nghiệp dược Đặc điểm tiềm STF nghiên cứu rộng rãi Do hệ lên men thùng khuấy thường làm thép khơng rỉ hoạt động điều kiện ơn hịa nên tuổi thọ thiết bị lâu Nhược điểm hệ lên men thùng khuấy bắt nguồn từ ưu điểm Bộ phận (cánh) khuấy hiệu việc pha trộn thành phần hệ lên men, lại tiêu thụ lượng lớn công suất gây nguy hiểm cho hệ thống tế bào nuôi cấy mẫn cảm với lực trượt (shear force) tế bào động vật có vú tế bào thực vật Lực trượt chất lỏng hỗn hợp tạo gradient tốc độ thành phần tốc độ (hướng tâm tiếp tuyến) chất lỏng rời khỏi vùng cánh khuấy Khi chất lỏng rời khỏi vùng trung tâm, tốc độ vị trí cánh khuấy (có khoảng cách chiều rộng cánh khuấy) giảm khoảng 85% tạo vùng trượt cao Khi tỷ lệ chiều rộng cánh khuấy đường kính tăng profile tốc độ có dạng đặc trưng parabol mà trở nên tù tạo lực trượt gradient tốc độ lớn dần lên Vì thế, cách tăng chiều rộng cánh khuấy, ứng dụng thành cơng STF ni cấy tế bào động vật tế bào thực vật Nhiều hệ lên men quy mơ phịng thí nghiệm làm thủy tinh có nắp thép khơng rỉ Các thùng lên men lớn làm thép khơng rỉ Tỷ lệ chiều cao đường kính thùng lên men (vessel) 2/1 3/1 thường khuấy hai ba turbine khuấy (cánh khuấy) Trục cánh khuấy gắn nắp từ đáy thùng giá đỡ Tỷ lệ đường kính cánh khuấy (DI) đường kính thùng (DT) thường từ 0,3-0,4 Trong trường hợp hệ lên men có hai cánh khuấy, khoảng cách cánh khuấy thứ với đáy vessel khoảng cách hai cánh khuấy 1,5 đường kính cánh khuấy Khoảng cách giảm xuống cịn 1,0 so với đường kính cánh khuấy trường hợp hệ lên men có ba cánh khuấy Bốn vách ngăn (baffles) cách thường Công nghệ tế bào 34 thiết kế để ngăn cản hình thành dịng xốy làm giảm hiệu suất pha trộn Chiều rộng vách ngăn thường 1/10 đường kính thùng (tank) Ở trường hợp hệ lên men hiếu khí (aerobic fermenter), phun lỗ đơn (single orifice sparger) phun vòng sử dụng để sục khí cho hệ lên men Bộ phận phun đặt vị trí cánh khuấy cuối đáy vessel Độ pH hệ lên men trì cách dùng dung dịch đệm điều chỉnh pH (pH controller) Nhiệt độ điều chỉnh hệ thống gia nhiệt làm lạnh tự động Hệ lên men dòng nút (plug-flow fermenter, PFF) mẻ (batch fermenter) Một hệ lên men khuấy lý tưởng phải có khả pha trộn tốt cho thành phần đồng kết cấu thời điểm Một hệ lên men lý tưởng khác hệ lên men dòng nút, dạng tương đồng hệ lên men mẻ Trong hệ lên men dòng ống (tubular-flow fermenter), chất dinh dưỡng (cơ chất) tế bào vào đầu ống hình trụ tế bào sinh trưởng chúng qua ống Do ống dài thiếu phận khuấy nên ngăn cản pha trộn hồn tồn chất lỏng, tính chất dòng chảy thay đổi hai chiều tiếp tuyến hướng tâm Tuy nhiên, biến thiên chiều hướng tâm nhỏ chiều tiếp tuyến Một hệ lên men dịng ống mà khơng có biến thiên hướng tâm gọi hệ lên men dịng nút (PFF) Thực tế, hệ lên men PFF khó xây dựng Cho dù hệ lên men PFF trạng thái ổn định (steady state) hoạt động kiểu liên tục, nồng độ tế bào hệ lên men mẻ lý tưởng sau thời gian t giống nồng độ tế bào hệ lên men PFF trạng thái ổn định vị trí chiều dọc nơi mà thời gian lưu (residence time) τ t (Hình 4.2) Vì thế, phân tích sau ứng dụng cho hai, hệ lên men mẻ lý tưởng PFF trạng thái ổn định Nếu môi trường lỏng tiếp mẫu ni cấy kết hạt (seed culture), tế bào bắt đầu sinh trưởng theo hàm mũ sau pha lag Trong hệ lên men mẻ, thay đổi nồng độ tế bào tốc độ sinh trưởng tế bào: dC X = r X = µC X dt Công nghệ tế bào (4.1) 35 ... mL) - Tủ nuôi tế bào thực vật kèm máy lắc - Cân hóa chất - Ly tâm - Eppendorf tube 2. 2 Phương thức tiến hành - Chuẩn bị mơi trường muối khống Murashige-Skoog, 0 ,2 mg/L 2, 4-D, 0,18 g/L KH2PO4,... nồng độ tế bào, trọng lượng khô tế bào đơn vị thể tích CN: mật độ số lượng tế bào, số lượng tế bào đơn vị thể tích ρ: mật độ tế bào, trọng lượng tươi tế bào đơn vị thể tích khối lượng tế bào Từ... Design, and Equipment) 2nd ed Noyes Publications New Jersey, USA Công nghệ tế bào 22 Chương Động học sinh trưởng tế bào I Mở đầu Hiểu biết đầy đủ động học sinh trưởng tế bào thực vật, động vật