promoter cảm ứng thường im lặng chúng cảm ứng nhờ nhân tố môi trường nhân tố phát triển Chẳng hạn, promoter cho quang hợp, chế bảo vệ phát triển hoa cảm ứng điều kiện định Chọn promoter thực vật tùy thuộc vào chất sản phẩm mong muốn Đối với hầu hết trường hợp, promoter cấu trúc mạnh nguồn tốt để sản xuất sản phẩm ngoại lai Tuy nhiên, sản phẩm ngoại lai bất lợi sinh trưởng thực vật, cần thiết sử dụng promoter cảm ứng cho sản phẩm tổng hợp điều kiện mong muốn Các promoter cho quang hợp cảm ứng nhanh nhờ ánh sáng trắng tắt suốt thời gian tối Các gen tiểu đơn vị nhỏ ribulose1,5-biphosphate carboxylase gen protein light-harvesting biểu nhiều mơ xanh Vì thế, promoter từ gen có khả nguồn tốt cho biểu cảm ứng với ánh sáng Các promoter cho quang hợp phân lập từ nguồn thực vật khác dùng cho biểu gen vi khuẩn Gen ngoại lai Pngoại lai T ngoại lai Vị trí tạo dịng P thực vật T thực vật Km pGA482 Tc Hình 8.11 Sơ đồ biểu gen ngoại lai thực vật P: promoter, T: terminator, pGA482: vector tạo dòng thực vật, Km: gen kháng kanamycin, Tc: gen kháng tetracycline Km Tc 1.2 Terminator Người ta biết terminator thực vật chưa chứng minh liệu terminator động vật có chức thực vật hay không Công nghệ tế bào 141 Cho tới điều làm rõ, để an toàn nên sử dụng terminator thực vật để biểu cực đại gen ngoại lai Terminator nos (nopaline synthase) dùng thường xuyên số terminator khác thực vật phân lập 1.3 Các chuỗi tín hiệu Khơng nên có tín hiệu khởi đầu dịch mã (ATG) chuỗi promoter gen cấu trúc trình tự ATG làm giảm cách ý nghĩa hiệu suất dịch mã Khoảng cách vùng điều hòa (promoter terminator) gen cấu trúc phải không dài Nếu khơng mRNA sản xuất ổn định Một nhân tố quan trọng xét thực tế thao tác gen vị trí cuối protein Các protein ngoại lai sản xuất trì tế bào chất, chuyển vào quan tử, tiết tế bào Hầu hết protein thực vật phân bố tế bào chất, để chuyển vào quan tử tế bào chất ngồi màng tế bào tín hiệu đặc trưng (polypeptide) phải gắn vào đầu tận amino protein mong muốn Chuỗi peptide tín hiệu tách giai đoạn sớm vận chuyển protein chức hồn chỉnh giải phóng tới nơi đến cuối Điều chưa hiểu đầy đủ khơng biết liệu chuỗi peptide tín hiệu có đủ cho vận chuyển cách hay không Những nghiên cứu gần cho thấy vận chuyển protein ngoại lai vào chloroplast yêu cầu peptide tín hiệu Tuy nhiên, chế vận chuyển vào quan tử khác môi trường ngoại bào khác Nếu thông tin bổ sung thể protein chủ yếu cần thiết, khó khăn thiết kế cho protein ngoại lai vận chuyển mà khơng có thay đổi cấu trúc protein để khỏi làm hỏng chức protein Nhiều protein tổng hợp tế bào biến đổi di truyền Ví dụ: carbohydrate thường gắn với protein tìm thấy màng tế bào Một số protein phosphoryl hóa Những biến đổi gây hoạt động làm bất hoạt chức protein Vì vậy, gen ngoại lai phải thao tác thích hợp cho biến đổi hậu dịch mã xác Ví dụ, muốn gắn carbohydrate vào protein, thiết kế q trình để tiết protein màng tế bào Trong phương thức protein biến đổi cho phù hợp Tuy nhiên, chế biến đổi Cơng nghệ tế bào 142 khác thể sống Vì thế, chọn lọc cẩn thận dịng tế bào thích hợp cần thiết Biến nạp gen Có nhiều kỹ thuật khác dùng để biến nạp gen vào tế bào thực vật, chẳng hạn biến nạp gen gián tiếp qua Agrobacterium tumefaciens, biến nạp gen trực tiếp vi đạn (microprojectile) nhờ súng bắn gen (gene gun) hệ thống dội bom (bombardement), xung điện (electroporation), vi tiêm (microinjection), sóng siêu âm (ultrasonic), tinh thể silicon carbide, PEG (polyethylene glycol) Tuy nhiên, kỹ thuật sử dụng rộng rãi để biến nạp chuỗi DNA vào thực vật dựa sở Ti-plasmid A tumefaciens Trong thời gian ủ tế bào thực vật với vi khuẩn đất, chuỗi đặc biệt gọi DNA vận chuyển (T-DNA) Ti-plasmid chuyển từ vi khuẩn vào tế bào thực vật Nếu gen ngoại lai xâm nhiễm có TDNA, gen chuyển vào nhiễm sắc thể thực vật với T-DNA T-DNA tự nhiên mang gen sản xuất phytohormone dẫn đến tạo thành khối u tế bào bị xâm nhiễm Để tránh tượng tạo khối u tạo điều kiện cho việc chọn lọc nhanh thể biến nạp, marker (gen thị) kháng thực vật phát triển cách dung hợp gen kháng kháng sinh vi khuẩn với vùng điều hòa thực vật mô tả phần trước Theo phương thức marker kháng kanamycin marker kháng chloramphenicol xây dựng sử dụng để thay gen phytohormone vùng T-DNA Do Ti-plasmid tự nhiên khó thao tác trực tiếp in vitro phương pháp DNA tái tổ hợp kích thước lớn chúng (khoảng 200 kb), người ta phát triển hệ thống đơn giản Phương pháp hiệu sử dụng hệ thống binary vector Một binary vector trình bày hình 8.11 Hệ thống phụ thuộc vào vector nhỏ mang yếu tố yêu cầu tối thiểu dạng cis Các chức khác cần cho chế chuyển gen giao cho helper plasmid riêng biệt, Ti-plasmid Những phương thức cho phép đưa vào trì cách dễ dàng DNA ngoại lai chứa gen thao tác di truyền Các tế bào thực vật biến nạp với gen ngoại lai phương pháp đồng nuôi cấy Trong phương pháp này, vi khuẩn A tumefaciens chứa binary vector helper Ti-plasmid trộn lại với tế bào Công nghệ tế bào 143 nuôi cấy có hoạt tính sinh trưởng mảnh cắt thực vật (mảnh lá) Sau ủ hỗn hợp khoảng hai ngày Các tế bào biến nạp chọn lọc mơi trường agar có kháng sinh thích hợp Thể biến nạp phát mắt thường sau đồng nuôi cấy từ 2-3 tuần Một vài tế bào mảnh biến nạp tái sinh thành Các chuyển gen sau sử dụng để tạo callus dùng nuôi cấy dịch huyền phù tế bào hệ lên men quy mô lớn V Biến đổi di truyền tế bào động vật Biến đổi di truyền tế bào động vật ứng dụng để sản xuất protein đặc trưng cải thiện đặc điểm dòng tế bào sản xuất Cũng tương tự thực vật, có nhiều phương pháp đưa DNA ngoại lai vào tế bào động vật có vú để biến đổi di truyền, ví dụ: chuyển nhiễm (transfection) hay cịn gọi hóa biến nạp, lipofection (DNA đưa vào thông qua liposome), xung điện, vi tiêm DNA trực tiếp vào tế bào, bắn gen, dung hợp (fusion) tế bào động vật có vú với protoplast vi khuẩn mang DNA hệ thống viral vector (kể tiểu phần phage) Các dòng tế bào chuyển nhiễm biểu DNA ngoại lai ổn định hợp genome Ngược với thể vi sinh vật, hợp DNA ngoại lai hầu hết không tương ứng (non-homologous) Vì thế, gen mã hóa sản phẩm protein hợp vùng genome, mà vùng khơng thuận lợi cho việc biểu hiệu gen Kỹ thuật gen Một số gen thị chọn lọc (selectable marker) cho tế bào động vật có vú có sẵn Các marker trội (có thể dùng bất chấp dịng tế bào vật chủ) hầu hết liên quan với tính kháng thuốc Các marker lặn (được sử dụng kết hợp với đặc điểm di truyền tế bào vật chủ) bao gồm enzyme chuyển hóa purine pyrimidine, tính kháng thuốc chuyển hóa amino acid Hai hệ thống thành công hệ thống glutamine synthetase (GS) hệ thống dihydrofolate reductase (DHFR) Enzyme GS (được tổng hợp nhờ gen gs) xúc tác cho tạo thành glutamine từ glutamate ion ammonium Gen gs dùng marker chọn lọc tế bào hybridoma myeloma tế Công nghệ tế bào 144 bào gs khác Các tế bào chuyển nhiễm ổn định biểu gen gs sinh trưởng ổn định mơi trường khơng có glutamine Enzyme DHFR (được tổng hợp nhờ gen dhfr) dùng cho dòng tế bào CHO dhfr- Dịng tế bào dfhr- khơng ổn định để tổng hợp tetrahydrofolate cofactor cần thiết chuyển hóa carbon (one-carbon) Các dòng tế bào dfhr- sinh trưởng ổn định môi trường chứa thymidine hypoxanthine tiền chất (precursors) cần thiết để vượt qua khiếm khuyết Các tế bào chuyển nhiễm biểu gen dhfr có khả sinh trưởng ổn định mơi trường khơng bổ sung chất nói Biến đổi di truyền tế bào động vật có vú để cải thiện dịng tế bào chưa phát triển rộng rãi tăng lên đáng kể Các lĩnh vực quan tâm kéo dài sống tế bào sản xuất, sinh trưởng mơi trường khơng có huyết thanh, giảm tạo thành sản phẩm phụ đặc tính glycosylation Apoptosis, yếu tố xuất hầu hết ni cấy tế bào động vật có vú, bị ảnh hưởng nhờ việc đưa vào gen bcl2, gen kháng apoptosis Phương thức kéo dài sống tế bào liên quan pha sản xuất q trình ni cấy Biến nạp gen Chọn phương pháp biến nạp gen phụ thuộc vào mức độ biểu gen mong đợi, biểu thời gian ngắn biểu ổn định; loại tế bào đích tế bào dịch huyền phù tế bào dính bám, dịng tế bào thích nghi phân hóa Mỗi phương pháp địi hỏi tối ưu cao, bao gồm yếu tố như: số lượng tế bào, nồng độ DNA vector biểu 2.1 Phương pháp chuyển nhiễm Dùng calcium phosphate kết tủa DNA, có phạm vi hiệu từ 1-104 khuẩn lạc/106 tế bào/µg Sự hợp DNA ngoại lai DNA tế bào mang tính ngẫu nhiên DNA chuyển nhiễm thường tái tổ hợp trước hợp làm cho thể hội nhập mang nhiều DNA tế bào Hiệu chuyển nạp tăng vài dịng tế bào xử lý dimethyl sulfoxide (DMSO) glycerol thời gian ngắn (4-6 giờ) sau chuyển nhiễm Xử lý sốc sau chuyển nhiễm chloroquin diphosphate gây độc cao Mức độ độc thay đổi dòng tế bào, đặc biệt tế bào nuôi cấy dịch huyền phù tế bào phân hóa giai đoạn cuối Khi thay calcium Công nghệ tế bào 145 phosphate DEAE-dextran chuyển nhiễm DNA độc với xử lý sốc sau chuyển nhiễm tế bào nuôi cấy dịch huyền phù tế bào phân hóa 2.2 Phương pháp lipofection Phương pháp sử dụng lipid trung tính mang cation để tạo thành liposome Phức lipid hợp với màng huyết tương phóng thích DNA dính bám vào phần bào tan Phương pháp cho hiệu suất chuyển nap cao hóa biến nạp Tính đồng thành phần lipid màng tế bào vật chủ lipofectant làm tăng hiệu dung hợp tăng khả xâm nhập DNA gắn kèm Các liposome mang cation (lipofectin) thích hợp cho chuyển gen in vitro với hiệu suất 90% số loại tế bào nuôi cấy Lipofectin sử dụng để bọc virus Việc tạo liposome chứa protein virus lớp lipid cải thiện hiệu gắn vector với tế bào đặc biệt, tế bào ung thư gan Chỉ có số phương pháp thích hợp để chuyển DNA qua màng huyết tương thực ẩm bào (endocytosis) đẩy mạnh trình nội thể gây thoái biến xếp lại DNA Liposome dùng để phân phối in vivo ex vivo gen người tới tế bào đích thích hợp 2.3 Phương pháp chuyển gen xung điện Phương pháp yêu cầu nghiêm ngặt thông số thiết bị điện xung liên quan đến hiệu suất xâm nhập DNA Dòng điện sử dụng để tạo tế bào treo dung dịch DNA lỗ thủng màng huyết tương thơng qua DNA theo grandient mật độ chui vào phần bào tan Phương pháp sử dụng rộng rãi nuôi cấy dịch huyền phù lymphocyte (lympho bào) Chuyển nạp gen xung điện có khuynh hướng tạo thể hội nhập mang DNA đơn thường sử dụng để chuyển gen vào tế bào mầm phôi (embryonic stemES) Việc chuyển nạp gen thông qua điện trường tế bào tạo máu (hematopoietic cells) hệ tổ tiên chúng phương thức thích hợp cho virals vector địi hỏi hệ thống đóng gói phức tạp Các tế bào tủy xương tổ tiên (bone marrow progenitor cells) ni mơi trường có cytokine, interleukin 3, tăng tần số chuyển nhiễm biểu gen tế bào tạo bạch cầu hạt (granulopoietic) thể hồng cầu (erythroid) tổ tiên Các marker chọn lọc trội pSVNeo ghi mã cho gen prokaryote, neomycin phosphotransferase (neo) mang gen khởi động Công nghệ tế bào 146 (promoter) gen tăng cường (enhancer) Simian Virus 40 (SV 40), cho phép phân lập tế bào kháng neomycin cách dùng dạng đồng đẳng neomycin, G418, môi trường bổ sung Chuyển nạp gen pSVNeo xung điện vào tế bào mầm tủy xương cho kết tốt, ứng dụng để chuyển nạp cDNA yếu tố đông máu (factor IX) vào tế bào đệm (stromal cells) có nguồn gốc tủy xương 2.4 Phương pháp vi tiêm Là phương pháp chuyển DNA trực tiếp có hiệu cao Tuy nhiên, số lượng tế bào thí nghiệm bị giới hạn vài trăm Kỹ thuật tinh xão thiết bị đắt tiền vi tiêm hạn chế sử dụng rộng rãi phương pháp Tiến lớn phương pháp vi tiêm khả giảm sát biểu DNA ngoại lai tế bào riêng rẽ Hơn nữa, chuyển nhiễm chuyển gen xung điện vơ độc, vi tiêm phân phối DNA trực tiếp vào nhân tế bào mà không gây nguy hiểm đến nguyên vẹn tế bào Để giảm độc tính tới mức tối thiểu, thể tích DNA phải hạn chế nhỏ 10% thể tích nhân Đặc trưng vi tiêm cung cấp phương thức để tạo động vật chuyển gen, đánh giá biểu gen tạo dòng tế bào phôi, cung cấp phương pháp trực tiếp để tạo đột biến chèn đoạn (insertional mutants), xác định nhân tố điều hòa biểu gen đặc trưng mô đặc trưng tế bào, phân lập dòng provirus nguyên vẹn retrovirus để tiến hành phân tích bệnh lý học 2.5 Phương pháp dùng súng bắn gen Phương pháp sử dụng hạt kim loại tungsten vàng làm vi đạn Vi đạn bọc DNA bắn với vận tốc thích hợp để xâm nhập vào tế bào đích Hiệu phương pháp tương đương với phương pháp chuyển nhiễm Sự biểu thành công DNA ngoại lai tế bào chuột NIH 3T3, tế bào khỉ COS dòng đại thực bào (macrophage) thông báo Súng bắn gen phương pháp tiêm trực tiếp DNA trần plasmid bị hạn chế tim tế bào xương động vật Chỉ có 1-3% tế bào nhận DNA sản xuất lượng nhỏ protein ghi mã Các phương tiện hành hầu hết thích hợp cho chiến lược vaccine với lượng nhỏ protein đủ để tạo phản ứng miễn dịch Công nghệ tế bào 147 2.6 Viral vector Các viral vector cấu trúc tái tổ hợp nhiều gen virus thay DNA tạo dòng Chuyển nạp gen đặc trưng mô tế bào thực cách chọn lọc điểm thụ cảm tế bào đặc hiệu virus Virus mang DNA tái tổ hợp xâm nhiễm vào tế bào đích đặc trưng phân phối tải trọng di truyền vào chúng Một đặc điểm hấp dẫn viral vector điều hòa biểu gen có mặt promoter enhancer virus Các viral vector có nguồn gốc từ hầu hết virus DNA, bao gồm SV 40, virus tạo u dạng nhú (papilloma virus) người bị, nhóm virus DNA parvoviridae (adeno-associated virus, AAV), adenoviruses (các virus mang DNA sợi kép), virus bệnh mụn giộp (herpes) virus bệnh đậu mùa (vaccinia) Kích thước đoạn chèn (insert DNA) thay đổi từ 2-3 kb papovavirus tới > 50 kb vaccinia Các viral vector cho phép biểu thời gian ngắn 100% điều kiện in vitro DNA provirus sản xuất nhờ phiên mã ngược RNA retrovirus (nhóm virus mang RNA sợi đơn) hợp đơn nhiễm sắc thể vật chủ, giảm tới mức tối thiểu phiên mã gen Các viral vector đặc biệt thiết kế để phân phối DNA ngoại lai vào tế bào phân hóa, tế bào mầm phôi, lymphocyte Mặc dù retrovirus sử dụng để chuyển gen, có vài khó khăn provirus thiếu khả hợp vào tế bào thụ động, DNA hợp tế bào trải qua thời kỳ phân bào Điều dẫn tới thất bại biểu mức độ cao gen chuyển nạp Để có khả tái tổ hợp, kích thước tối đa đoạn chèn DNA khoảng kb Tóm lại, chọn lựa phương pháp chuyển nạp gen thích hợp phụ thuộc vào mục đích thí nghiệm tế bào đích (tế bào dính bám hay tế bào dịch huyền phù), chúng tế bào sơ cấp hay thích nghi, phân hóa hay có nhiều tiềm Thử nghiệm biểu DNA chuyển nhiễm tạm thời (trong thời gian ngắn) bền vững (ổn định) với mức độ biểu suy diễn Các dịng tế bào dính bám dễ thao tác phương pháp chuyển gen khác với thử nghiệm thành công biểu gen sau Khi độc tính phương pháp chuyển nhiễm loại trừ khả biểu gen, phương pháp khác cho phép thiết kế thí nghiệm thành cơng Khi phương pháp chuyển nhiễm, xung điện, viral vector thất bại phương pháp vi tiêm thích hợp Chuyển nạp gen tế bào khơng dính bám khó thực sử dụng viral vector chuyển nhiễm DEAE, Cơng nghệ tế bào 148 liposome giải pháp hợp lý Có khả vi tiêm tế bào khơng dính bám cần dính kết hóa học tế bào với chất Nồng độ DNA dùng thí nghiệm chuyển gen thay đổi từ 1ng đến 10 µg cho 105-106 tế bào nhận Trong vi tiêm, vài trăm tế bào tiêm trực tiếp DNA nồng độ từ pg đến µg/µl tương đương với 1-102 cấu trúc tái tổ hợp Số lượng đưa vào tế bào nhận vật chủ tỷ lệ với kích thước vector, đoạn chèn (insert DNA) nồng độ DNA Các cấu trúc mạch thẳng hợp thông qua tái tổ hợp cao khoảng 10 lần cấu trúc mạch vịng Chuyển nhiễm thơng qua liposome trở thành kỹ thuật phổ biến nhờ độc tính thấp hiệu chuyển nạp cao Trong phương pháp xung điện địi hỏi số lượng lớn DNA (10-40µg) trung bình giết chết nửa tế bào nhận VI Các ký hiệu C CX + nồng độ, số lượng tế bào/m3 kg/m3 số lượng tế bào mang plasmid đơn vị thể tích CX + nồng độ ban đầu tế bào mang plasmid CX − số lượng tế bào không mang plasmid đơn vị thể tích CX − nồng độ ban đầu tế bào không mang plasmid D tốc độ pha loãng, s-1 f X+ số tế bào mang plasmid quần lạc tế bào tổng số, thơng số khơng có thứ ngun số tế bào mang plasmid quần lạc tế bào tổng số sau n hệ, thơng số khơng có thứ ngun số hệ, thơng số khơng có thứ ngun xác suất xuất số tế bào khơng có plasmid hệ thời gian, s tỷ lệ tốc độ sinh trưởng đặc trưng (µ-/µ+), thơng số khơng có thứ nguyên tốc độ sinh trưởng đặc trưng tế bào mang plasmid, s-1 tốc độ sinh trưởng đặc trưng tế bào khơng có plasmid, s-1 tế bào mang plasmid X− tế bào không mang plasmid 0 fn n p t α µ+ µ- Cơng nghệ tế bào 149 Tài liệu tham khảo/đọc thêm Atkinson B and Mavituna F 1991 Biochemical Engineering and Biotechnology Handbook 2nd ed Stockton Press, New York, USA Bains W 2003 Biotechnology from A to Z Oxford University Press, Inc New York, USA Chia TF 2003 Engineering Applications in Biology Updated 1st ed McGraw-Hill Education, Singapore Lee JM 2001 Biochemical Engineering Prentice Hall, Inc USA Old RW and Primrose 1989 Principles of Gene Manipulation Blackwell Scientific Publications, Osney Mead, Oxford, UK Ratledge C and Kristiansen B 2002 Basic Biotechnology Cambridge University Press, UK Shuler ML and Kargi F 2002 Bioprocess Engineering-Basic Concepts ed Prentice Hall, Inc New Jersey, USA nd Singleton P and Sainsbury D 2001 Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 3rd ed John Wiley & Sons, Ltd UK Walker JM and Rapley R 2002 Molecular Biology and Biotechnology ed The Royal Society of Chemistry, Cambridge, UK th Công nghệ tế bào 150 Chương Tiệt trùng Hầu hết trình lên men cơng nghiệp tiến hành ni cấy khiết có chủng chọn lọc phép sinh trưởng Nếu thể vi sinh vật ngoại lai diện môi trường phận thiết bị đó, chúng làm nhiễm bẩn mơi trường, sản xuất sản phẩm có hại hạn chế sinh trưởng thể sản xuất Vì thế, trước bắt đầu trình lên men, môi trường thiết bị lên men phải tiệt trùng để loại bỏ tất nguy gây nhiễm điều kiện vô trùng phải trì suốt trình lên men I Các phương pháp tiệt trùng Tiệt trùng môi trường lên men thiết bị thực cách phá hủy tất thể sống phương thức nhiệt (ẩm khô), tác nhân hóa học, chiếu xạ (tia cực tím tia X) phương pháp học (siêu âm sóng âm thanh) Một hướng khác loại thể sống phương pháp lọc ly tâm tốc độ cao Nhiệt Nhiệt phương thức sử dụng rộng rãi để tiệt trùng, sử dụng cho hai loại môi trường đặc lỏng Nó ứng dụng dạng nhiệt khô ẩm (hơi nước) Nhiệt ẩm thường hiệu nhiệt khô, khả kháng nhiệt bên tế bào vi khuẩn tăng lên mạnh trạng thái khơ hồn tồn Kết tỷ lệ chết tế bào khô thấp nhiều so với tế bào ẩm Sự dẫn nhiệt không khí khơ có tốc độ khơng khí ẩm Vì thế, nhiệt khơ dùng để tiệt trùng dụng cụ thủy tinh vật liệu rắn chịu nhiệt Bằng cách tăng áp suất lên bình ni cấy, nhiệt độ nước tăng lên cách ý nghĩa điểm sôi nước Nồi tiệt trùng áp suất (autoclave) phịng thí nghiệm thường hoạt động áp suất nước khoảng 15 psi tương ứng với 121oC, bào tử vi khuẩn bị giết nhanh 121oC Công nghệ tế bào 151 Hóa chất Các tác nhân hóa học dùng để giết vi sinh vật khả oxy hóa alkyl hóa Tuy nhiên, chúng khơng dùng để tiệt trùng mơi trường hóa chất ức chế sinh trưởng thể lên men Các tác nhân hóa học sử dụng thường xuyên cho việc xử lý để loại bỏ làm giảm mức độ nguy hại tác nhân gây bệnh Một số tác nhân hóa học kháng khuẩn là: phenol hợp chất phenol (phenol, cresol, orthophenylphenol), alcohol (ethyl, methyl), halogen (iodine, hypochlorite, chloramine), chất tẩy, thuốc nhuộm, hợp chất ammonium bậc bốn, acid, kiềm tác nhân gây vơ sinh dạng khí (ethylene oxide, β-propiolactone, formadehyde) Tia cực tím Nhiều nguyên liệu tế bào hấp thụ ánh sáng cực tím, dẫn đến gây nguy hiểm cho gen sau giết chết tế bào Bước sóng khoảng 256 nm có hiệu diệt khuẩn cao Tuy nhiên, tia cực tím có khả xuyên qua vật chất Vì thế, việc sử dụng chúng bị hạn chế việc làm giảm quần thể vi sinh vật phịng nơi mà điều kiện vơ trùng cần thiết trì thường xuyên, chẳng hạn phòng mổ bệnh viện buồng làm việc phịng thí nghiệm Tia X gây chết thể vi sinh vật có khả xuyên qua vật chất Tuy nhiên, chúng không thực tế cơng cụ tiệt trùng khác chi phí đắt lo lắng an toàn lao động Sóng siêu âm Sóng âm siêu âm có cường độ đủ mạnh phá vỡ giết chết tế bào Kỹ thuật thường sử dụng để phá vỡ tế bào nhằm tách chiết thành phần nội bào (protein, enzyme ) để tiệt trùng Lọc Là kỹ thuật sử dụng hiệu việc loại bỏ vi sinh vật khơng khí loại khí khác Trong trường hợp dung dịch lỏng, dùng cho sản phẩm loại môi trường không bền nhiệt, dễ dàng bị phá hủy huyết người động vật, loại enzyme Công nghệ tế bào 152 Trong số kỹ thuật giới thiệu trên, nhiệt ẩm có hiệu kinh tế cho yêu cầu tiệt trùng nói chung hệ lên men Vì thế, phần sau mô tả động học tượng chết tế bào hoạt động tiệt trùng nhiệt ẩm II Động học tượng chết nhiệt Hiện tượng chết nhiệt vi sinh vật, nhiệt độ đặc trưng, mơ tả phương trình động học bậc một: dn = −k d n dt (9.1) Trong đó: kd tốc độ chết đặc trưng, giá trị phụ thuộc khơng vào lồi mà cịn vào dạng sinh lý tế bào Ví dụ: giá trị kd bào tử vi khuẩn 121oC phút-1, giá trị tế bào sinh dưỡng khác từ 101 phút-1 đến 1010 phút-1 tùy thuộc vào thể đặc biệt Tích phân phương trình (9.1) cho kết quả: t ln n = − ∫ k d dt n0 (9.2) hoặc: ⎛ t ⎞ n = n0 exp⎜ − ∫ k d dt ⎟ ⎜ ⎟ ⎝ ⎠ (9.3) Phương trình (9.3) cho thấy suy giảm theo hàm mũ quần lạc tế bào Sự phụ thuộc vào nhiệt độ tốc độ chết đặc trưng kd thừa nhận theo phương trình Arrhenius: ⎛ E ⎞ k d = k d exp⎜ − d ⎟ ⎝ RT ⎠ (9.4) Trong đó: k d hệ số Arrhenius 5,7×1039 giờ-1, R số khí, T nhiệt độ tuyệt đối, Ed lượng hoạt động thu từ độ dốc đồ thị ln(kd) theo 1/T Ví dụ: lượng hoạt động E coli 127 kcal/gmol Bacillus stearothermophilus (chủng Fs 7954) 68,7 kcal/gmol Công nghệ tế bào 153 III Tiêu chuẩn thiết kế Từ phương trình (9.2) (9.4) tiêu chuẩn thiết kế cho tiệt trùng (∇) định nghĩa sau (Deindoerfer Humphrey 1959): ∇ = ln t t n ⎛ E ⎞ = ∫ k d dt = k d ∫ exp⎜ − d ⎟dt n0 ⎝ RT ⎠ (9.5) ∇ xem yếu tố Del, thước đo quy mơ cơng việc hồn thành Yếu tố Del tăng lên số tế bào cuối giảm Ví dụ: Khi giảm số tế bào hệ lên men từ 1010 thể sinh trưởng xuống cịn yếu tố Del bằng: ∇ = ln 1010 = 23 (9.6) Việc giảm số lượng tế bào từ 1010 xuống dường ấn tượng Tuy nhiên, chí thể cịn sống tồn hệ lên men bị nhiễm Vì thế, tất vi sinh vật sống phải đào thải Khi giảm số lượng tế bào tới yếu tố Del ∞, điều có nghĩa mặt lý thuyết khơng có khả phá vỡ tất cấu trúc tế bào sống Vì thế, số lượng tế bào cuối cần thiết biểu phân số 1, với xác suất nhiễm bẩn Ví dụ: n = 0,001 nghĩa hội cho nhân tố gây nhiễm bẩn sống sót bị tiệt trùng 1/1000 Nhân tố Del làm giảm số lượng tế bào hệ lên men từ 1010 thể sống xuống 0,001 là: ∇ = ln 1010 = 30 0,001 (9.7) Dựa sở tiêu chuẩn tiệt trùng tính tốn, thiết kế thiết bị tiệt trùng tối ưu IV Tiệt trùng mẻ Tiệt trùng mơi trường hệ lên men tiến hành mẻ cách phun nước (steam sparging) trực tiếp, phận đun nóng điện, áp lực tuần hồn khơng đổi làm ngưng tụ nước thông qua cuộn dây đốt Các chu kỳ tiệt trùng xếp theo thứ tự đun Công nghệ tế bào 154 nóng, giữ nóng làm lạnh Vì thế, yếu tố Del tồn phần (total) tổng số yếu tố Del đun nóng (heat), giữ nóng (hold) làm lạnh (cool): ∇ total = ∇ heat + ∇ hold + ∇ cool (9.8) Giá trị ∇ heat ∇ cool xác định phương pháp dùng cho q trình đun nóng làm lạnh Giá trị ∇ hold xác định chiều dài thời gian giữ nóng Phương thức thiết kế để đánh giá thời gian giữ nóng sau: - Tính tốn tiêu chuẩn tiệt trùng tồn phần - Xác định profile nhiệt độ theo thời gian suốt chu kỳ đun nóng, giữ nóng làm lạnh trình tiệt trùng Nếu phép đo thực nghiệm khơng tiến hành được, phương trình lý thuyết cho việc làm nóng lạnh sử dụng, phương trình đường thẳng, hàm mũ hyperbolic tùy thuộc vào kiểu làm nóng lạnh Các phương trình gợi ý cho q trình làm nóng lạnh khác sau (Deindoerfer Humphrey 1959): + Đun nóng mẻ cách phun nước trực tiếp vào môi trường, phương trình dạng hyperbolic: T = T0 + Hms t c( M + m s t ) (9.9) Trong đó: T nhiệt độ tuyệt đối (oK), T0 nhiệt độ tuyệt đối ban đầu môi trường (oK), H enthapy nước liên quan với nhiệt độ mơi trường chưa nấu chín (J/kg), ms tốc độ dòng chảy khối nước (kg/s), t thời gian (s), c nhiệt đặc trưng môi trường (J/kgoK), M khối lượng ban đầu môi trường nồi tiệt trùng mẻ (kg) + Đun nóng mẻ tốc độ khơng đổi dịng nhiệt, đun nóng nhiệt, phương trình dạng đường thẳng: T = T0 + qTt cM (9.10) Trong đó: q tốc độ truyền nhiệt (J/s) + Đun nóng mẻ nguồn đẳng nhiệt, tuần hoàn nước thơng qua cuộn dây đốt, phương trình dạng hàm mũ: ⎛ UAt ⎞ T = TH + (T0 − TH ) exp⎜ − ⎟ ⎝ cM ⎠ Công nghệ tế bào (9.11) 155 Trong đó: TH nhiệt độ tuyệt đối nguồn nhiệt (oK), U hệ số chuyển nhiệt tồn phần (J/s m2oK), A diện tích mặt cắt chuyển nhiệt xuất tiệt trùng (m2) + Làm lạnh mẻ cách dùng bể không đẳng nhiệt liên tục, cho nước lạnh chảy qua nhờ ống làm lạnh xoắn, phương trình dạng hàm mũ: ⎧ ⎡ ⎛ UA ⎞⎤ mc t ⎫ ⎪ ⎪ T = TC0 + (T0 − TC0 ) exp⎨− ⎢1 − exp⎜ − ⎜ m c ⎟⎥ M ⎬ ⎟ ⎪ ⎣ ⎪ c ⎠⎦ ⎝ ⎩ ⎭ (9.12) Trong đó: TC nhiệt độ tuyệt đối ban đầu bồn nhiệt (oK), mc tốc độ dòng chảy khối chất lỏng làm nguội (kg/s) - Vẽ giá trị kd hàm thời gian - Lấy tích phân diện tích đường cong kd theo thời gian cho trình làm lạnh làm nóng để đánh giá tương ứng ∇ heat ∇ cool Nếu sử dụng phương trình lý thuyết, lấy tích phân phương trình (9.5) sau thay profile nhiệt độ thích hợp Sau đó, thời gian giữ nóng tính tốn từ phương trình: t hold = ∇ total ∇ heat +∇ hold + ∇ cool = kd kd (9.13) V Tiệt trùng liên tục Tiệt trùng tiến hành kiểu liên tục hiệu kiểu mẻ Tiệt trùng liên tục có số ưu điểm sau: - Lập kế hoạch sản xuất đơn giản, cho phép sử dụng tối đa thiết bị giảm thiểu chậm trễ - Cung cấp điều kiện tái sản xuất - Có thể hoạt động nhiệt độ cao (140oC, chẳng hạn 121oC tiệt trùng mẻ), thời gian tiệt trùng rút ngắn (thời gian giữ từ 1-2 phút) - Cần nước cách thu hồi nhiệt từ môi trường tiệt trùng Kết cần nước làm lạnh - Dễ dàng tự động hóa q trình, nhờ cường độ lao động Công nghệ tế bào 156 Một thiết bị tiệt trùng liên tục bao gồm ba phận chính: đun nóng, giữ làm lạnh Bộ phận đun nóng Phương pháp đun nóng chia làm hai loại: phun nước trực tiếp làm nóng gián tiếp thiết bị trao đổi nhiệt ống lồng ống (shell-and-tube) có khung đĩa (plate-and-frame) Làm nóng trực tiếp hiệu gián tiếp khơng có vật cản (barrier) môi trường nguồn nhiệt Dụng cụ phun nước làm nóng nhanh mơi trường tới nhiệt độ tiệt trùng tối đa Vì thế, tiệt trùng suốt thời gian đun nóng đáng kể Đối với làm nóng gián tiếp, phận trao đổi nhiệt có khung đĩa thường hiệu loại truyền nhiệt ống lồng ống Tuy nhiên, phận đầu bị hạn chế áp lực thấp (thường 20 atm) cường lực cấu trúc yếu so với phận sau Loại có khung đĩa thuận lợi cho hệ thống có độ nhớt cao Sự thay đổi nhiệt độ liên quan với thời gian lưu trung bình ( τ heat) mơi trường qua nguồn đẳng nhiệt tính gần sau (Deindoerfer Humphrey 1959b): ⎛ UAτ heat ⎞ TC2 = TH - (TH -TC1 ) exp⎜ − ⎟ cW ⎠ ⎝ (9.14) Với W khối lượng môi trường hệ thống tiệt trùng Trường hợp đun nóng cách dùng nguồn nhiệt dịng nước ngược có tốc độ dịng chảy cơng suất nhiệt tương đương, ta có phương trình sau: TC2 = TC1 − ∆TUAτ heat cW (9.15) Bộ phận giữ nóng Mơi trường đun nóng qua phận giữ nhiệt bao gồm ống dài Bộ phận giữ trì điều kiện đoạn nhiệt Nếu nhiệt phận khơng đáng kể, nhiệt độ thừa nhận số Thời gian lưu trung bình phận giữ là: Cơng nghệ tế bào 157 τ hold = L u (9.16) Trong đó: L chiều dài phận giữ, u tốc độ trung bình Từ yếu tố Del tính sau: ∇ hold = ln no ⎛ E ⎞ = k d τ hold = k d exp⎜ − d ⎟τ hold n ⎝ RT ⎠ (9.17) Với n0 số lượng tế bào thời điểm bắt đầu phận giữ Nếu môi trường phận giữ chạy dòng nút lý tưởng (ideal plug flow), thời gian lưu mơi trường phần giống với tất môi trường khác Vì vậy, mức độ tiệt trùng khơng thay đổi Tuy nhiên, việc không giữ mục tiêu chất nhớt chất lỏng, ma sát thành ống, xoáy nước bất thường chất lỏng chảy gây phân chia dòng nút lý tưởng Kết profile tốc độ có giá trị cực đại đường ống giá trị tối thiểu vùng lân cận thành ống Sự phân chia dòng nút lý tưởng trộn lẫn quanh trục mơ tả mơ hình phân tán (Levenspiel 1972) Hình 9.1 trình bày yếu tố vi sai với độ dày dx ống giữ Sự cân nguyên liệu cho tế bào lơ lững môi trường là: Vào – Ra – Giết trùng = Tích lũy Dịng chảy khối Độ phân tán u Cn S + u Cn S − DS dC n dx − DS (9.18) d (u C n ) Sdx dx dCn d ⎛ dC ⎞ + ⎜ − DS n ⎟dx dx dx ⎝ dx ⎠ dx Hình 9.1 Các cân nguyên liệu quanh phận sơ cấp ống giữ Ở trạng thái ổn định, giới hạn tích lũy khơng Sự vào khỏi môi trường tế bào nhờ dịng chảy khối điều kiện Cơng nghệ tế bào 158 khuếch tán (độ phân tán) quanh trục Số lượng tế bào vào trừ cho tế bào rời dòng chảy khối là: d (u C n ) ⎤ ⎡ u C n S − ⎢u C n S + Sdx ⎥ dx ⎦ ⎣ (9.19) Trong đó: Cn mật độ số lượng tế bào, S diện tích mặt cắt ống Tương tự với khuếch tán phân tử, dòng chảy hướng trục x tế bào lơ lững môi trường phân tán quanh trục biểu diễn sau: J n = −D dC n dx (9.20) Trong đó: D hệ số phân tán quanh trục mô tả mức độ trộn ngược (backmixing) dịng chảy Nếu D 0, phân phối tốc độ hướng tới dòng chảy nút lý tưởng Nếu D ∞, dịng chảy ống phối trộn tốt giống bình trộn hồn tồn Đối với dịng chảy xáo trộn hỗn loạn, hệ số phân tán tương quan hàm số Reynolds (Hình 9.2) 10,0 D udt 1,0 0,1 1,0×103 1,0×104 N Re = Hình 9.2 Tương quan cho Cụng ngh t bo 1,0ì105 d t u 1,0ì106 àL D hàm số Reynolds ud t 159 Số lượng tế bào vào nhờ phân tán quanh trục là: dC ⎞ ⎤ dC dC n ⎡ d ⎛ − ⎢− DS n + ⎜ − DS n ⎟dx ⎥ dx ⎠ ⎦ dx dx ⎝ dx ⎣ − DS (9.21) Số lượng tế bào bị giết tiệt trùng kdCnSdx Vì thế, cách thay phương trình (9.19), (9.21) vào phương trình (9.18) đơn giản hóa, ta được: d ⎛ dC n ⎞ d (u C n ) − kd Cn = ⎟− ⎜D dx ⎝ dx ⎠ dx (9.22) Đối với số D ū, phương trình (9.22) biến đổi dạng khơng có thứ ngun: , d 2C n dC , k L , − N Pe ,n − N Pe d Cn = ,2 dx dx u (9.23) Trong đó: , Cn = Cn C n0 x, = x L N Pe = uL D NPe biết số Péclet Khi NPe = ∞ dịng nút lý tưởng Các điều kiện cho việc giải phương trình (9.23) là: , dCn , + N Pe (1 − Cn ) = x’ = , dx (9.24) , dCn =0 dx, x’ = Giải phương trình (9.23) ta được: ⎛N ⎞ 4ϕ exp⎜ Pe ⎟ , ⎝ ⎠ Cn x , =1 = ⎛ ϕN Pe ⎞ ⎛ ϕN ⎞ ⎟ (1 + ϕ ) exp⎜ Pe ⎟ − (1 − ϕ ) exp⎜ − ⎜ ⎟ ⎝ ⎠ ⎝ ⎠ Công nghệ tế bào (9.25) 160 Trong đó: ϕ = 1+ 4k d L / u N Pe (9.26) Bộ phận làm lạnh Đối với phận làm lạnh, dùng buồng làm mát có khả loại nhiệt hiệu Một kỹ thuật khác đưa mơi trường nóng qua van mở rộng vào buồng chân không xem trình làm lạnh nhanh (flash cooling) Cả hai kỹ thuật tốn thời gian, thời gian làm lạnh suốt trình tiệt trùng cho không đáng kể Bộ phận trao đổi nhiệt ống lồng ống có khung đĩa dùng để làm lạnh cách dùng bồn đẳng nhiệt là: ⎛ UAτ cool ⎞ TH = TC − (TC − TH ) exp⎜ ⎟ ⎝ cW ⎠ (9.27) Trong đó: TC nhiệt độ tuyệt đối bồn nhiệt Trường hợp làm lạnh cách dùng bồn nhiệt dịng nước ngược có tốc độ dịng chảy khả nhiệt nhau, ta có phương trình sau: TH = TH − ∆TUAτ cool cW (9.28) Tiệt trùng khơng khí Đối với lên men hiếu khí (aerobic fermentations), cần cung cấp khơng khí liên tục Tốc độ sục khí đặc trưng cho lên men hiếu khí khoảng 0,5-1,0 vvm (thể tích khí/thể tích chất lỏng/phút) Điều địi hỏi lượng lớn khơng khí Vì thế, khơng mơi trường mà khơng khí phải vơ trùng Tất kỹ thuật vơ trùng dùng cho mơi trường áp dụng cho khơng khí Tuy nhiên, tiệt trùng theo phương thức nhiệt không thực tế mặt kinh tế không hiệu hiệu suất truyền nhiệt thấp khơng khí so với chất lỏng Kỹ thuật tiệt trùng có hiệu cho khơng khí phương pháp lọc cách dùng lọc màng (membrane filter) lọc sợi (fibrous filter) Nút bông, thường dùng nắp đậy cho ống nghiệm bình tam giác đựng dung dịch vơ trùng, ví dụ tốt để loại vi sinh vật Cơng nghệ tế bào 161 ... đặc biệt tế bào nuôi cấy dịch huyền phù tế bào phân hóa giai đoạn cuối Khi thay calcium Công nghệ tế bào 145 phosphate DEAE-dextran chuyển nhiễm DNA độc với xử lý sốc sau chuyển nhiễm tế bào nuôi... nạp gen tế bào khơng dính bám khó thực sử dụng viral vector chuyển nhiễm DEAE, Cơng nghệ tế bào 1 48 liposome giải pháp hợp lý Có khả vi tiêm tế bào khơng dính bám cần dính kết hóa học tế bào với... đặc trưng (? ?-/ µ+), thơng số khơng có thứ ngun tốc độ sinh trưởng đặc trưng tế bào mang plasmid, s-1 tốc độ sinh trưởng đặc trưng tế bào khơng có plasmid, s-1 tế bào mang plasmid X− tế bào không