Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT o0o LUẬN VĂN THẠC SĨ NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA ĐỘT BIẾN TRÊN GEN CYP11B1 Ở NGƢỜI BỆNH TĂNG SẢN THƢỢNG THẬN BẨM SINH Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm Mã số: 60420114 Học viên: Nguyễn Thu Hiền Lớp: K15-Sinh học GVHD: TS. Nguyễn Huy Hoàng Hà Nội, tháng 10 năm 2013 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ MỤC LỤC Trang DANH MỤC VIẾT TẮT i DANH MỤC HÌNH ii DANH MỤC BẢNG iv MỞ ĐẦU 1 I. TỔNG QUAN 3 1.1. Hormone tuyến thƣợng thận 3 1.1.1. Tuyến thượng thận 3 1.1.2. Q 4 1.1.3. Điều hòa hoạt động steroid hydroxylase 7 1.2. Cytochrome P450 8 1.2.1. Vai trò và chức năng 8 1.2.2. Cấu trúc không gian cytochrome P450 10 1.3. Gen CYP11B1 11 1.3.1. Cấu trúc và chức năng 11 1.3.2. Cấu trúc không gian của CYP11B1 12 1.4. Bệnh tăng sản thƣợng thận bẩm sinh (TSTTBS) 14 1.4.1. Khái niệm 14 1.4.2. Tăng sản thượng thận bẩm sinh do thiếu hụt 11β-hydroxylase 14 1.4.2.1.Cơ chế gây bệnh 14 1.4.2.2. Biểu hiện lâm sàng 15 1.4.2.3. Cơ sở di truyền 16 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 1.4.3. Tăng sản thượng thận bẩm sinh do nguyên nhân khác 16 1.5. C 18 1.5.1. Chẩn đoán tăng sản thượng thận bẩm sinh 18 1.5.2. Điều trị bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh 19 1.6. Tình hình nghiên cứu 20 PHẦN II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1. Vật liệu nghiên cứu 26 2.1.1. Bệnh nhân 26 2.1.2. Hóa chất 26 2.1.3 Thiết bị 28 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 28 2.2.1. Tách chiết DNA tổng số 28 2.2.2. Điện di DNA trên gel agarose 28 2.2.3. Đo quang phổ DNA 29 2.2.4. Nhân gen bằng kĩ thuật PCR 29 30 2.2.6. Giải trình tự gen tự động trên máy 30 2.2.7. Tạo đột biến điểm trực tiếp (Site-directed mutagensis) 31 2.2.8. Biểu hiện trong tế bào COS-1 và phân tích hoạt tính enzyme 31 2.2.9. Phân tích trình tự gen trên phần mềm tin học 32 PHẦN III: KẾT QUẢ 33 3.1. Tách DNA tổng số 33 3.2. Xác định hàm lƣợng và độ tinh sạch của DNA bằng quang phổ kế 34 3.3. Khuếch đại đoạn gen CYP11B1 35 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 3.4. Phân tích ảnh hƣởng của đột biến trên gen CYP11B1 ở bệnh nhân 38 3.4.1. Bệnh nhân 01 38 3.4.1.1. Xét nghiệm lâm sàng, hóa sinh 38 3.4.1.2. Phân tích trình tự phát hiện đột biến 39 3.4.1.3. Biểu hiện của đột biến trong tế bào động vật 40 3.4.2. Bệnh nhân 02 42 3.4.2.1. Xét nghiệm lâm sàng, hóa sinh 42 3.4.2.2. Phân tích trình tự phát hiện đột biến 43 3.4.2.3. Biểu hiện của đột biến trong tế bào động vật 44 3.4.3. Bệnh nhân 03 46 3.4.3.1. Xét nghiệm lâm sàng, hóa sinh 46 3.4.3.2. Phân tích trình tự phát hiện đột biến 47 3.5. Phân tích cấu trúc 48 3.5.1. So sánh trình tự amino acid của CYP11B1 48 3.5.2. Mô hình cấu trúc 3D của các đột biến điểm trên CYP11B1 53 3.5.2.1. Mô hình cấu trúc không gian của CYP11B1 53 3.5.2.2. Đột biến R51K 54 3.5.2.3. Đột biến E147D 55 3.5.2.4. Đột biến N152K 56 IV. THẢO LUẬN 58 V. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 66 4.1. Kết luận 66 4.2. Kiến nghị 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO 67 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ MỞ ĐẦU Tăng sản thượng thận bẩm sinh (TSTTBS) (Congenital Adrenal Hyperplasia – CAH) là một nhóm các bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể thường đặc trưng bởi sự thiếu hụt một trong số các enzyme cần thiết cho quá trình tổng hợp hormone của vỏ thượng thận. Trong đó, thiếu hụt 21-hydroxylase chiếm 90-95%, 11β-hydroxylase chiếm từ 5- 8% các trường hợp trẻ đẻ sống và rất hiếm gặp trường hợp thiếu hụt 3β-hydroxysteroid dehydrogenase. Bệnh TSTTBS là bệnh di truyền với các dấu hiệu suy thượng thận cấp có thể dẫn đến tử vong ở thể mất muối hay trẻ có các biểu hiện nam tính hoá ở trẻ gái, giả dậy thì sớm ở trẻ trai… gây ảnh hưởng nặng nề đến sự phát triển chiều cao, chức năng sinh dục, sinh sản và tâm lý. Hiện nay, sự phát triển của khoa học kỹ thuật nói chung và kỹ thuật sinh học phân tử nói riêng đã góp phần quan trọng đưa đến nhiều thành công trong lĩnh vực nghiên cứu các bệnh di truyền người. Phân tích đột biến gen CYP21A2 mã hóa cho 21- hydroxylase và đột biến gen CYP11B1 mã hóa 11β-hydroxylase có vai trò quan trọng trong việc khẳng định chẩn đoán nguyên nhân gây bệnh TSTTBS. Sự kết hợp giữa chẩn đoán phân tử, lâm sàng và hóa sinh sẽ giúp cho bác sĩ hoặc những người tư vấn di truyền có một cái nhìn toàn diện, tổng quát về tình trạng của bệnh nhân, giúp định hướng cho việc chỉ định điều trị bằng liệu pháp hormone thay thế suốt đời. Trong những năm gần đây, tại các bệnh viện ở Việt Nam, số lượng các bệnh nhân, đặc biệt các bệnh nhi, có hiện tượng TSTTBS ngày càng xuất hiện nhiều hơn. Hiện nay, tại một số bệnh viện và cơ sở nghiên cứu trong nước đã bắt đầu sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử để phát hiện các đột biến gen gây bệnh TSTTBS. Tuy nhiên, các nghiên cứu chỉ chủ yếu phát hiện đột biến trên gen CYP21A2 bằng cách lọc các đột biến thường gặp bằng kỹ thuật MLPA. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Xuất phát từ các lý do trên đây, luận văn “NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA ĐỘT BIẾN TRÊN GEN CYP11B1 Ở NGƢỜI BỆNH TĂNG SẢN THƢỢNG THẬN BẨM SINH” được tiến hành với những nội dung: - Xác định đột biến trên gen CYP11B1 ở bệnh nhân và gia đình bệnh nhân có hiện tượng tăng sản thượng thận bẩm sinh. - Xác định mức độ ảnh hưởng của đột biến lên hoạt tính của enzyme 11β hydroxylase Từ đó, đánh giá mối tương quan giữa kiểu hình và kiểu gen của đột biến trên gen CYP11B1. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ I. TỔNG QUAN 1.1. Hormone tuyến thƣợng thận 1.1.1. Tuyến thƣợng thận Tuyến thượng thận gồm hai tuyến nhỏ hình tam giác nằm ở cực trên hai thận. Ở trẻ em, cân nặng trung bình mỗi tuyến là 4 gram, gồm hai phần: phần vỏ và phần tủy, khác nhau về bào thai học, sinh hoá học và chức năng. Phần vỏ có ba vùng: vùng cầu (vùng glomerulosa), vùng bó (vùng fasciculata) và vùng lưới (vùng reticularis) (Hình 1.1). Hình 1.1: Vị trí và cấu tạo tuyến thƣợng thận [9] Vỏ tuyến thượng thận sản xuất ra một phức hệ nhiều steroid hormone bao gồm glucocorticoid, mineralocorticoid, androgen (hormone sinh dục nam giới) và estrogen (hormone sinh dục nữ giới). Tuyến này bao bọc xung quanh lõi thượng thận và bao gồm nhiều vùng sản xuất ra các steroid khác nhau (Hình 11). Do được tổng hợp từ cholesterol, các hormone vỏ thượng thận đều có bản chất là steroid và được gọi là corticosteroid hay corticoid (xuất phát từ chữ cortex nghĩa là vỏ). Mặc dù có cùng nguồn gốc và bản chất, những thay đổi về cấu trúc hoá học gồm thay đổi các gốc hoá học và các vị trí liên kết carbon đã tạo nên các nhóm corticoid có tác dụng sinh học Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ khác nhau. Người ta đã chiết xuất được trên 50 dẫn xuất corticoid và chia làm ba nhóm: Hormon chuyển hoá muối (mineralocorticoid), tổng hợp ở vùng cầu. Hormon chuyển hoá đường (glucocorticoid), tổng hợp ở vùng bó. Hormon sinh dục nam (androgen), tổng hợp ở vùng lưới. Cortisol là thành phần chính của glucocorticoids, tham gia vào quá trình chuyển hóa năng lượng và đáp ứng các stress của cơ thể. 1. ợp các steroid hormone ở tuyến thƣợng thận Steroid hormone, trong đó có hormone vỏ thượng thận, được tổng hợp nhờ sự tham gia trực tiếp của một chuỗi các enzyme. Phản ứng hydroxyl hoá giữ vai trò quan trọng trong sự tổng hợp cholesterol từ acetate cũng như quá trình chuyển hoá cholesterol thành steroid hormone và muối mật. Vì vậy, các enzyme tham gia tổng hợp hormone vỏ thượng thận là những enzyme xúc tác quá trình hydorxyl hoá, gọi chung là các hydroxylase. Trừ enzyme 3β- hydroxysteroid dehydrogenase (3β- HSD), các enzyme tổng hợp corticoid đều thuộc họ protein cytochrom P-450, viết tắt là CYP bao gồm: CYP11A1 (chuỗi cholesterol bị phân cắt ra làm nhiều mảnh nhỏ, còn gọi là cytochrome P450 hoặc P450scc), CYP17 (17α-hydroxylase/ 17,20-lyase or P450c17), CYP21A2 (21-hydroxylase cytochrome P450 hoặc P450c21), CYP11B1 (11β- hydroxylase hoặc P45011β), CYP11B2 (aldosterone synthase hoặc P450aldo), và CYP19 (aromatase hoặc P450aom) [36] (Hình 1.2). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 1.2 vỏ [10, 13] , được gọi là steroid 27-carbon. Các mô tế bào steroidogenic có thể tổng hợp cholesterol bằng phương pháp de novo từ muối acetate, muối axetat này có thể làm biến đổi những este nội bào của cholesterol, hoặc nhận lipoprotein từ huyết thanh. Trong quá trình tổng hợp steroid hormone tuyến thượng thận, cholesterol được chuyển đổi thành steroid hormone hoàn chỉnh nhờ sự xúc tác trung gian của các enzyme cytochrome P450 trong ty thể và lưới nội chất. Quá trình tổng hợp bắt đầu xảy ra trong ty thể, tiếp tục trong lưới nội chất, và hoàn tất trong ty thể. Do đó, dạng tiền chất của steroid hormone nằm ở giữa ty thể và các ngăn của tế bào chất là rất quan trọng trong quá trình tổng hợp các hormone tuyến thượng thận. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Quá trình tổng hợp steroid hormone bị giới hạn bởi sự vận chuyển cholesterol từ ngoài vào trong màng ti thể và vùng hoạt động của CYP11A1 (chuỗi 20, 22- hydroxylase cholesterol). Trong quá trình tổng hợp steroid hormone, cholesterol được tập trung lại và đưa đến trung tâm hoạt động của CYP11A1, nơi trực tiếp liên kết với vùng bên trong màng ty thể. Các protein sẽ có nhiệm vụ thực hiện sự vận chuyển này có tên là protein điều hòa steroidgenic [66]. Các pregnenolone sau đó đi từ ty thể đến lưới nội chất để tiếp tục các quá trình chuyển hóa tiếp theo. Mặt khác, pregnenolone còn có thể được chuyển đổi trực tiếp thành progesterone nhờ 3β-hydroxysteroid dehydrogenase (3βHSD). , pregnen 17α-hydropregnenolone nhờ 17α-hydroxylase (CYP17) để sản xuất ra 17α-hydroxypregnenolone. Sau đó, 17α-hydroxypregnenolone sẽ được 3βHSD biến đổi thành 17α-hydroxyprogesterone hoặc steroid C19, dehydroepiandrosterone nhờ xúc tác 17,20 lyase từ CYP17. Bên cạnh đó, dehydroeiandrosterone (DHEA) được 3βHSD biến đổi thành androstenedione tham gia vào cấu tạo các tiền chất của hormone giới tính. P - - - 21 để sản xuất ra lần lượt 11-deoxycorticosterone và 11- deoxycortisol. Những sản phẩm này của CYP21A2 sau đó được đưa trở lại vào ty thể, nơi bước cuối cùng của quá trình tổng hợp steroid hormone trong lớp vỏ tuyến thận diễn ra. Hai đồng phân CYP11B là 11β-hydroxylase/aldosterone synthase (CYP11B2) và 11β-hydroxylase (CYP11B1), làm xúc tác cho quá trình chuyển hóa deoxycorticosterone và 11-deoxycortisol lần l , vùng cầu, sản xuất ra mineralocorticoid aldosterone bền vững từ deoxycorticosteone nhờ sự xúc tác của CYP11B2. Một sự khác biệt về enzyme ở giữa vùng cầu và vùng bó là sự vắng mặt của CYP17 tại vùng cầu. cầu có xu hướng biểu hiện ra CYP11B2. Tại vùng lưới, androstenedione được chuyển đổi thành testosterone và esterone/estradiol nhờ 17β-ketosteroid reductase (17βHSD) và 19-hydroxylase [...]... các vùng được lựa chọn nghiên cứu, các cấu tử ở các enzyme và sự tương tác giữa các cấu tử này [57] 1.4 Bệnh tăng sản thƣợng thận bẩm sinh (TSTTBS) 1.4.1 Khái niệm Tăng sản thượng thận bẩm sinh (TSTTBS) là bệnh di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường, được đặc trưng bởi sự thiếu hụt hoạt động của một trong các enzyme cần thiết để tổng hợp cortisol từ cholesterol của vỏ thượng thận như: 21-hydroxylase... từng người, dựa trên kết quả xét nghiệm lâm sàng và hóa sinh thường xuyên, kết hợp với theo dõi lâm sàng sự tăng trưởng của trẻ, sự phát triển và huyết áp Khi trẻ lớn lên, liều dùng sẽ tăng lên 1.6 Tình hình nghiên cứu Tình hình nghiên cứu trên thế giới Đột biến trên gen CYP11B1- Arg448His, gây bệnh TSTTBS lần đầu tiên được miêu tả vào năm 1991 bởi White và cộng sự [62] Hiện nay đã có nhiều đột biến trên. .. Zhang M và cộng sự khi nghiên cứu ở chín bệnh nhân có biểu hiện bệnh TSTTBS do đột biến trên CYP11B1 đã phát hiện đột biến phổ biến p.R454C và ba đột biến mới p.V148G, IVS7-9C> A, c.1359_1360insG Khi nghiên cứu về mức độ biểu hiện của các đột biến cho thấy các p.R141X, p.V148G, c.1359_1360insG và đột biến p.R454C chỉ biểu hiện 4,9%, 3,9%, 3,7%, 4,5% hoạt tính enzyme [67] Số hóa bởi Trung tâm Học liệu... hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ gen CYP11B1 được tìm thấy nhờ phương pháp PCR và đọc trình tự Tính đến nay đã có hơn 60 đột biến mới được xác định và công bố trên thế giới [7] Rất nhiều đột biến điểm được tìm thấy ở bệnh nhân mắc bệnh CAH đã gây ra những sự rối loạn chức năng của 11β-hydroxylase khi biểu hiện đột biến trên nuôi cấy tế bào (bảng 1.9) Hình 1.7: Đột biến trên gen CYP11B1. .. lặn do đột biến gen trên NST thường Khả năng sinh con bị bệnh là 25% và sinh con dị hợp tử mang gen bệnh lặn là 50% Những người dị hợp tử này rất khó phát hiện và là người truyền gen bệnh cho các thế hệ tiếp theo Tỷ lệ nam và nữ bị bệnh như nhau Bệnh xảy ra không liên tục, ngắt quãng qua các thế hệ Sự kết hôn trong dòng họ hoặc trong quần thể cô lập làm tăng khả năng sinh con bệnh và tăng tần số người. .. giới và sự biến dạng cơ quan sinh dục (Hình 1.2) Như vậy, có thể nói biểu hiện rõ rệt nhất của tăng sản thượng thận bẩm sinh do thiếu hụt 11β-hydroxylase là hiện tượng huyết áp và hormone nam giới ở bệnh nhân tăng cao 1.4.2.2 Biểu hiện lâm sàng Tăng huyết áp là sự rối loạn phổ biến ở bệnh nhân CAH do suy giảm 11βhydroxylase, tuy nhiên huyết áp lại tăng không đồng nhất ở trong những nhóm những bệnh nhân... 3β- hydroxysteroid dehydrogenase (3β- HSD) và 20/22 Desmolase [8] Bệnh này thường có dấu hiệu là sự tăng cao hơn mức bình thường hormone sinh dục đực hay còn gọi là sự nam hóa Biểu hiện rõ rệt nhất là sự xuất hiện cơ quan sinh dục của nam giới bên ngoài cơ quan sinh dục của nữ giới hay cơ quan sinh dục của nam giới phát triển hơn bình thường [23] 1.4.2 Tăng sản thƣợng thận bẩm sinh do thiếu hụt 11β-hydroxylase... Arg348, trong khi đó ở CYP11B2, toàn bộ nhóm heme sắt propionate đều tham gia tạo liên kết hydro ở Arg448 Cả 2 đột biến ở Arg448 và Arg348 đã được tìm thấy trên CYP11B1 ở bệnh nhân mắc bệnh TSTTBS [30] Tất cả những đột biến đã được biết đến ở vị trí codon 348 và 448 đều dẫn đến sự mất hoàn toàn hoạt tính enzyme, phần lớn có thể là do sự mất ổn định của các holoprotein Kết quả của việc tạo ra những... lọc 6 đột biến thường gặp: P30L (Exon 1), mất đoạn 8bp (Exon 3), I172N (Exon 4), Exon 6 Cluster (Exon 6), Q318 (Exon 8), mất toàn bộ gen CYP21A2, mất đoạn 30Kb (Exon 3 hybrid) Năm 2011-2012, Phòng Hệ gen học chức năng thuộc Viện Nghiên cứu hệ gen – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã có những nghiên cứu sâu hơn về di truyền phân tử bệnh TSTTBS trên cả 2 gen CYP11B1 và CYP21A2 Số hóa bởi Trung... trong vùng fasciculata, nhưng nó lại đóng vai trò quan trọng ở các bệnh nhân có hội chứng glucocorticoid áp chế tăng aldosterone [2] Hình 1.5: Vị trí của CYP11B1 và CYP11B2 trên chromosome 8 [17] 1.3.2 Cấu trúc không gian của CYP11B1 Để tìm hiểu về mối quan hệ giữa cấu trúc và chức năng của CYP11B1 đòi hỏi phải nghiên cứu về cấu trúc không gian 3D của enzyme này Sự xác định cấu trúc protein nhờ sự nhiễu . dung: - Xác định đột biến trên gen CYP11B1 ở bệnh nhân và gia đình bệnh nhân có hiện tượng tăng sản thượng thận bẩm sinh. - Xác định mức độ ảnh hưởng của đột biến lên hoạt tính của enzyme 11β. hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Xuất phát từ các lý do trên đây, luận văn “NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA ĐỘT BIẾN TRÊN GEN CYP11B1 Ở NGƢỜI BỆNH TĂNG SẢN THƢỢNG THẬN BẨM SINH . ẢNH HƢỞNG CỦA ĐỘT BIẾN TRÊN GEN CYP11B1 Ở NGƢỜI BỆNH TĂNG SẢN THƢỢNG THẬN BẨM SINH Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm Mã số: 60420114 Học viên: Nguyễn Thu Hiền Lớp: K15-Sinh