I GIỚI THIỆU LUẬN ÁN I.1 Ý nghĩa luận án Cuộc sống ngày đối mặt với nhiều nguy cơ: thảm họa môi trường, chứng bệnh nan y ung thư, HIV/AIDS, bệnh tim mạch dịch bệnh phức tạp, nguy hiểm xuất gần đây: dịch SARS, cúm H5N1, H1N1, v.v số loài động, thực vật bị đưa vào sách đỏ tuyệt chủng Điều thúc đẩy nhà khoa học phải tìm thuốc chữa bệnh có tác dụng chọn lọc, hiệu cao giá thành rẻ để trị bệnh nghiên cứu tìm cách bảo vệ, bảo tồn loài động thực vật quý Một đường hữu hiệu để phát chất có hoạt tính tiềm năng, phát triển thành thuốc chữa bệnh cho người, gia súc trồng từ hợp chất thiên nhiên Các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sử dụng trực tiếp để làm thuốc dùng làm "Mơ hình" cho nghiên cứu tổng hợp bán tổng hợp loại thuốc Họ Cau họ thực vật lớn, có nhiều gắn liền với đời sống nhân dân ta số nơi giới Trung Quốc, Australia, nhiên có cơng trình nghiên cứu cấu trúc hố học hoạt tính sinh học họ Cau Việt Nam công bố Cây rau má, dân gian sử dụng để làm rau ăn, nước giải khát sử dụng nhiều thuốc để trị số chứng bệnh thường gặp người gia súc quen thuộc với Xuất phát từ vấn đề trên, chọn đề tài “Nghiên cứu cấu trúc hoạt tính sinh học số hợp chất phân lập từ cọ hạ long (Livistona halongensis T.H Nguyen & Kiew) rau má [Centella asiatica (Linn.) Urban]” I.2 Mục tiêu luận án Nghiên cứu, phát chất có cấu trúc hóa học hoạt tính sinh học lý thú từ lồi thuộc chi Cọ (Livistona R.Br.), họ Cau (Arecaceae) rau má Việt Nam, cụ thể cọ hạ long rau má Ba Hà Nội I.3 Những đóng góp luận án - Đây lần thành phần hóa học hoạt tính sinh học dịch chiết hợp chất phân lập từ cọ hạ long (Livistona halongensis) nghiên cứu - Đã phân lập xác định cấu trúc 12 hợp chất từ cọ hạ long, có hợp chất hợp chất lần đầu phân lập từ chi Cọ - Từ rau má thu hái Ba Vì - Hà nội phân lập hợp chất chất triterpen với hàm lượng cao hỗn hợp chất stigmasterol glucosid + β-sitosterol glucosid - Cơng bố hoạt tính gây độc tế bào, kháng vi sinh vật kiểm định, kháng oxy hóa dịch chiết số hợp chất phân lập từ cọ hạ long (Livistona halongensis) rau má (Centella asiatica) I.4 Bố cục luận án Luận án gồm 195 trang với chương, 18 bảng, 39 hình, sơ đồ, 81 tài liệu tham khảo phụ lục Luận án bố cục sau: Mở đầu: trang; Tổng quan: 29 trang; Thực nghiệm: 25 trang; Kết thảo luận: 55 trang, Kết luận kiến nghị: trang, Danh mục cơng trình liên quan đến luận án: trang, Tài liệu tham khảo: trang, phụ lục 71 trang II NỘI DUNG CỦA LUẬN ÁN Mở đầu: Đề cập tính thực tiễn, ý nghĩa khoa học, đối tượng, mục tiêu nhiệm vụ luận án Chương 1: Tổng quan Trên sở nghiên cứu tài liệu, chương tổng quan đề cập đến đặc điểm thực vật, ứng dụng y học cổ truyền tình hình nghiên cứu hóa học, hoạt tính sinh học số lồi chi Cọ (Livistona R.Br.), chi Rau má (Hydrocotyle; Centella) Chương 2: Thực nghiệm 2.1 Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị 2.2 Phương pháp nghiên cứu Quy trình chiết: Mẫu thực vật làm sạch, sấy khô nhiệt độ 40 C, xay nhỏ ngâm chiết với dung mơi có độ phân cực tăng dần chiết hỗn hợp dung môi MeOH-H2O nhiệt độ phịng sau chiết với dung môi n-hexan, diclometen, metanol Cất loại dung môi thu cao chiết tương ứng Phân lập chất: Tinh chế cao chiết thu phương pháp sắc ký: sắc ký cột thường, sắc ký cột nhanh với chất hấp phụ hệ dung môi thích hợp Xác định cấu trúc hóa học: Cấu trúc hợp chất xác định kết hợp phương pháp phổ đại phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ khối (ESI-, HR-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiều hai chiều (COSY, HSQC, HMBC…) Phương pháp thăm dị hoạt tính sinh học Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định Hoạt tính gây độc tế bào Hoạt tính chống oxy hóa 2.3 Phân lập hợp chất từ cọ hạ long: (Sơ đồ 2.1, Sơ đồ 2.2 ) 2.4 Phân lập hợp chất từ rau má: (Sơ đồ 2.3) Sơ đồ 2.1 Phân lập chất từ vỏ cọ hạ long (L halongensis) Vỏ thân cọ khô xay nhỏ (900g) Chiết lần lượt: n-hexan, diclometan, MeOH Cất loại dung môi Cao diclometan 3,1 g (LHV.d) Cao n-hexan 4,9 g (LHV.n) Cao MeOH 24,9 g (LHV.m) Sắc ký silicagen: n-hexan/ EtOAc Pđ 62 mg Pđ 100 mg Pđ 40 mg Pđ4 56 mg Sắc ký silicagen: n-hexan/ EtOAc LHVn6 30 mg 67 Kết tinh: n-hexan/ EtOAc(1:1) LHVn4 28 mg 69 LHVn5a 50 mg 68 Pđ6 1260 mg Pđ5 360 mg CT1 50 mg 71 LHVn7 36 mg 70 LHVH2 650 mg 72 Sơ đồ 2.2 Phân lập chất từ rễ cọ hạ long (L halongensis) Rễ cọ hạ long khô xay nhỏ (900g) Chiết lần lượt: n-hexan, diclometan, MeOH Cất loại dung môi Cao n-hexan 2,1 g (LHR.n) Cao diclomêtan 2,0 g (LHR.d) Cao MeOH 38 g (LHR.m) Sắc ký silicagen Sắc ký silicagen Pđ 150 mg F6 100 mg F4 660 mg Sắc ký silicagen Pđ 16-40 60 mg Sắc ký silicagen Acetyl hóa, SKC Acetyl hóa, SKC LHRn2 10 mg 73 F9 156 mg LHRn3 15 mg 74 LHRm4 32 mg 78 Sắc ký silicagen LHRm1 40 mg 75 LHRm2 30 mg 76 LHRm3 25 mg 77 LHRm6 40 mg 79 Sơ đồ 2.3 Phân lập chất từ rau má [C asiatica (L.) Urban.] Rau má khô xay nhỏ (900g) Chiết MeOH lần, t=800C, 2h, thêm H2O Dịch chiết MeOH Cất loại MeOH Chiết với n-hexan Dịch nước Dịch n- hexan Dịch CH2Cl2 Cất loại dung môi Cất loại dung môi Cao CH2Cl2 (25 g) Cao nước (120g) Cao n-hexan(20g) Chiết với CH2Cl2 Thủy phân NaOH 10%, 2h, t=800C Dung dịch muối Trung hòa HCl 5%, lọc kết tủa Cặn tủa 12,5 g Sắc ký silicagen RM1 3,4 g 82 RM2 3,95 g 83 RM3 0,85 g 84 Chương 3: Kết thảo luận 3.1 Nghiên cứu thành phần hóa học cọ hạ long (Livistona halongensis) 3.1.1 Xác định cấu trúc hóa học chất phân lập từ vỏ thân cọ hạ long *) Chất 67 (LHVn6): Cyclomusalenon Phổ hồng ngoại chất 67 có đỉnh hấp thụ nhóm = CH2 (3067 885 cm-1), vòng cyclopropyl (3030 cm-1) nhóm carbonyl (1712 cm-1) bên cạnh dao động nhóm –CH2 –CH3 (2920, 2867, 1457 1373 cm-1) Phổ khối phân giải cao (HR-ESI-MS) (xem hình 4.2) cho pic ion phân tử m/z = 425,38078 [M+H]+, theo tính tốn cho C30H49O 425,3783 Như cơng thức phân tử chất 67 C30H48O Theo số liệu phổ hồng ngoại phổ khối chất 67 triterpen xêtơn có chứa vịng cyclopropan nhóm (=CH2) Dự đốn chứng minh qua phổ 1H- 13C-NMR Phổ 1HNMR có tín hiệu cộng hưởng hai proton vòng cyclopropan  = 0,324 (1H, d, J = 3,8 Hz, H-19A) 0,553 (1H, d, J = 4,0 Hz, H-19B); 4,60 ( 2H, s, =CH2) tín hiệu nhóm methyl, có x d x s Các số liệu cho phép dự đoán chất 67 cyclomusalenon Phổ 13 C-NMR phổ DEPT chất 67 cho thấy có tín hiệu 30 ngun tử carbon, có nhóm CH3, 12 nhóm CH2, nhóm CH carbon bậc Phổ H-H-COSY chất 67 cho thấy có tương tác H2-26 (4,60 ppm) H3-27 (1,573 ppm) chứng minh có mặt nhóm isopropenyl (-C(CH3) =CH2) phân tử chất 67 Vòng cyclopropan thấy rõ qua tương tác H19A (0,324 ppm) H19B (0,553 ppm) Những tín hiệu khác bị trùng lặp nhiều Phổ HSQC cho phép xác định độ chuyển dịch hoá học 13C 1H số nhóm phân tử chất 67 nhóm CH2 đứng bên cạnh nhóm cacbonyl (C3) Ta thấy rõ tương tác H2-2 (2,33 ppm) C-2 (41,0 ppm), tương tác C19 (27,0 ppm) H19A (0,324 ppm) H19B (0,553 ppm) Phổ HMBC cho thấy tương tác C-3 (213,4 ppm) với H2-2 (2,33 ppm), điều chứng minh cho nhóm carbonyl vị trí C3 Ngồi cịn thấy rõ tương tác H3-27 (1,573 ppm) với C24 (41,6 ppm); C25 (150,2 ppm); C26 (109,4 ppm).Tổng hợp liệu sau so sánh phổ 13C-NMR chất 67 với phổ 4-epicyclomusalenon ghi điều kiện cyclomusalenon kết luận chất 67 cyclomusalenon [(24S)-24-methyl-29-norcycloart-25-en-3-on] *) Chất 68 (LHVn5a): Cycloleucadenon Phổ hồng ngoại chất 68 cho tín hiệu hấp thụ nhóm cyclopropyl 3030cm-1, nhóm =CH2 3072; 890 cm-1 nhóm carbonyl 1715 cm - Phù hợp với phổ hồng ngoại, phổ 1H-NMR 68 cho tín hiệu cộng hưởng đặc trưng cho vòng cyclopropan  = 0,566 (1H, d, J= 3,9 Hz, H-19A), 0,791 (1H, br s, H-19B), 4,66 (2H, m, =CH2) tín hiệu nhóm methyl có hai tín hiệu methyl doublet Phổ 13C-NMR phổ DEPT chất 68 cho thấy có tín hiệu 31 nguyên tử carbon, có nhóm CH3, 12 nhóm CH2, nhóm CH carbon bậc Từ số liệu phổ thu cho thấy 68 67 hai chất có cấu trúc khung, 68 có nhiều nhóm CH3 Điều khẳng định thêm qua phổ ESI-MS phân giải cao với pic ion giả phân tử m/z =439,39012 (C31H51O) [M+H]+ Như chất 68 có cơng thức phân tử C31H50O (M= 438) So sánh liệu phổ 1H- 13C-NMR chất 68 với phổ cycloleucadenone ghi dung mơi cho thấy chúng hồn tồn giống Vậy kết luận, chất 68 cycloleucadenon *) Chất 69 (LHVn4): 3β- Cyclomusalenol Phổ hồng ngoại chất 69 cho đỉnh hấp thụ đặc trưng nhóm hydroxyl (3341 cm-1), nhóm =CH2 (3076 887 cm-1), nhóm cyclopropyl (3030cm-1) Phổ 1H- 13C-NMR chất 69 gợi ý chất 69 có khung carbon với chất 67 Sự có mặt nhóm isopropenyl thể qua tín hiệu ở: H = 4,66 (2H, s) C = 109,3 (t) 150,2 ppm (s) So với phổ chất 67 phổ chất 69 khơng chứa nhóm carbonyl vị trí C-3 mà chứa nhóm hydroxyl [H: 3,20 (1H, dt, J=10,9, 4,8 Hz, H-3α, C: 77,0 (d), C-3] Nhóm hydroxyl C-3 xác định vị trí β (3β-OH) dựa vào tách vạch tín hiệu H-3 dt Trong trường hợp 3α-OH tín hiệu H-3 singlet (s) Phổ 13C-NMR phổ DEPT chất 69 cho thấy có tín hiệu 30 ngun tử carbon, có nhóm CH3, 12 nhóm CH2, nhóm CH carbon bậc Phổ khối phân giải cao (HR-ESI-MS) cho pic ion giả phân tử m/z = 427,36355 phù hợp với công thức phân tử (C30H51O) [M+H]+ Như công thức phân tử chất 69 C30H50O Từ số liệu phổ trên, kết hợp so sánh với số liệu phổ 1HNMR 3β- Cyclomusalenol phân lập từ chuối hột (Musa balbisiana colla), kết luận chất 69 3β-cyclomusalenol [(24S),14α, 24-dimethyl-9β,19-cyclo-5α-cholest-25-en- 3β-ol] *) Chất 70 (LHVn7 = LHRn3): Stigmast-4-en-3-on Phổ hồng ngoại chất 70 cho đỉnh hấp thụ nhóm carbonyl liên hợp (1678 cm-1) Phổ 1H-NMR (Hình 4.10, 4.11, 4.12) cho thấy có hai nhóm metyl với tín hiệu singlet H = 0,71 (3H, s, CH3-18) H = 1,18 (3H, s, CH3-19), ba nhóm metyl gắn với –CH với tín hiệu doublet tại: H = 0,82 (3H, d, J = 6,7 Hz, CH3-26); 0,84 (3H, d, J = 7,0 Hz, CH3-27), 0,86 (3H, d, J = 7,4 Hz, CH3-21) nhóm metyl gắn với – CH2 với tín hiệu triplet : H = 0,92 (3H, t, J = 6,3 Hz, H-29) Sự có mặt nhóm carbonyl liên hợp thấy rõ phổ 13C-NMR (Hình 4.13) với tín hiệu C =199,598 (s, C-3), 171,653 (s, C-5) 123,754 (d, C-4) tín hiệu H = 5,72 (1H, br s, H-4) Phổ 13CNMR phổ DEPT chất 70 có tín hiệu 29 ngun tử carbon, có nhóm CH3, 11 nhóm CH2, nhóm CH nguyên tử carbon bậc Phổ khối phân giải cao (HR-ESI-MS) cho pic ion phân tử m/z = 413,37162 [M+H]+ Như công thức phân tử chất 70 C29H48O (M=412) Phổ 1H- 13C-NMR chất 70 hoàn toàn phù hợp với phổ chất stigmast-4-en-3-on tài liệu Như chất 70 stigmast-4-en-3-on *) Chất 71 (CT1): Stigmasterol Chất 71: Được phân lập dạng tinh thể màu trắng, điểm nóng chảy 169-171oC Phổ 13C-NMR DEPT cho tín hiệu cộng hưởng 29 cacbon, có cacbon bậc bốn, 11 cacbon bậc ba, cacbon bậc hai nhóm metyl Phổ 13CNMR cho tín hiệu cộng hưởng hai liên kết đơi vị trí C5 = C6: ( = 140,8 121,7) vị trí C22 = C23: ( = 138,3 129,3) Phổ 1H-NMR cho thấy có hai nhóm metyl với tín hiệu singlet H = 0,70 (3H, s, H-18) H = 1,01 (3H, s, H19), ba nhóm metyl gắn với –CH với tín hiệu doublet tại: H = 0,798 (3H, d, J = 6,4 Hz, H-26), 0,848 (3H, d, J = 6,4 Hz, H-27), 1,02 (3H, d, J = 6,7 Hz, H-21) nhóm metyl gắn với – CH2 với tín hiệu triplet : H = 0,807 (3H, t, J = 7,5 Hz, H-29) Ở vùng trường thấp cho tín hiệu cộng hưởng olefin proton ( = 5,35 (1H, br s, H-6) hai olefin proton ( = 5,02 (1H, dd, J = 8,7, 15.2 Hz, H-22) 5,16 (1H, dd, J = 8,6, 15,2Hz, H-23) ; proton carbinol:  = 3,51 (1H, m, H3) chứng minh cho nhóm β-OH vị trí C3 Phổ khối ESI-MS cho pic ion phân tử m/z = 414,8 phù hợp với công thức phân tử (C29H50O) [M+2H]+ Như công thức phân tử chất 71 (C29H48O) với M = 412 Ngồi ta cịn thấy pic m/z = 395,8 [M- H2O +1] Pic pic bản, hình thành tạo thành dẫn xuất dien liên hợp (3,5-dien) sau phân tử 71 bị tách phân tử nước Kết hợp kiện phổ ESIMS, phổ 1HNMR, 13C-NMR phổ DEPT cho phép xác định cấu trúc chất 71 stigmasterol *) Chất 72 ( LHVH2): β-Sitosterol Chất 72 xác định β-sitosterol qua so sánh số liệu phổ 1HNMR 13C-NMR chúng với số liệu tài liệu tham khảo 3.1.2 Xác định cấu trúc hóa học chất phân lập từ rễ cọ hạ long (Livistona halongensis) *).Chất 73 (LHRn2): 6-O-acetyl-2R,8-dimetyl-2-(4R,8R,11-trimetyltridecence12)chroman Chất 73 thu dạng bột vô định hình, có pic ion phân tử phổ khối phân giải cao ESI-HRMS m/z = 457,36838 [M + H]+ (theo tính tốn cho C30H49O3 457,36817) Phổ FT-IR cho thấy đỉnh hấp thụ 2936, 2857 (CH3, CH2), 1760 1209 cm-1 (phenyl axetat) Phổ 1H-NMR cho biết phân tử chất 73 có nhóm metyl, có nhóm thể dạng tín hiệu dublet H = 0,84 (J = 5,9 Hz); 0,85 (J = 5,9 Hz); 0,99 (J = 6,8 Hz) Một tín hiệu metyl singlet H 10 = 2,13 gán cho nhóm metyl đính vào vịng thơm; tín hiệu metyl nhóm axetyl cộng hưởng 2,24 ppm metyl nhóm isopropenyl xuất 1,64 ppm Ngồi ra, tín hiệu hai proton thơm có tương tác meta 6,60 6,66 ppm (mỗi tín hiệu d, J = 2,6Hz), hai proton olefin (>C=CH2) 4,66 ppm proton no vùng từ 0,80 – 2,80 ppm quan sát thấy phổ 1H-NMR Chất 73 cho tín hiệu 30 nguyên tử cacbon phổ 13C-NMR DEPT, bao gồm nhóm metyl, cacbon thơm, 11 nhóm metylen, nhóm metin cacbon bậc Sự có mặt phần 2-metylchroman axetat phân tử 73 chứng minh qua nhóm tín hiệu: vịng thơm, aliphatic metylen metyl Các tương tác phổ HMBC khẳng định cấu trúc phần 2-metylchroman axetat phân tử chất 73 Các tương tác tương tác cacbon cầu ete (C = 150,37, C-8a) với hai proton thơm H = 6,60; 6,66 (H-5, H-7), hai proton H = 2,72 (2H-4), proton nhóm metyl gắn với vịng thơm H = 2,13 (8-CH3) tương tác cacbon thứ cầu ete (C = 76,16, C-2) với bốn proton H = 2,72 (2H-4); 1,73; 1,79 (2H-3); 1,56 (2H-1'); nhóm metyl H = 1,25 Sự nối kết nhóm axetyl C-6 nhóm metyl C-2 xác định dịch chuyển phía trường thấp C-6 (142,51 ppm) tương tác quan sát phổ HMBC C-6 H-5, H-7 (H = 6,60; 6,66); C-2 (76,16 ppm) 2-CH3 (1,25 ppm) Các liệu phổ phân tích cho phép kết luận cấu trúc đơn vị 2-metylchromanol-6-axetat chất 73 Cấu trúc mạch nhánh chứng minh qua tương tác C-12' (C = 149,82) nhóm metyl bậc H = 1,64 (s, 3H-13'), nhóm metyl bậc hai H = 1,00 (d, 3H-11') phổ HMBC Vị trí nối kết mạch nhánh xác định C-2 tương tác 2H-1' (H = 1,56) với C2 (C = 76,16) Cấu hình tuyệt đối vị trí C-2, 4’ 8’ xác định dựa vào so sánh với tài liệu tham khảo công bố Browstein Brem Theo tài liệu này, đồng phân quang học khác α δ- tocopherol cho độ chuyển dịch khác nhiều vị trí CH3- 11 4’ Do đó, xác định cấu hình tuyệt đối chất 73 dựa vào việc so sánh độ chuyển dịch hóa học vị trí CH3-4’ với loạt đồng phân quang học δ- tocopherol nghiên cứu thống kê tài liệu Qua đối chiếu với tài liệu tham khảo, độ chuyển dịch hóa học CH3-4’ (δC 19,65) hồn tồn phù hợp với cấu hình tuyệt đối R, R, R chất 3,4-dehydrotocopherol Do cấu trúc chất 73 xác định 6-O-acetyl-2R,8-dimethyl-2-(4R,8R,11-trimethyltridecence12)chroman *) Chất 75 (LHRm1): 3,5,3’,5’-tetrahydroxy-4-metoxystilben: Phổ 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz)  (ppm), J (Hz) chất 75 cho tín hiệu nhóm methoxy δH 3,83 (3H, s) với năm proton thơm hai proton olefin vị trí trans δH 6,80 (1H, d, J = 16,2 Hz) 6,85 (1H, d, J = 16,2 Hz) Các tín hiệu proton thơm thuộc hai vịng benzen, ba proton thuộc vịng thơm bị vị trí C3’ C-5’ δH 6,20 (1H, t, J = 2,1, H-4’); 6,46 (2H, d, J = 2,1, H-2’, H-6’) hai proton lại nằm vị trí meta vịng A δH 6,55 (2H, s, H-2, H-6) Phân tử chất 75 có tính đối xứng cao Phổ 13 C NMR chất 75 cho tín hiệu 15 cacbon có x CH, x OCH3 x Cq Hai cacbon olefin xuất δC 129,49 128,94 ppm Các số liệu phổ cho thấy chất 75 có chứa khung stilben với nhóm có nhóm OH nhóm methoxy Qua so sánh số liệu phổ với tài liệu tham khảo chứng tỏ chất 75 có cơng thức cấu tạo 3,5,3’,5’-tetrahydroxy-4-metoxystilben Từ số liệu ESI-MS, phổ hồng ngoại, phổ 1H-NMR, 13C-NMR, so sánh với tài liệu tham khảo, xác định cấu trúc chất 75 *) Chất 76 (LHRm2): 2S,3S-3,5,7,3’-tetrahydroxy-5’-metoxyflavan 12 Công thức phân tử 76 C16H16O6 xác định qua pic ion m/z 303 [M-H]- (ion âm) 327 [M+Na]+ (ion dương) phổ ESIMS Để khẳng định cấu trúc chất 76, chúng tơi axetyl hóa chất 76 tạo dẫn xuất tetraaxetyl 80 Phổ HR-ESI MS chất 80 có pic ion m/z 494,93860 ( tính tốn cho C24H24NaO10 495,12972) Từ khẳng định chắn công thức phân tử chất 76 C16H16O6 Phổ H-NMR 76 có singlet H 3,87 (C 56,5) chứng tỏ chất 76 có nhóm methoxy Phía trường thấp có tín hiệu singlet H 6,93 (2H, H-2’ , H-6’) 7,02 (1H, H-4’) đặc trưng cho có mặt nhân phenyl có nhóm C-1, C-3, C-5 [74] Tương tác HMBC C-1’ (C 133,7) với H-2’/ H-6’ H-2 khẳng định nhóm C-3’ C-5’ Cặp doublet có số tương tác meta (J = 2,2 Hz) H 5,97 5,95 cho thấy vịng A có nhóm C-5 C-7 Tín hiệu nhóm oxymethin H 4,88 (H-2), 4,21 (H-3) cặp doublet kép H 2,89 2,77 đặc trưng cho khung hydroxyflavan Tương tác proton nhóm metoxy với C-5’ (C 148,5) cho biết nhóm gắn với C-5’ Phân tích đầy đủ tương tác trực tiếp phổ HSQC tương tác qua liên kết phổ HMBC cho phép kết luận cấu trúc chất 76 3,5,7,3’-tetrahydroxy-5’-metoxyflavan Hằng số tương tác bé H-2 H-3 cho biết proton vị trí cis với nhau, chất 76 có cấu hình tương đối (2R, 3R) (2S, 3S) Chất 76 có suất quay cực [α]D25 = +2,7 ( c = 2,84, MeOH) so sánh với tài liệu tham khảo gợi ý cho biết cấu hình chất 76 2S, 3S Bằng kết hợp số liệu phổ phân tích xác định cấu trúc 76 là: 2S,3S-3,5,7,3’tetrahydroxy- 5’- metoxyflavan Đây chất mới, lần tìm thấy thiên nhiên 13 *) Chất 77 (LHRm3): β-sitosterol-3-O-β–D-glucopyranosid (βsitosterol glucosid) Số liệu phổ 1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) chất 77 xuất tín hiệu singlet δH 0,65 (3H, s), 1,23 (3H, s) 0,96 (3H, s) với metyl dublet δH 0,80 (3H, d, J = 6,9), 0,81 (3H, d, J = 6,8 Hz), 0,90 (3H, d, J = 6,5 Hz) 1,00 (3H, d, J = 6,7Hz) Ngoài ra, phổ H-NMR cịn quan sát thấy tín hiệu proton vinylic δH 5,32 (1H, br s) tín hiệu nhóm metin mang oxi 3,42 (1H, m) Các tín hiệu proton lại bị trùng lấp lên khoảng δH 1,0-2,3 ppm Chất 77 có gắn với đường glucose thấy rõ qua cụm tín hiệu metin proton δH 3,05-3,08 (1H, m); 3,10-3,14 (3H, m) tín hiệu nhóm metilen mang oxi δH 3,64 (1H, dd, J = 5,5; 10,1, H-6A-Glc) 3,46 (1H, m, H-6B-Glc) Phổ 1HNMR chất 77 cho tín hiệu proton anome δH 4,22 (1H, d, J =7,8 Hz) tín hiệu nhóm OH đường δH 4,39 (1H, t, J = 5,7 Hz; 6’-OH) 4,83 (3H, m; 2’,3’,4’-OH) Trên phổ 13CNMR hợp chất 77 cho thấy xuất 35 cacbon có 29 cacbon aglycon cacbon nhánh đường Tín hiệu liên kết olefin δC 121,13 140,42, tín hiệu nhóm metyl δC 11,62; 11,73; 18,56; 18,90; 19,04 19,65, tín hiệu nhóm metin mang oxi aglycon δC 70,09 (C-3) Ngoài cịn có tín hiệu cacbon anome δC 100,75 (C-1’) với metin mang oxi δC 73,43; 76,69; 76,74 76,90 Kết hợp liệu phổ cho thấy chất 77 tritecpen khung prostan có gắn thêm nhánh đường βglucopyranose Qua so sánh với tài liệu tham khảo ta xác định chất 77 daucosterol 14 *) Chất 78 (LHRm4): 2R,3R-3,7,3’-trihydroxy-5’-metoxyflavan 5-O-D-glucopyranosid Kết hợp liệu phổ 1H, 13C-DEPT NMR pic ion m/z 489,14618 [M+Na]+ (tính tốn cho C22H26NaO11 489,13728), xác định công thức phân tử 78 C22H26O11 Dữ kiện phổ MS, 1H-, 13CNMR cho thấy chất 78 có cấu trúc khung nhóm giống chất 76 có thêm đường hexose Tín hiệu nhóm oxymethin (H 3,4 – 4,9 C 62-103) với tín hiệu nhóm oxymethylen (H 3,91; 3,73 C 62,6) đặc trung cho diện đường glucose Proton anomeric H 4,85(d, J = 7,5 Hz) cho thấy đường β-Dglucopyranose Tương tác H-1” (H 4,85) với C-5 (C 158,4) phổ HMBC cho biết đường gắn với C-5 Tín hiệu C 158,4 quy kết cho C-5 mà C-7 C7 phải có tương tác với proton liền kề (C-7/H-6, H-8) Cấu hình cis H-2 H-3 xác định qua tín hiệu proton singlet H 4,87 4,21 (br.s) Chất 78 có suất quay cực [α]25 D: – 2.90 (c = 1.22, MeOH) ngược dấu so với chất 76, cho thấy chất cấu hình tuyệt đối 2R, 3R Từ việc phân tích số liệu phổ chiều, chiều kết hợp với công thức phân tử xác định cấu trúc 78 2R,3R-3,7,3’trihydroxy-5’-metoxyflavan 5-O--D-glucopyranosid, chất *) Chất 79 (LHRm6): Sacharose octaacetat 15 - Phổ 1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) chất 79 cho thấy tín hiệu hai đường monosacarit bị acetyl hóa hồn tồn với tín hiệu nhóm acetoxy cho thấy phổ 1H-NMR δH 1,99 (s, 3H, CH3CO); 2,00 (s, 3H, CH3CO), 2,10 (br s, 15H, x CH3CO), 2,17 (s, 3H, CH3CO) phổ 13C-NMR nhóm CH3CO δC 169,51; 169,66; 169,89; 170,03; 170,11; 170,48 170,70 Ngồi phổ 13C-NMR cịn xuất tín hiệu cacbon anome C-1 (δC 89,87), cacbon bậc δC 103,95 (C-2’), tín hiệu CH thuộc vùng đường với có mặt metilen gắn với oxi (3xCH2OH) Phổ 1H-NMR cho tín hiệu proton vùng đường δH 4,12-4,17 (m, 3H), 4,20-4,22 (m, 1H), 4,25-4,31 (m, 3H) với tín hiệu proton nhóm CH2OH δH 4,34 (1H, dd, J = 4,3; 11,9 Hz); 4,88 (1H, dd, J = 3,7; 10,4 Hz); 5,08 (1H, t, J = 9,8 Hz); 5,37 (1H, t, J = 5,9 Hz); 5,40 (d, 1H, J = 5,9 Hz); 5,45 (1H, t, J = 10,4 Hz) Phân tích số liệu phổ, so sánh với tài liệu tham khảo cho thấy chất 79 có cơng thức cấu tạo đường disacarit với thành phần α-D-glucopyranosyl (1→2)-β-Dfructopyranosid, gọi saccharose octaacetat 3.2 Nghiên cứu thành phần hóa học rau má (Centella asiatica (L.) Urban.) *) Chất 82 (RM1): Axit asiatic Chất 82 (RM1: 3,4 g, 0,37% tính theo trọng lượng mẫu rau má thô), phân lập từ phân đoạn F2 cặn chiết MeOH dạng tinh thể màu trắng (CHCl3/MeOH), điểm nóng chảy 324-326°C Phổ hồng ngoại: cho đỉnh hấp thụ đặc trưng nhóm hydroxyl (3411 cm-1), 16 nhóm CH2, CH3 (2930 2866 cm-1) Phổ 1H-NMR cho thấy có nhóm metyl có nhóm metyl gắn với cacbon bậc với tín hiệu singlet tại: 0,717, 0,871; 0,992; 1,067; 1,158 hai nhóm metyl gắn với CH với tín hiệu doublet H = 0,919 (J = 6,5 Hz) H = 0,929 (J = 6,5 Hz) Ngoài ra, phổ có tín hiệu nhóm CH2 gắn với OH H = 3,297 (d, J = 11,0 Hz; H-23a); H = 3,535 (d; J = 11,0 Hz; H-23b), nhóm hydroxy gắn với CH  = 3,387 (J = 9,5 Hz; H-3) 3,718 (m, H-2) tín hiệu nối đơi  = 5,260 (br s, H-12) Phổ 13C-NMR DEPT chất 82 có mặt 30 cacbon có nhóm metyl; nhóm cacbon bậc 2; nhóm cacbon bậc nhóm cacbon bậc 4, nhóm cacboxylic với  = 181,6 ppm tín hiệu nối đơi C12 = C13;  = 139,8, 126,6 ppm Phổ H-H-COSY cho thấy có tương tác hai proton H: 3,297 (d, J = 11 Hz); 3,535 (d; J = 11 Hz) gắn trực tiếp với cacbon vị trí C-23, proton  = 3,387 (J = 9,5 Hz; H-3) tương tác với proton  = 3,718 (m, H-2) Phổ HSQC cho thấy rõ H-2 (3,72 ppm) C-2 (69,7 ppm), C-3 (72,2 ppm) H-3 (3,38 ppm), tương tác C-12 (126,6 ppm) H-12 (5,26 ppm) Phổ khối (ESI-MS) cho pic ion giả phân tử m/z = 487,4 [M-H]- Kết hợp với phổ 1H- phổ 13C NMR dự đốn chất 82 có cơng thức phân tử C30H48O5 So sánh số liệu phổ MS, 1H- 13C-NMR chất 82 với số liệu axit asiatic tài liệu tham khảo, thấy hồn tồn trùng khớp Vậy kết luận chất 82 axit asiatic *) Chất 83 (RM2): Axit madecassic Phổ hồng ngoại chất 83 cho đỉnh hấp thụ đặc trưng nhóm hydroxyl (3416 cm-1), nhóm CH2, CH3 (2930 2867 cm-1) Phổ 1H- 17 NMR cho thấy có metyl sinlet, hai metyl doublet 0,92 1,10 ppm Ngồi phổ có tín hiệu nhóm hydroxymetin (-CHOH) H: 3,31 (d, J = 9,5 Hz, H-3); 4,4 (m, H-6); tín hiệu H = 5,31 ppm đặc trưng cho nhóm metin olephinic (= CH) tín hiệu doublet đặc trưng cho nhóm CH2 gắn với OH H: 3,46 3,61ppm Sự có mặt nhóm củng cố tín hiệu phổ 13CNMR C: 69,6 ppm (C-2), 78,2 (C-3), 68,4 (C-6), 126,9 139,0 ppm (C12 C13) Phổ 1H 13C- NMR chất 83 gợi ý chất 83 có khung cacbon với chất 83 Phổ khối cho pic ion phân tử m/z = 505,35 [M+H]+ , kết hợp với phổ 1H- 13C - NMR suy chất 83 phù hợp với công thức phân tử C30H48O6 Các số liệu phổ MS, 1H- 13CNMR chất 83 hoàn toàn phù hợp với số liệu axít madecassic tài liệu tham khảo Do chất 83 axit madecassic *) Chất 84: RM3 (Hỗn hợp stigmasterol glucosid + β - sitosterol glucosid): So sánh kiện phổ ESI-MS, phổ 1H, 13CNMR DEPT với tài liệu hỗn hợp stigmasterol glucosid + β-sitosterol glucosid cho phép xác định hỗn hợp stigmasterol glucosid + β sitosterol glucosid 18 Bảng 3.8 Công thức hợp chất phân lập từ cọ hạ long rau má 19 3.3 Kết thử hoạt tính sinh học 3.3.1 Kết thử hoạt tính sinh học dịch chiết từ cọ hạ long *) Hoạt tính gây độc tế bào: Dịch chiết diclometan (LHRd) từ rễ có hoạt tính ức chế phát triển dòng tế bào ung thư thử nghiệm KB, LU, HepG2 *) Hoạt tính chống oxi hố: Dịch chiết metanol rễ, dịch chiết nhexan dịch chiết metanol vỏ có hoạt tính kháng oxi hố *) Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định: Dịch chiết diclometan rễ thể khả kháng chủng vi khuẩn kiểm định Gram (+) Lactobacillus fermentum, Bacillus subtilis Staphylococcus aureus Dịch chiết n-hexan rễ thể khả kháng vi khuẩn Gram (+) Staphylococcus aureus 3.3.2 Kết thử hoạt tính sinh học hợp chất mới: LHRn2 LHRm2, LHRm4 *) Hoạt tính gây độc tế bào: Chất 76 (LHRm2) có hoạt tính gây độc với dịng tế bào ung thư thử nghiệm KB, LU, MCF7 HepG2 Chất 78 (LHRm4) khơng thể hoạt tính Điều đáng ý là: Chất 76 78 khác gốc đường β-D-glucose gắn vị trí 5-OH Ở chất 76 gốc 5-OH tự (aglycon), chất 78 gốc 5OH bị glucosid hóa Song khác hoạt tính gây độc tế bào rõ rệt Aglycon ức chế dòng tế bào ung thư thử nghiệm, Glucosid hồn tồn khơng Như sơ kết luận nhóm 5-OH tự đóng vai trị quan trọng cho hoạt tính gây độc tế bào lớp chất *) Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định: Chất 78 (LHRm4) thể khả kháng cách chọn lọc chủng vi khuẩn Gram (+) Staphylococcus aureus Đặc biệt, giới chủng vi khuẩn 20 Gram (+) Staphylococcus aureus kháng lại với hầu hết kháng sinh mạnh sử dụng, chất 78 lại thể hoạt tính kháng sinh chọn lọc loại vi khuẩn Đây kết đáng quan tâm chất gợi ý việc nghiên cứu sâu rộng hoạt tính kháng sinh LHRm4 Chất 76 (LHRm2) khơng thể hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định Nếu so sánh với hoạt tính gây độc tế bào ta thấy chất 76 ngược lại thể hoạt tính với dịng tế bào ung thư thử nghiệm, chất 78 khơng có hoạt tính với dịng Ở có vấn đề lý thú tương quan hoạt tính sinh học cấu trúc phân tử 78 (glucosid) 76 (aglycon), cần tiếp tục nghiên cứu sâu *) Hoạt tính chống oxi hố chất 73: Chất 73 (LHRn2) có cấu trúc phân tử tương đối giống -tocopherol (Vitamin E), hợp chất thiên nhiên có tính chất chống oxy hóa mạnh Sự khác vitamin E chất 73 mạnh nhánh nhóm 6-OH Mạch nhánh chất 73 có chứa nhóm isopropenyl thay nhóm isopropyl vitamin E Nhóm 6-OH vitamin E bị acetyl hóa chất 73 Chúng tơi tiến hành thử hoạt tính kháng oxy hóa chất 73, cho thấy: Chất 73 (LHRn2) khơng có hoạt tính chống oxi hố Như mạch nhánh nhóm 6-OH tự đóng vai trị quan trọng hoạt tính kháng oxy hóa -tocopherol 3.3.3 Kết thử hoạt tính sinh học dịch chiết chất từ rau má *) Hoạt tính gây độc tế bào: Dịch chiết methanol (RM) có hoạt tính ức chế dịng tế bào ung thư thử nghiệm KB (ung thư biểu mô) HepG2 (ung thư gan) Chất 82 (RM1) chất 83 (RM2) có hoạt tính ức chế phát triển dòng tế bào ung thư thử nghiệm KB HepG2 Trong chất 82 (axit asiatic RM1) có hoạt tính tương đối mạnh với IC50= 30,22 32,0 μg/ml 21 *) Hoạt tính chống oxi hố: Dịch chiết metanol RM rau má có hoạt tính chống oxi hố mức độ trung bình (IC50= 88 μg/ml) *) Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định: Dịch chiết metanol (RM) axit madecassic 83 (RM2) có hoạt tính kháng vi khuẩn Gram (+) B subtilis S aureus mức độ yếu Axit asiatic 82 (RM1) có hoạt tính mạnh với loại vi khuẩn Gram (+) L fermentum, B subtilis S aureus (IC50 = 54,37; 17,18 2,197 μg/ml tương ứng) KẾT LUẬN 1./ Về hóa học *) Từ vỏ rễ cọ hạ long (Livistona halongensis), loài phát đặc hữu Vịnh Hạ Long, phân lập 12 hợp chất, có hợp chất lần phân lập từ thiên nhiên là: 6-O-acetyl-2R,8-dimetyl-2-(4R,8R,11-trimetyltridecence12)chroman 73 (tách từ phân đoạn acetyl hóa), 2S,3S-3,5,7,3’tetrahydroxy-5’-metoxyflavan 76 2R,3R-3,7,3’-trihydroxy-5’metoxyflavan 5-O--glucopyranosid 78 Đã tổng hợp dẫn xuất 80 81 từ hai chất Trong số chất trên, có chất lần phân lập từ chi Cọ là: Cyclomusalenon 67, Cycloleucadenon 68, 3β-cyclomusalenol 69, Stigmast-4-en-3-on 70, Stigmasterol 71, β-sitosterol 72 Đây kết thành phần hóa học cọ hạ long *) Từ rau má phân lập chất triterpen chính: Axit asiatic 82 (3,4 g, 0,37% so với trọng lượng khô), axit madecassic 83 (3,95 g, 0,43% so với trọng lượng khô) với hỗn hợp stigmasterol glucosid + β-sitosterol glucosid 84 (0,85 g, 0,096%) 2./ Về hoạt tính sinh học: *) Các dịch chiết hợp chất phân lập từ cọ hạ long: 22 - Dịch chiết diclometan LHRd từ rễ cọ hạ long có hoạt tính ức chế phát triển dòng tế bào ung thư thử nghiệm KB (tế bào ung thư biểu mô), LU ( tế bào ung thư phổi) HepG2 (tế bào ung thư gan) mức đáng quan tâm Đồng thời dịch chiết thể khả kháng chủng vi khuẩn Gram (+) Lactobacillus fermentum, Bacillus subtilis Staphylococcus aureus, với giá trị IC50 12,57; 155,83 56,68 μg/ml tương ứng - Các dịch chiết metanol rễ, vỏ dịch chiết n-hexan vỏ cọ hạ long có hoạt tính kháng oxi hố với giá trị IC50 : 31,47; 76,39 104,0 μg/ml tương ứng - Dịch chiết n-hexan rễ cọ hạ long có hoạt tính kháng vi khuẩn Gram(+) Staphylococcus aureus với giá trị IC50 : 186,75 μg/ml *) Các hợp chất mới: 73, 76 78: - Chất 76 có hoạt tính gây độc với dịng tế bào ung thư thử nghiệm là: KB, LU, MCF7, HepG2 với giá trị IC50 tương ứng 53,0; 68,37; 85; 72,29 g/ml - Chất 78 thể khả kháng chủng vi khuẩn Gram(+) Staphylococcus aureus với giá trị IC50 : 27,76 μg/ml *) Các dịch chiết hợp chất phân lập từ rau má: - Dịch chiết metanol (RM), axit asiatic 82 axit madecassic 83 có hoạt tính ức chế phát triển dòng tế bào ung thư thử nghiệm KB (ung thư biểu mô) HepG2 (ung thư gan) Trong axit asiatic có hoạt tính đáng ý, với IC50 = 30,22 32,0 μg/ml, tương ứng - Dịch chiết metanol (RM) rau má có hoạt tính chống oxi hố mức độ trung bình (IC50= 88 μg/ml) - Dịch chiết metanol (RM) axit madecassic 83 có hoạt tính kháng vi khuẩn Gram (+) B.subtilis S.aureus mức độ yếu (IC50= 103,2 113,35 μg/ml) Axit asiatic 82 có hoạt tính mạnh với loại vi khuẩn Gram(+) L.fermentum, B.subtilis S.aureus, với IC50 = 54,37; 17,18 2,197 μg/ml tương ứng 23 KIẾN NGHỊ - Tiếp tục nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học dịch chiết khác từ cọ hạ long loài cọ khác Việt Nam Đặc biệt phân lập thử hoạt tính chất từ dịch chiết diclometan rễ cọ hạ long (LHRd) dịch chiết chúng có hoạt tính ức chế phát triển dòng tế bào ung thư thử nghiệm KB (tế bào ung thư biểu mô), LU (tế bào ung thư phổi), HepG2 (tế bào ung thư gan) mức độ đáng quan tâm, đồng thời dịch chiết thể khả kháng chủng vi khuẩn Gram (+) với giá trị IC50 khoảng từ 12,57 – 155,83 μg/ml - Tiếp tục nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học dịch chiết n-hexan, CH2Cl2 rau má [Centella asiatica (Linn) Urban.] Việt Nam Tiếp tục thử chức bảo vệ gan dịch chiết chất phân lập - Nghiên cứu tổng hợp dẫn xuất từ tritecpen phân lập từ rau má đồng thời thử hoạt tính sinh học chúng 24 ... góp luận án - Đây lần thành phần hóa học hoạt tính sinh học dịch chiết hợp chất phân lập từ cọ hạ long (Livistona halongensis) nghiên cứu - Đã phân lập xác định cấu trúc 12 hợp chất từ cọ hạ long, ... hoạt tính gây độc tế bào, kháng vi sinh vật kiểm định, kháng oxy hóa dịch chiết số hợp chất phân lập từ cọ hạ long (Livistona halongensis) rau má (Centella asiatica) I.4 Bố cục luận án Luận án. .. Mục tiêu luận án Nghiên cứu, phát chất có cấu trúc hóa học hoạt tính sinh học lý thú từ loài thuộc chi Cọ (Livistona R.Br.), họ Cau (Arecaceae) rau má Việt Nam, cụ thể cọ hạ long rau má Ba Hà