TRƯỜNG ĐẠI HỌC CƠNG NGHIỆP TP.HCM KHOA CƠNG NGHỆ HỐ HỌC TIỂU ḶN MƠN PHÂN TÍCH THỰC PHẨM Đề tài: XÁC ĐỊNH OCHRATOXIN A TRONG NGŨ CỐC BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO GVHD: Ths Nguyễn Đức Vượng SVTH : Võ Thanh Danh Huỳnh Thị Thu Hà Nguyễn Ngọc Tường Vy Thành Phố Hồ Chí Minh tháng - 2011 NỘI DUNG BÁO CÁO TỔNG QUAN VỀ OCHRATOXIN XÁC ĐỊNH OCHRATOXIN A TỔNG QUAN VỀ OCHRATOXIN • Ochratoxin là độc tố vi nấm, tạo từ số loài nấm thuộc giống Aspergillus ochraceus và Penicillium viridicatum Độc tớ nấm mớc thuộc nhóm này gọi là Ochratoxin • Trong sớ các loại ochratoxin, ochratoxin A (OTA) có tính độc cao Ochratoxin A có mặt khắp các loại nông sản thực phẩm: ngũ cốc, thảo dược, bia, cà phê TỔNG QUAN VỀ OCHRATOXIN A • Ochratoxin A gây độc đến gan, thận và có khả gây ung thư cho người Ochratoxin A thể yếu tố gây đột biến Nấm thuộc giớng Aspergillus ochraceus TỔNG QUAN VỀ OCHRATOXIN A Tính chất hóa lý Ochratoxin A - Trọng lượng phân tử: 403.8 - Điểm nóng chảy: 169oC - Phổ hấp thụ UV: đỉnh; 216 – 333 nm - Công thức phân tử: C20H18ClNO6 - Là tinh thể không màu, bền với nhiệt, tan dung môi hữu phân cực như: chloroform, methanol, ethanol ít tan nước và tan pha đệm carbonat loãng Dễ bị phân hủy ánh sáng, môi trường kiềm hoạt chất tẩy rửa TỔNG QUAN VỀ OCHRATOXIN A Công thức phân tử Ochratoxin A XÁC ĐỊNH OCHRATOXIN A PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) LÀM SẠCH BẰNG SILICAGEL TCVN 7595-1:2007 PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) LÀM SẠCH BẰNG BICABONAT TCVN 7595-2:2007 PHƯƠNG PHÁP HPLC LÀM SẠCH BẰNG SILICAGEL Phạm vi áp dụng Nguyên tắc Điều kiện xác định phân tích Quy trình phân tích Tính toán Phạm vi áp dụng • Tiêu chuẩn này qui định phương pháp xác định ochratoxin A với các hàm lượng lớn 0.4 µg/kg các mẫu ngũ cớc, khơ, các hạt có dầu, đậu đỡ, cà phê nguyên liệu… • Phương pháp này thử nghiệm bột mì có chứa hàm lượng ochratoxin A từ 0.4µg/kg đến 1.2µg/kg Ngun tắc Sau axit hóa bằng axit HCl và bổ sung MgCl2 dùng toluene để chiết ochratoxin A (OTA) Làm dịch chiết cột silicagel và xác định OTA bằng sắc ký lỏng hiệu cao cột pha đảo, nhận dạng và sửa đổi bằng detectơ huỳnh quang Điều kiện vận hành HPLC • Pha động: acetonitril (HPLC) : Nước : acid acetic băng = 49:49:2 (thay đổi tỉ lệ cần) • Tớc độ dịng: 1ml/phút • Cột pha tích pha đảo: 250mm x 4.6mm x C18 (5àm) ã Detector : huynh quang 420nm ã V bm: 20àl iu kin ng chun • Dung dịch chuẩn gốc A: cân 20mg vào BĐM 200ml thêm 25 ml dd hỗn hợp (toluen : acid acetic acetic băng = 99 :1 (V+V)), hòa tan mẫu, sau thêm hỡn hợp tới vạch, pha lỗng thích hợp để thu dung dịch 20µg/ml đến 30 µg/ml (dd1) • Dung dịch làm việc: pha lỗng dd1 với dung mơi để nờng độ 4µg/ml Sau lấy 5,10,25,50,100µl cho vào lọ nhỏ, khơ dịng nitơ sau thêm pha động để có nờng độ achratoxin ći cùng 0.5;1;2.5;5;10 ng/25µl Quy trình phân tích 20g Mẫu (m0) ống ly tâm 250ml Ly tâm 50ml dd (V2) + 30 ml HCl mol/L + 50 MgCl2 0.4 mol/L Khuấy Cột chiết pha rắn + 100 ml toluen (V1) Hút ml (V3) Kết HPLC V bơm = 20µl (V4) Bộ lọc màng Tính toán WOTA : tính bằng µg/ Kg m0 : khới lương mẫu thử, tính bằng gam mt : khối lương OTA tương ứng với diện tích pic đọc từ đường chuẩn, tính bằng nanogam F : hệ số pha loãng PHƯƠNG PHÁP HPLC LÀM SẠCH BẰNG BICACBONAT Phạm vi áp dụng Nguyên Tắc Quy trình phân tích Tính toán Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này qui định phương pháp xác định ochratoxin A với các hàm lượng lớn 3µg/kg các mẫu ngũ cớc ngơ hạt, cám, lúa mì… • • Phương pháp này thử nghiệm mẫu ngũ cốc chứa hàm lượng ochratoxin A từ 3.0µg/kg đến 16.3µg/kg Nguyên tắc Ochratoxin A (OTA) chiết khỏi ngũ cớc bằng axit phosphoric pha lỗng clorofoc và tách phân đoạn bằng dung dịch bicacbonat loãng Rửa giải bằng axit etyl axetat-metanol-axetat OTA tách bằng HPLC pha đảo, rồi nhận biết và định lượng bằng detectơ huỳnh quang Điều kiện vận hành HPLC • Pha động: axetonitril : Nước : acid acetic tỉ lệ 49:49:2 (thay đổi tỉ lệ cần) • Tớc độ dịng: 1ml/phút • Cột pha tích pha đảo: 250mm x 4.6mm x C18 (5àm) ã Detector : huynh quang 420nm • V bơm: 20µl Điều kiện đường chuẩn • Dung dịch chuẩn gốc A: cân 20mg vào BĐM 200ml thêm 25 ml dd hỗn hợp (toluen : acid acetic acetic băng = 99 :1 (V+V)), hịa tan mẫu, sau thêm hỡn hợp tới vạch, pha lỗng thích hợp để thu dung dịch 20µg/ml đến 30 µg/ml (dd1) • Dung dịch làm việc: pha loãng dd1 với dung mơi để nờng độ 4µg/ml Sau lấy 5,10,25,50,100µl cho vào lọ nhỏ, khơ dịng nitơ sau thêm pha động để có nờng độ ochratoxin ći cùng 0.5; 1; 2.5; 5; 10 ng/25µl Quy trình phân tích 50g Mẫu (m0) Máy trộn tốc độ cao Nghiền Bộ lọc sợi thủy tinh phủ 10g diatomit + 250 ml clorofom + 25 ml H3PO4 0.1mol/l Mẫu thô Trộn phút +10 g diatomit Kết HPLC 50 ml dịch lọc + 10 ml NaHCO3 30g/l Phễu chiết Cột chiết ml Tính toán WOTA : tính bằng µg/ Kg m0 : khới lương mẫu thử, tính bằng gam mt : khối lương OTA tương ứng với diện tích pic đọc từ đường chuẩn, tính bằng nanogam F : hệ sớ pha lỗng Tài liệu tham khảo - TCVN 7595-1:2007 - TCVN 7595-2:2007 - Ths Phạm Luận, Cơ sờ lý thuyết phân tích sắc ký lỏng hiệu cao, ĐHQGHN, 1999 Cám Ơn Thầy & Các Bạn Lắng Nghe ... TỔNG QUAN VỀ OCHRATOXIN A Công thức phân tử Ochratoxin A XÁC ĐỊNH OCHRATOXIN A PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) LÀM SẠCH BẰNG SILICAGEL TCVN 7595-1:2007 PHƯƠNG PHÁP SẮC... phương pháp xác định ochratoxin A với các hàm lượng lớn 3µg/kg các mẫu ngũ cốc ngô hạt, cám, l? ?a mì… • • Phương pháp này thử nghiệm mẫu ngũ cớc ch? ?a hàm lượng ochratoxin A từ 3.0µg/kg... tắc Ochratoxin A (OTA) chiết khỏi ngũ cớc bằng axit phosphoric pha lỗng clorofoc và tách phân đoạn bằng dung dịch bicacbonat loãng R? ?a giải bằng axit etyl axetat-metanol-axetat OTA tách