trờng Đại học Vinh Tạp chí khoa học, tập XXXVII, số 3A-2008 35 Đa hình điện di isozym esterase trong các loài thuộc chi khoai môn (Colocasia) và chi khoai mùng (Xanthosoma) Nguyễn Bá Hoành (a) Tóm tắt. Trong bài viết này, chúng tôi trình bày mức độ đa hình điện di isozym esterase (EST) trong các loài thuộc chi khoai môn (colocasia) và chi khoai mùng (xanthosoma). Qua đó tìm thấy mối tơng quan giữa đa hình điện di isozym EST và mức bội nhiễm sắc thể cũng nh phân loại các mẫu khoai môn sọ dựa vào đa hình điện di isozym EST. I. mở đầu Khoai môn sọ (colocasia esculenta) là cây trồng lấy củ quan trọng ở nhiều nớc châu á và Thái Bình Dơng. Củ khoai môn sọ chứa hàm lợng hydratcacbon cao, hàm lợng chất béo thấp và có nhiều khoáng chất, đợc sử dụng nh là một loại rau sạch. Cây khoai môn sọ đợc trồng ở khắp mọi nơi, đặc biệt có thể phát triển tốt trên vùng đồi núi. Vì vậy, cây khoai môn sọ rất phù hợp với định hớng phát triển ở vùng trung du và miền núi, góp phần xóa đói giảm nghèo. Tuy nhiên, những nghiên cứu di truyền và chọn giống đối với loài cây trồng này ở nớc ta còn quá ít và chỉ mới đợc bắt đầu trong những năm gần đây. Phân tích isozym bằng kỹ thuật điện di là một phơng pháp hữu ích để đánh giá mức độ giống nhau về mặt di truyền trong các nhóm thực vật, phân biệt nguồn gốc đa bội cũng nh phân biệt dạng lỡng bội và tam bội. Theo Gottlieb (1982) thì số lợng isozym tăng lên thờng quan sát thấy ở các loài thực vật đa bội khác nguồn (allopolyploidy) và phổ isozym có thể giúp ta giải thích đợc vấn đề nguồn gốc đa bội của các loài thực vật. Hirai và cộng sự (1989) cho rằng, có thể phân biệt dạng khoai môn trồng lỡng bội và tam bội bằng một số đặc điểm hình thái kết hợp với phổ điện di các protein dự trữ trong củ. Tanimoto (1986) và Lebot (1991) lại cho rằng, không thể phân biệt hai dạng bội NST này bằng phơng pháp so sánh phổ điện di isozym [1]. Kết hợp giữa kỹ thuật điện di isozym với phân tích hình thái nông học, một số nhà khoa học đã báo cáo về sự đa dạng di truyền trong loài khoai môn sọ và bớc đầu đa ra những kết luận về khả năng sử dụng các kỹ thuật này để phân loại các giống khoai môn sọ (Lebot, 1991; Nguyen, 1998, 1999, 2001, ). II. Vật liệu và phơng pháp nghiên cứu 2.1. Vật liệu nghiên cứu Với tổng cộng 60 mẫu giống thuộc các loài: khoai môn sọ (colocasia esculenta (L.) Schott, 49 mẫu giống), dọc mùng (colocasia gigantea (Bl.) Hook f., 3 mẫu giống), khoai mùng (xanthosoma, 8 mẫu giống) đã đợc thu thập từ một số huyện ở Nghệ An và Thanh Hoá. Các mẫu giống sau đó đợc đem trồng trong vờn thực nghiệm cho đến lúc ra lá non (khoảng 15 ngày) để sử dụng cho phân tích điện di isozym. Nhận bài ngày 15/8/2008. Sửa chữa xong 18/9/2008. Nguyễn Bá Hoành Đa hình điện di isozym esterase , TR. 35-41 36 2.2. Phơng pháp nghiên cứu Hệ enzym EST trong dịch chiết từ mô lá đợc phân tích bằng phơng pháp điện di trên gel polyacrylamide, sử dụng hệ thống máy điện di ATTO - 6500 của Nhật Bản. Lấy mẫu vào sáng sớm, khoảng 50mg mẫu lá đợc nghiền nhỏ trong ống Eppendorf với 200àl dung dịch đệm chiết mẫu 0,5M Tris - HCl, pH 6,8. Nghiền mẫu phải đợc tiến hành trong điều kiện lạnh, có thể thêm một ít cát thủy tinh vào mẫu nghiền để rút ngắn thời gian nghiền mẫu. Dịch nghiền thô đợc ly tâm với tốc độ 6000v/p, ở 4 o C trong 5 phút. Các isozym EST đợc phân ly trong gel polyacrylamide, với gel tách có nồng độ 7,5% và gel cô có nồng độ 4,0%. Quá trình điện di đợc thực hiện trong đệm điện cực 0,025M Tris; 0,192M glycine; pH 8,3 tại nhiệt độ 4 - 8 0 C. Phân tích hoạt tính isozym EST đợc tiến hành trong dung dịch - naphthyl acetate; - naphthyl acetate; Fast Blue RR Salt; aceton; đệm phosphate (pH 6,3). 2.3. Phân tích số liệu Các thí nghiệm đợc lặp lại ít nhất 3 lần độc lập đối với mỗi mẫu. Sự xuất hiện ổn định (1) hay không xuất hiện (0) của mỗi băng trên phổ điện di isozym EST đợc sử dụng nh là một đặc trng để mô tả biến dị của mẫu cây phân tích. Các băng điện di isozym EST còn đợc phát hiện ở độ đậm nhạt của chúng. Sự đa hình các băng điện di isozym EST đợc đánh giá bằng tổng số loại kiểu hình điện di (zymotype) quan sát đợc. Phân tích nhóm UPGMA đã đợc tiến hành để ớc lợng quan hệ giữa các mẫu phân tích. Tất cả các phép tính toán và vẽ sơ đồ hình cây đã đợc xử lý trên máy vi tính sử dụng phần mềm PHYLIP Version 3.6a của Felsenstein (2002). III. Kết quả và thảo luận 3.1. Đa hình điện di isozym esterase (EST) của các mẫu nghiên cứu Đa hình điện di isozym esterase trong các mẫu nghiên cứu đã đợc phát hiện sau điện di khi các gel đợc phân tích hoạt tính enzym trong hỗn hợp dung dịch nhuộm gồm cơ chất đặc hiệu và thuốc nhuộm màu. Vị trí các isozym trên gel quan sát thấy nh là những băng nhuộm màu hồng sẫm. ảnh chụp phổ điện di isozym esterase của dịch chiết từ mô lá non của một số mẫu cây đã phân tích đợc thể hiện ở hình 1. Phân tích phổ điện di đã đợc tiến hành dựa vào cờng độ nhuộm màu và tốc độ di chuyển tơng đối (R f ) về phía cực dơng của các băng isozym. Trên phổ điện di có thể dễ dàng nhận thấy rằng có ít nhất 12 băng isozym esterase có tốc độ di chuyển tơng đối và cờng độ nhuộm màu khác nhau. Sự biến dị đợc xác định dựa vào sự xuất hiện hay không xuất hiện trên gel điện di đồ của mỗi vị trí isozym. Ngoài ra, sự sai khác về hoạt tính của cùng một vị trờng Đại học Vinh Tạp chí khoa học, tập XXXVII, số 3A-2008 37 trí isozym trong các mẫu phân tích cũng đợc quan sát để so sánh biến dị của các cây có bộ NST khác nhau. NL5 NL4 NL3 NL2 NL1 QX3 NL10 NL9 NL8 NL7 NL12 QX2 ĐL1 AS3 QL7 YT4 QH10 AS12 NĐ9 QL1 CC9 NĐ3 QH7 QH2 Một số kiểu hình điện di isozym esterase trong các loài colocasia và xanthosoma đợc minh hoạ trong hình 2. Băng R f 1 0,91 2 0,88 3 0,86 4 0,83 5 0,81 6 0,78 7 0,72 8 0,68 9 0,65 10 0,58 11 0,50 12 0,45 C. e C. g Xa Hình 2. Sơ đồ minh hoạ một số kiểu hình điện di isozym esterase trong các cây colocasia esculenta (c.e), colocasia gigantea (c. g) và xanthosoma (xa) Băng di chuyển nhanh nhất (R f = 0,91) quan sát thấy trong tất cả các cây khoai mùng xanthosoma nhng không quan sát thấy trong các cây khoai môn sọ colocasia. (+) (-) Hình 1 . Điện di đồ isozym esterase của một số mẫu nghiên cứu ( - ) (+) Nguyễn Bá Hoành Đa hình điện di isozym esterase , TR. 35-41 38 Sự biến dị quan sát thấy trên điện di đồ ở vùng isozym gồm 6 băng di chuyển nhanh (vùng hoạt tính gần về phía cực dơng) trong phổ điện di các cây colocasia với 5 kiểu hình: hai kiểu hình 2 băng có tốc độ di chuyển tơng đối là R f = (0,88, 0,86) và R f = (0,83, 0,81), một kiểu hình 3 băng (0,88, 0,86, 0,81), một kiểu hình 4 băng (0,88, 0,86, 0,83, 0,81) và một kiểu hình 5 băng (0,88, 0,86, 0,83, 0,81, 0,78). Tuy nhiên, ở các cây C. gigantea thì chỉ thấy xuất hiện các băng R f = 0,88 trong vùng này. Sự biến dị quan sát thấy ở vùng giữa của phổ điện di các cây C.esculenta (gồm 4 băng isozym di chuyển tơng đối nhanh) với 5 kiểu hình điện di: một kiểu hình điện di 1 băng có tốc độ di chuyển tơng đối là R f = 0,72; một kiểu hình 2 băng (0,72, 0,68); hai kiểu hình 3 băng (0,72, 0,68, 0,65) và (0,72, 0,65, 0,58); một kiểu hình gồm tất cả 4 băng ở vùng này. Băng điện di các cây C. gigantea đơn giản hơn, chỉ có 2 băng ở vùng này và biến dị trong các cây C. gigantea không phát hiện thấy. Vùng này cũng quan sát thấy ít biến dị trong các cây khoai mùng (xanthosoma). Có ít nhất 2 băng điện di isozym quan sát thấy ở vùng di chuyển chậm của các isozym (về phía cực âm) trong một số cây khoai sọ tam bội. Biến dị cũng quan sát thấy ở vùng này. Theo Nguyen và cộng sự (1998), có ít nhất 4 locus esterase ở loài khoai môn lỡng bội (c. esculenta) trong đó có 3 enzym có cấu trúc monome và một enzym có cấu trúc dime. Kết quả quan sát thấy trong nghiên cứu này là tơng tự với kết quả các nghiên cứu trớc [2], [3], [4], [5]. Các băng isozym xuất hiện ở vùng di chuyển nhanh là phù hợp với kiểu hình điện di do một locus gen gồm hai alen quy định. Các băng isozym xuất hiện ở vùng giữa là phù hợp với kiểu hình điện di do một locus gen gồm 3 alen quy định. Tuy nhiên, số kiểu hình tại vùng này không biểu hiện đầy đủ nh so với các báo cáo trớc (Nguyen và CS. (1998), Huỳnh Thị Mỹ Linh (2003), Trong nghiên cứu này, chỉ có 5 kiểu hình (mà không phải 6 hay 8 kiểu hình tại vùng này) đã đợc phát hiện. Trong khi đó, kiểu hình 3 băng (0,72, 0,65, 0,58) chiếm đa số các mẫu cây phân tích. Với 17 kiểu hình điện di đợc quan sát trong tổng số 49 mẫu giống khoai môn sọ (c. esculenta) cho thấy mức độ đa hình isozym EST là khá cao. Tất cả các cây dọc mùng (C. gigantea) thuộc cùng một kiểu hình điện di, các cây khoai mùng (xanthosoma) thuộc vào 3 kiểu hình điện di. 3.2. Đa hình điện di isozym esterase và vấn đề phân loại các mẫu giống khoai môn sọ ở Nghệ An và Thanh Hoá Dựa vào số liệu điện di đã phân tích với sự xuất hiện băng (1) và không xuất hiện băng (0), ma trận tơng đồng di truyền (60x12) đã đợc thiết lập và khoảng cách di truyền giữa các cặp mẫu phân tích đã đợc tính toán để phân nhóm mẫu cây. Phân tích UPGMA dựa trên ma trận tơng đồng đã đợc tiến hành. Kết quả thu đợc biểu hiện trên biểu đồ hình cây ở hình 3. tr−êng §¹i häc Vinh T¹p chÝ khoa häc, tËp XXXVII, sè 3A-2008 39 ∆ ◊ QH10 ∆ ◊ QX3 ∆ ◊ NC8 ○ ◊ QL2 ○ ◊ QL3 ○ ◊ QL7 ○ ◊ QL8 ○ ◊ NĐ9 ○ ◊ QH3 ○ ◊ QH5 ○ ◊ NL1 ○ ◊ QL10 ○ ● NL7 ○ ● AS11 ○ ◊ NC5 ○ ◊ YT5 ○ ● CC9 ○ ◊ QX2 ○ ◊ NC1 ○ ● NC7 ○ ◊ QL9 ○ ◊ NĐ5 ○ ◊ QH2 ○ ◊ QL11 ○ ◊ NĐ3 ○ ◊ QH4 ○ ◊ QH7 ○ ◊ QH9 ○ ◊ AS6 ○ ◊ ĐL1 ○ ◊ YT4 ○ ◊ YT6 ○ ● QL1 ○ ◊ ĐL3 ○ ◊ NL9 ○ ◊ ĐL2 ○ ◊ NC6 ○ ◊ QH11 ○ ◊ NL6 ○ ◊ NC2 ○ ◊ NL3 ○ ◊ NL8 ○ ◊ NL11 ○ ◊ QL4 ○ ● NL12 ○ ◊ QL5 ○ ● CC7 ○ ◊ NC4 ○ ◊ NL5 ○ ● NL10 ○ ● CC1 ○ ◊ CC3 ■ NĐ6 ■ YT1 ■ AS3 ■ AS12 ■ NL4 ■ NL2 ■ AS5 ■ NĐ2 ○ C. esculenta ∆ C. gigantea ■ Xanthosoma ◊ 2n=2x=28 ● 2n=3x=42 H×nh 3. BiÓu ®å h×nh c©y thu ®−îc b»ng ph©n tÝch UPGMA dùa trªn sè liÖu isozym esterase c¸c loµi colocasia vµ xanthosoma Nguyễn Bá Hoành Đa hình điện di isozym esterase , TR. 35-41 40 Kết quả phân nhóm trên biểu đồ hình cây cho thấy: Tất cả các cây khoai mùng (xanthosoma) đợc xếp trong một nhóm lớn, tất cả các cây dọc mùng (c.gigantea) đã hình thành một nhóm riêng. Tất cả các cây colocasia esculenta nằm trong nhóm lớn nhất. Kết quả này là phù hợp với các phân loại ở mức loài hiện nay dựa trên đặc điểm hình thái và kết quả phân nhóm dựa trên số liệu đa hình protein dự trữ trong củ. Các cây phân tích điện di trong loài khoai môn sọ (C. esculenta) đã đợc xếp trong 5 nhóm hình thành nên nhóm lớn của loài C. esculenta. Trong các nhóm thuộc colocasia esculenta, các mẫu giống cây khoai mán (vàng từng) phân bố ở 4 trong 5 nhóm nhỏ cho thấy mức độ đa hình biểu hiện ở sai khác kiểu hình điện di là khá lớn. Trong các nhóm này, hầu hết các mẫu cây có vùng thu thập gần nhau đợc xếp trong cùng nhóm. Hai mẫu cây mang kí hiệu CC1 (khoai ấp) và CC3 (sáp vàng) thu ở Con Cuông (Nghệ An) đã hình thành một nhóm nhỏ có sai khác di truyền lớn hơn so với các nhóm còn lại, mặc dầu 2 mẫu cây này có mức bội nhiễm sắc thể khác nhau. Tơng tự nh vậy, mẫu cây NL3 và NL8 (khoai mán) ở Ngọc Lặc - Thanh Hóa hình thành nhóm nhỏ độc lập, trong khi đó các mẫu cây khác thu từ Ngọc Lặc đợc ghép nhóm chung với các mẫu cây Khoai sọ của các vùng gần nhau. Rất có thể, đây là những mẫu cây đặc trng vùng đối với Nghệ An và Thanh Hóa, cần có kế hoạch bảo tồn tại chổ để nghiên cứu tiếp. Biểu đồ hình cây cho thấy trong 5 nhóm của các giống thuộc C. esculenta thì dạng khoai môn sọ tam bội phát hiện thấy ở 3 trong 5 nhóm. Trong nhóm còn lại (NL3 và NL8), (NL11 và QL4) đều là những cây lỡng bội. Kết quả này phán đoán một sự tơng tự về kiểu hình điện di của các khoai sọ tam bội với các cây khoai sọ lỡng bội thuộc cùng nhóm. Theo báo cáo của Gottlied (1992) thì cây khoai môn sọ tam bội có kiểu hình điện di phức tạp hơn các cây lỡng bội, phán đoán nguồn gốc sai khác giữa các dạng lỡng bội đã tạo ra dạng đa bội khác nguồn. Cây tam bội có cùng kiểu hình điện di với cây lỡng bội phán đoán nguồn gốc tự đa bội của các cây thuộc nhóm này. Kết quả thu đợc trong nghiên cứu này cũng tơng tự với báo cáo trớc về sự đa dạng di truyền và nguồn gốc các Khoai môn sọ tam bội ở nớc ta (Huỳnh Thị Mỹ Linh (2002), Trơng Thị Thanh Mai (2003),) IV. Kết luận Đa hình điện di isozym esterase trong loài colocasia esculenta là tơng đối cao với 17 kiểu hình điện di trong tổng số 49 mẫu giống. Tất cả các cây dọc mùng (C. gigantea) thuộc cùng một kiểu hình điện di, các cây khoai mùng (xanthosoma) thuộc vào 3 kiểu hình điện di. Mối tơng quan nhất định đã đợc tìm thấy giữa đa hình điện di isozym EST với mức bội nhiễm sắc thể. Sự giống nhau về kiểu hình điện di isozym EST của khoai môn lỡng bội (2n=2x=28) với khoai môn tam bội (2n=3x=42) phán đoán nguồn gốc tự đa bội của một số giống khoai môn tam bội từ dạng lỡng bội trong loài. trờng Đại học Vinh Tạp chí khoa học, tập XXXVII, số 3A-2008 41 Tài liệu tham khảo [1] Lebot, V., K. M. Aradhya, Isozyme variation in taro (colocasia esculenta (L.) Schott) from Asia and Oceania, Euphytica 56 (1), 1991, pp. 55-66. [2] Nguyen, V. X., Isozyme variation and phylogenetic relationships in taro, colocasia esculenta (L.) Schott, and related taxa, Ph. D. Thesis, the Okayama University, Japan, 1998 [3] Nguyen, V. X., H. Yoshino, M. Tahara, Genetic control of four enzymes in diploid taro, colocasia esculenta (L.) Schott, Breeding Science 48 (3), 1998, pp. 273-280. [4] Nguyen, V. X., H. Yoshino, M. Tahara, Phylogenetic analyses of taro (colocasia esculenta (L.) Schott) and related species based on Esterase isozymes, The Scientific Reports of the Faculty of Agriculture, Okayama University, Vol. 87, 1998, pp. 133-139. [5] Nguyen, V. X., H. Yoshino, M. Tahara, Genetic analysis of 12 polymorphic isozyme loci in taro, colocasia esculenta (L.) Schott, Breeding Science, Sept. 49(3), 1999, pp. 179-185. [6] Nguyễn Xuân Viết, Biến di isozym và mối quan hệ giữa các dạng bội NST ở loài khoai môn, colocasia esculenta (L.) Schott, Tạp chí Khoa học, Trờng ĐHSP Hà Nội, Số 1, 2002, tr.114-121. [7] Ochiai, T., V. X Nguyen, M. Tahara, H. Yoshino, Geographical differentiation of Asian taro, colocasia esculenta (L.) Schott, detected by RAPD and isozyme analyses, Euphytica 122 (2), 2001, pp. 219-234. Summary Electrophoretic polymorphism of esterase isozymes of some species of the genus Colocasia and the genus xanthosoma In this paper we mentioned the electrophoretic poly morphism of esterase isozymes of species of the genus colocasia and xanthosoma. And then we showed the relationships between EST and surchrosome of colocasia basing on EST. (a) Khoa Sinh học, Trờng Đại học Vinh. . mùng (C. gigantea) thuộc cùng một kiểu hình điện di, các cây khoai mùng (xanthosoma) thuộc vào 3 kiểu hình điện di. 3.2. Đa hình điện di isozym esterase và vấn đề phân loại các mẫu giống khoai. Hoành (a) Tóm tắt. Trong bài viết này, chúng tôi trình bày mức độ đa hình điện di isozym esterase (EST) trong các loài thuộc chi khoai môn (colocasia) và chi khoai mùng (xanthosoma). Qua. trờng Đại học Vinh Tạp chí khoa học, tập XXXVII, số 3A-2008 35 Đa hình điện di isozym esterase trong các loài thuộc chi khoai môn (Colocasia) và chi khoai mùng (Xanthosoma) Nguyễn