BÁO CÁO TỐT NGHIỆP Đề tài Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ S/V tới khả năng tạo màng BC từ vi khuẩn Acetobacter xylinum BHN2 MỤC LỤC BÁO CÁO TỐT NGHIỆP 1 Đề tài 1 Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ S/V tới khả năng tạo màng BC từ vi khuẩn Acetobacter xylinum BHN2 1 MỤC LỤC 2 KẾT LUẬN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHẦN MỞ ĐẦU 1. LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI Màng sinh học ( Bacterial cellulose; Biocellulose; BC) có cấu trúc và đặc tính rất giống với cellulose của thực vật (gồm các phân tử glucose liên kết với nhau bằng liên kết β-1,4 glucorit) cellulose vi khuẩn khác với cellulose thực vật ở chỗ: không chứa các hợp chất cao phân tử như: ligin, hemicellulose, peptin và sáp nến…do vậy chúng có những đặc tính vượt trội với độ dẻo dai, bề chắc.[17] Trên thế giới màng Bacterial cellulose đã được ứng dụng rất nhiều trong các lĩnh vực công nghệ khác nhau: như dùng làm màng phân tách cho quá trình xử lí nước, chất mang đặc biệt cho các pin và năng lượng cho tế bào,dùng làm chất biến đổi độ nhớt trong sản xuất các sợi truyền quang, làm môi trường cơ chất trong sinh học, thực phẩm hay thay thế thực phẩm. Đặc biệt trong lĩnh vực y học, màng BC đã được ứng dụng làm da tạm thời thay thế da trong quá trình điều trị bỏng, loét da, làm mạch máu nhân tạo điếu trị các bệnh tim mạch; làm mặt nạ dưỡng da cho con người.[13] Ở Việt Nam, việc nghiên cứu và ứng dụng màng BC còn ở mức độ khiêm tốn, các nghiên cứu ứng dụng mới chỉ dừng lại bước đầu nghiên cứu. Các kết quả ứng dụng của màng BC hầu như mới chỉ dừng lại ở điều kiện thí nghiệm. Trong những năm gần đây phòng thí nghiệm Thực vật - Vi sinh Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 phân lập tuyển chọn được chủng A. xylinum BHN 2 có khả năng tạo màng BC và những nghiên cứu bước đầu cho thấy màng BC từ chủng A. xylinum BHN 2 có khả năng ứng dụng cho trị bỏng cho thỏ là cơ sở để tạo ra màng trị bỏng cho người. Với mục đích tìm hiểu diện tích và thể tích liên quan đến độ thoáng khí trong quá trình tạo màng BC trong điều kiện nuôi tĩnh chúng tôi chọn đề tài: “ Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ S/V tới khả năng tạo màng BC từ vi khuẩn Acetobacter xylinum BHN 2 ” 2. Mục tiêu và ý nghĩa khoa học của đề tài - Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ S/V tới khả năng tạo màng BC từ vi khuẩn A. xylinum BHN 2 phân lập từ nguồn nguyên liệu từ phòng thí nghiệm. - Khảo sát khả năng tạo màng BC của vi khuẩn A. xylinum BHN 2 . - Bổ sung thêm các kiến thức về vi khuẩn A.xylinum nhằm ứng dụng tạo màng BC được tốt nhất. 3. Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ S/V tới khả năng tạo màng của vi khuẩn A. xylinum BHN 2 . - Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến tỷ lệ S/V thích hợp nhất đến khả năng tạo màng BC của chủng A. xylinum BHN 2 . - Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến tỷ lệ S/V thích hợp nhất đến khả năng tạo màng BC của chủng A. xylinum BHN 2 . - Nghiên cứu một số tính chất vật lý của màng BC được tạo ra từ chủng A. xylinum BHN 2 từ đó định hướng cho ứng dụng trong trị bỏng. PHẦN NỘI DUNG CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Đại cương về vi khuẩn A. Xylinum và màng BC 1.1.1. Phân loại và đặc điểm hình thái của A. Xylinum Theo hệ thống phân loại của nhà khoa học Bergey thì A.xylinum thuộc giống Acetobacter, họ Pseudomonadaceae, bộ Pseudomonadales, lớp Schizommycetes. Việc phân loại vi khuẩn này còn nhiều tranh cãi, có một số tác giả coi A. xylinum như một loài phụ của A. Aceti.[21] A. xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, có thể di động hay không di động, không sinh bào tử. Chúng là vi khuẩn Gram âm, nhưng đặc điểm nhuộm Gram có thể thay đổi do tế bào già đi hay do điều kiện môi trường. Chúng có thể đứng riêng lẻ hay xếp thành chuỗi. Hình 1: Kết quả nhuộm Gram của A. xylinum BHN 2 Khuẩn lạc của A.xylinum có kích thước lớn (đường kính khuẩn lạc đạt 2-5mm), tròn, bề mặt nhầy và trơn bóng, phần giữa khuẩn lạc lồi lên, dày hơn và sẫm màu hơn các phần xung quanh, rìa mép khuẩn lạc nhẵn.[18] 1.1.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của A. Xylinum Vi khuẩn A. xylinum phát triển ở nhiệt độ 25-35 0 C, pH = 4-6. Nhiệt độ và pH tối ưu tùy thuộc vào giống. Ở 37 0 C, tế bào sẽ suy thoái hoàn toàn ngay cả trong môi trường tối ưu. A. xylinum có khả năng chịu được pH thấp, vì thế thường bổ sung thêm acid acetic vào môi trường nuôi cấy để hạn chế sự nhiễm khuẩn lạ.[12] Các đặc điểm sinh hoá dùng định danh của A. xylinum bao gồm: Oxy hoá ethanol thành acid acetic, CO 2 , H 2 O; Phản ứng catalase dương tính; Không tăng trưởng trên môi trường Hoyer; Chuyển hoá glucose thành acid; Chuyển hoá glycerol thành dihydroxyaceton; Không sinh sắc tố nâu; Tổng hợp cellulose.[12] 1.1.3. Màng BC của vi khuẩn A. xylinum Trên môi trường dịch thể, trong điều kiện nuôi cấy tĩnh, vi khuẩn A. xylinum hình thành nên một lớp màng có bản chất là cellulose, được tập hợp bởi những bó sợi cellulose liên kết với nhau được gọi là màng Bacterial cellulose hay màng BC. * Cấu trúc của màng Bacterial cellulose: Cellulose được cấu tạo bởi chuỗi polyme β -1,4 glucopynanose mạch thẳng. Có thành phần hoá học đồng nhất với cellulose thực vật, nhưng cấu trúc và đặc tính lại khác xa nhau. Chuỗi polyme β -1,4 glucopynanose mới hình thành liên kết với nhau tạo thành sợi nhỏ (subfibril) có kích thước 1,5nm. Những sợi nhỏ kết tinh tạo sợi lớn hơn- sợi vĩ mô ( microfibril) ( Tonas and Farah, 1998), những sợi này kết hợp với nhau tạo thành bó và cuối cùng tạo dải ribbon (Yamanaka et.al 2000). Dải ribbon có chiều dài trong khoảng từ 1-9nm. Những dải ribbon được kéo ra từ tế bào này sẽ liên kết với những dải ribbon của tế bào khác bằng liên kết hiđro hoặc lực vandesvan tạo thành cấu trúc mạng lưới hay một lớp màng mỏng trên bề mặt môi trường nuôi cấy.[15] Do dải ribbon của màng BC có đường kính nhỏ hơn của PC, chỉ số kết tinh cao (khoảng 60%), độ polyme hoá lớn nên màng BC có độ bền cơ học cao, khả năng hấp thụ nước lớn. Bacterial cellulose sản xuất bởi vi khuẩn A. xylinum được nghiên cứu đầu tiên bởi Brown năm 1886. Nó đã thu hút sự chú ý từ nửa sau của thế kỷ XX, những nghiên cứu tập trung sâu vào cơ chế tổng hợp, cũng như cấu trúc và đặc tính của cellulose.[22] 1.2. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tạo màng BC từ vi khuẩn A.xylinum 1.2.1.Ảnh hưởng hàm lượng glucose Nguồn cacbon có ảnh hưởng mạnh mẽ tới sinh trưởng cũng như tổng hợp cellulose của Acetobacter xylinum. Theo kết quả nghiên cứu của Thạc sỹ Nguyễn Thị Nguyệt trên chủng Acetobacter xylinum HN5 thì nguồn cacbon có ảnh hưởng lớn nhất đến sự hình thành màng của Acetobacter xylinum là glucose. Để tạo màng phục vụ mục đích nghiên cứu, Thạc sỹ Trần Như Quỳnh đã quyết định sử dụng hàm lượng glucose 20 g/l cho các nghiên cứu trên chủng A. xylinum BHN 2 .[14] 1.2.2. Ảnh hưởng của hàm lượng (NH 4 ) 2 SO 4 Vi sinh vật và tất cả các cơ thể sống khác đều cần nitơ trong quá trình sống để xây dựng tế bào. Nhân tố (NH 4 ) 2 SO 4 là một trong những nhân tố có ảnh hưởng lớn đến sự phát triển của Acetobacter xylinum, là nhân tố quan trọng cung cấp nguồn nitơ cho tế bào phát triển. Vì vậy, nếu nguồn nitơ trong môi trường quá ít sẽ ảnh hưởng đến hoạt động sống của tế bào, từ đó ảnh hưởng đến quá trình tạo màng BC. Ở nồng độ 2,0 g/l môi trường cho hiệu suất màng BC cao nhất.[14] 1.2.3. Ảnh hưởng của hàm lượng MgSO 4 .7H 2 O MgSO 4 ở nồng độ 2 g/l cho sản lượng BC cao nhất, theo PGS-TS Đinh Thị Kim Nhung, magie là nhân tố tham gia vào việc tạo thành các enzim, những enzim này xúc tác cho các phản ứng chuyển hóa các chất trong quá trình hình thành màng BC.[14] 1.2.4. Ảnh hưởng của hàm lượng KH 2 PO 4 Phospho ngoài vai trò tham gia cấu trúc các thành phần của tế bào, nó còn có vai trò hết sức quan trọng trong tổng hợp cellulose ở vi khuẩn Acetobacter xylinum ( Ross et.al, 1991). Sử dụng nồng độ 2g/l KH 2 PO 4 sẽ cho sản lượng BC cao nhất.[14] 1.3. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng tạo màng BC từ vi khuẩn A.xylinum 1.3.1. Ảnh hưởng của thời gian lên men và hàm lượng giống. Lượng giống và thời gian nuôi cấy là 2 yếu tố quan trọng ảnh hưởng trong quá trình lên men cellulose vi khuẩn. Độ dai của màng phụ thuộc rất nhiều vào sự kết tinh của màng BC, độ kết tinh của màng lại chịu ảnh hưởng lớn về thời gian lên men thu nhận màng. Vì nếu thu sớm độ polymer hoá và kết tinh chưa cao sẽ ảnh hưởng đến tính chất cơ học của màng BC. Ngược lại nếu để lâu trong môi trường nghèo dinh dưỡng màng chìm xuống, vi khuẩn sẽ tiến hành phân huỷ thu năng lượng cung cấp cho hoạt động sống của tế bào. Đối với loài Actobacte xylinum, trong quá trình lên men, phần lơn các tế bào liên kết với phân tử glucose để hình thành lớp màng BC trên bề mặt nuôi cấy. Lớp màng này ngăn cản sự tiếp xúc của oxy với môi trường dich thể. Vì vậy việc nghiên cứu xác định được lượng giống bổ sung ban đầu cho phù hợp có ý nghĩa quan trọng để thu được màng BC với năng suất cao nhất. Sản lượng cellulose thu được trong quá trình lên men đều tăng theo tỷ lệ giống và thời gian lên men.[14] 1.3.2. Độ thông khí Vi khuẩn A. xylinum là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc. Điều kiện tiên quyết khi lên men tạo sinh khối là điều kiện thông khí. Trong cơ chế của quá trình lên men, lượng oxy cần cung cấp là tương đối lớn. Trong thực tế độ thông khí quyết định năng suất BC. Vì vậy hình thức sục khí cung cấp oxy và sử dụng cánh khuấy trong lên men động là phù hợp cho sản lượng BC cao trong lên men chìm. Lên men tĩnh cần sử dụng dụng cụ có bề mặt rộng, thoáng và lớp môi trường mỏng.[19] Wanatabe và Yamanaka (1995) phát hiện ra áp suất oxy cũng ảnh hưởng đến khả năng hình thành cellulose vi khuẩn. Cellulose hình thành dưới áp suất oxy thấp có sự phân nhánh nhiều hơn so với trong điều kiện áp suất oxy cao. Do đó ảnh hưởng trực tiếp đến hình dạng và độ chịu lực của lớp màng BC.[20] 1.3.3. Nhiệt độ Nhiệt độ thích hợp với vi khuẩn A. xylinum từ 25-30 0 C. Ở nhiệt độ thấp quá trình lên men xảy ra chậm. Ở nhiệt độ cao sẽ ức chế hoạt động và đến mức nào đó sẽ đình chỉ sự sinh sản của tế bào và hiệu suất lên men sẽ giảm. [21] 1.3.4. Độ PH Vi khuẩn A. xylinum phát triển thuận lợi trên môi trường có pH thấp. Do đó trong môi trường nuôi cấy cần bổ sung thêm acid acetic nhằm acid hoá môi trường. Đồng thời acid acetic còn có tác dụng sát khuẩn, giúp ngăn chặn sự phát triển của vi sinh vật có hại.[21] 1.4. Ứng dụng của màng BC 1.4.1. Ứng dụng của BC trong một số lĩnh vực [...]... những yếu tố ảnh hưởng rõ rệt đến khả năng tạo màng BC từ vi khuẩn A xylinum BHN 2 Với sự khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy với tỷ lệ S/V= 0,8 đến khả năng tạo màng BC tốt nhất của chủng A .xylinum BHN 2 chúng tôi thu được kết quả thể hiện ở bảng 3.3: Bảng 3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy với tỷ lệ S/V= 0,8 đến khả năng tạo màng BC tốt nhất từ chủng A xylinum BHN 2 Nhiệt độ (0C) 20 25... tạo màng BC từ vi khuẩn A .xylinum BHN 2 ở nhiệt độ 300C là tốt nhất PHẦN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 1 Kết luận - Nghiên cứu được tỷ lệ diện tích bề mặt trên thể tích dịch lên men từ chủng A xylinum BHN 2 tạo màng BC tốt nhất là S/V= 0,8 - Nghiên cứu được ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy với tỷ lệ S/V= 0,8 đến khả năng tạo màng BC tốt nhất của chủng A xylinum BHN 2 là 6 ngày - Nghiên cứu được ảnh hưởng của nhiệt... Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến tỷ lệ S/V thích hợp nhất đến khả năng tạo màng BC từ chủng A xylinum BHN 2 Tiến hành thí nghiệm nghiên cứu nhiệt độ từ 20-400C đến tỷ lệ S/V thích hợp nhất đến khả năng tạo màng BC từ chủng A xylinum BHN 2 theo các tiêu chí: thời gian xuất hiện màng, màu sắc, độ nhẵn, độ dày, độ dai, cân nặng, trọng lượng khô từ đó tìm nhiệt độ thích hợp tạo màng BC tốt... trên môi trường thạch nghiêng mỗi tháng một lần.[4] 2.2.4 Phương pháp nghiên cứu tỷ lệ S/V đến khả năng tạo màng BC từ chủng A xylinum BHN 2 2.2.4.1 Phương pháp nghiên cứu tìm tỷ lệ S/V đến khả năng tạo màng BC tốt nhất từ chủng A xylinum BHN 2 S: diện tích bề mặt lên men tạo màng BC (cm2) V: thể tích dịch lên men tạo màng ( cm3) Với phương pháp cố định diện tích bề mặt lên men tạo màng, thay đổi thể... Phương pháp nghiên cứu thời gian đến tỷ lệ S/V thích hợp nhất đến khả năng tạo màng BC từ chủng A xylinum BHN 2 Tiến hành thí nghiệm nghiên cứu thời gian từ 1-7 ngày đến tỷ lệ S/V thích hợp nhất đến khả năng tạo màng BC từ chủng A xylinum BHN 2 theo các tiêu chí: thời gian xuất hiện màng, màu sắc, độ nhẵn, độ dày, độ dai, cân nặng, trọng lượng khô từ đó tìm thời gian thích hợp tạo màng BC tốt nhất... giữa S/V với độ bền kéo màng Độ bền kéo của màng (N) S/V Từ bảng 3.1 và biểu đồ 3.1.1 và 3.1.2 tôi thấy khả năng hình thành màng tốt nhất ở tỷ lệ S/V = 0,8 với chiều cao môi trường trong dụng cụ lên men h =1,25 cm Với tỷ lệ S/V thấp hơn hoặc lớn hơn 0,8 độ kết tinh của màng không cao, màng dễ bị rách khả năng chịu lực kéo kém hơn 3.2 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng tạo màng BC tốt nhất của. .. chủng A .xylinum BHN 2 với các tiêu chí: thời gian xuất hiện màng, màu sắc, độ nhẵn, độ dày, độ dai, cân nặng, trọng lượng khô tuyệt đối để tìm S/V thích hợp tạo màng BC tốt nhất, chúng tôi thu được kết quả thể hiện ở bảng 3.1 như sau: Bảng 3.1 Nghiên cứu tỉ lệ S/V đến khả năng tạo màng BC tốt nhất từ vi khuẩn A xylinum BHN 2 (Ảnh hưởng tỷ lệ diện tích bề mặt và thể tích lên men) Tỷ lệ Đặc điểm màng Thời... bình của các lần lặp lại thí nghiệm X= 1 n ∑ Xi n i =1 n * Trung bình bình phương các sai lệch * Sai số đại diện của trung bình cộng * Hệ số biến thiên trung bình cộng: δ= ±m = ∑(X i =1 i − X )2 n −1 δ n Cv = δx100 X CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Ảnh hưởng của các tỷ lệ S/V tới khả năng tạo màng của vi khuẩn A xylinum BHN 2 Sau một thời gian nghiên cứu lên men bề mặt tạo màng BC từ chủng... tuyển chọn và khảo sát sơ bộ về chủng A .xylinum BHN 2 có khả năng tổng hợp cellulose Để sản phẩm có thể ứng dụng vào thực tiễn chúng tôi đề nghị: - Khi lên men tạo màng BC cần lên men ở nhiệt độ 30 0C, thời gian thu nhận màng tốt nhất là 6 ngày với tỷ lệ S/V= 0,8 - Tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy khác đến tỷ lệ S/V thích hợp nhất đến khả năng tạo màng BC TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu... nuôi cấy với tỷ lệ S/V= 0,8 đến khả năng tạo màng BC tốt nhất của chủng A xylinum BHN 2 là 300C - Nghiên cứu được một số tính chất vật lý của màng BC được tạo ra từ chủng A xylinum BHN 2 là màng có độ dày 2-3mm với màu trắng trong, bề mặt nhẵn mịn, dai đáp ứng yêu cầu về độ chịu lực của màng trị bỏng Từ đó định hướng cho ứng dụng trong trị bỏng 2 Đề nghị Trên đây là những kết quả nghiên cứu bước đầu . NGHIỆP Đề tài Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ S/V tới khả năng tạo màng BC từ vi khuẩn Acetobacter xylinum BHN2 MỤC LỤC BÁO CÁO TỐT NGHIỆP 1 Đề tài 1 Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ S/V tới khả. Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ S/V tới khả năng tạo màng BC từ vi khuẩn Acetobacter xylinum BHN 2 ” 2. Mục tiêu và ý nghĩa khoa học của đề tài - Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ S/V tới khả năng. về vi khuẩn A .xylinum nhằm ứng dụng tạo màng BC được tốt nhất. 3. Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ S/V tới khả năng tạo màng của vi khuẩn A. xylinum BHN 2 . - Nghiên cứu ảnh