Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ i VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT  NGUYỄN ĐÌNH LUYỆN PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ BƢỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ SỬ DỤNG CHẾ PHẨM NẤM VÙNG RỄ TRÊN MỘT SỐ CÂY NÔNG NGHIỆP LUẬN VĂN THẠC SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌC  Hà nội, 2013 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ LỜI CẢM ƠN Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Lê Mai Hương đã tận tình chỉ bảo, hướng cho tôi những phương pháp luận hết sức căn bản nhưng vô cùng giá trị để tôi có những định hướng cho luận văn của mình. Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Trần Thị Như Hằng chủ nhiệm đề tài nghị định thư Việt nam – Hungary đã tạo điều kiện cho tôi được đi đào tạo tại nước ngoài giúp tôi nâng cao kiến thức cũng như nội dung của luận văn được tốt hơn. Tôi xin cảm ơn GS. Katalin. Posta và cộng sự.,trường Đại học quốc tế Szen Isvam, Cộng hòa Hungary. Đã giúp đỡ tôi học các kỹ thuật về phân lập bằng sinh học phân tử để hoàn thành kết quả luận văn. Tôi xin cảm ơn các anh chị, bạn bè đồng nghiệp tại phòng sinh học thực nghiệm và Viện Hóa học các hợp chất Thiên nhiên đã tạo điều kiện về công việc, thời gian giúp tôi hoàn thành luận văn. Tôi xin cảm ơn Lãnh đạo Viện sinh thái và Tài nguyên sinh vật, phòng đào tạo và các thầy cô giáo tại cơ sở đào tạo sau đại học Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật đã luôn quan tâm giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập tại Viện. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã luôn động viên, khuyến khích để tôi hoàn thành luận văn này./. Hà nội, ngày tháng năm 2013 Tác giả luận văn Nguyễn Đình Luyện Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của tôi và tập thể phòng sinh học thực nghiệm. Các số liệu đƣợc sử dụng tham khảo có nguồn gốc trích dẫn rõ ràng, các kết quả trong luận văn là hoàn toàn trung thực. Nguyễn Đình Luyện Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Al Nhôm AM Arbuscular mycorrhizza CĐTHN Cƣờng độ thoát hơi nƣớc CPU Colony Forming Unit – Đơn vị hình thành khuẩn lạc ĐDKK Độ dẫn khí khổng EM Ectomycorrhiza Fe Sắt IAA Indole-3-acctic acid MT Môi trƣờng N Nitơ P photpho SPAD Hàm lƣợng diệp lục TCA Trichloacetic acid (axit tricloaxetic) VAM Vesicular-Arbuscular mycorrhizza VSV Vi sinh vật VSVKĐ Vi sinh vật kiểm định Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ PHỤ LỤC Mở Đầu……………………………………………………………………….1 1.1 ĐẠI CƢƠNG VỀ NẤM CỘNG SINH VÙNG RỄ. 5 1.2. PHÂN LOẠI NẤM VÙNG RỄ. 6 1.2.1 Nấm ngoại cộng sinh (Ectomycorrhiza (EM) 6 1.2.2. Nấm rễ nội cộng sinh (Endomycorrhizal, AM) 7 1.2.3. Các loại nấm rễ khác. 8 1.3. SINH HỌC VÀ SINH THÁI HỌC NẤM VÙNG RỄ. 9 1.3.1. Sự hình thành nấm cộng sinh vùng rễ. 9 1.3.2. Tính chuyên hóa của nấm cộng sinh vùng rễ 11 1.4. VAI TRÒ NẤM CỘNG SINH VÙNG RỄ. 12 1.4.1. Tăng khả năng hấp thụ P và dinh dƣỡng của cây chủ. 12 1.4.2. Hình thành chất kích thích sinh trƣởng. 13 1.4.3. Nâng cao sức chống chịu và thích nghi với môi trƣờng của cây trồng 13 1.4.4. Cải thiện môi trƣờng xung quanh 14 1.4.5. Tăng khả năng kháng bệnh của cây trồng 15 1.5. NHỮNG NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG NẤM CỘNG SINH VÙNG RỄ. 15 1.5.1. Trên thế giới 15 1.5.2. Ở Việt Nam 18 1.6. TÌNH HÌNH SẢN XUẤT NÔNG NGHIỆP Ở VIỆT NAM. 20 CHƢƠNG II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP……………………………………………………….21 2.1. NGUYÊN LIỆU 23 2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu. 23 2.1.2. Hóa chất và thiết bị thí nghiệm. 23 2.1.2.1. Hóa chất 23 2.1.2.2. Thiết bị thí nghiệm 23 2.1.3. Môi Trƣờng 23 2.1.3.1. Môi trường phân lập nấm vùng rễ 23 2.1.3.2. Môi trường nuôi cấy, lên men và giữ giống. 24 2.1.3.3. Môi trường thử hoạt tính enzyme 24 2.1.3.4. Môi trường đánh giá khả năng kích thích sinh trưởng 24 2.1.4. Các dung dịch nhuộm 25 2.1.4.1. Dung dịch nhuộm rễ 25 2.1.4.2. Dung dịch nhuộm bào tử 25 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.2.1. Phân lập nấm vùng rễ. 25 2.2.1.1. Phương pháp thu thập mẫu: 25 2.2.1.2. Phương pháp phân lập bào tử AM. 25 2.2.1.3. Phương pháp phân lập các chủng nấm vùng rễ (EM). 26 2.2.2. Phƣơng pháp phân loại bằng hình thái và sinh học phân tử 26 2.2.2.1. Phân loại các chủng nấm AM. 26 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 2.2.2.2. Phân loại các chủng nấm EM 27 2.2.3. Tuyển chọn các chủng nấm hữu hiệu để sản xuất chế phẩm thử nghiệm 28 2.2.3.1. Phương pháp thử hoạt tính enzyme phosphataza của nấm vùng rễ (EM) 28 2.2.3.2. Phương pháp định lượng khả năng phân giải phốt phát khó tan 28 2.2.3.3. Xác định khả năng kích thích sinh trưởng thực vật của các chủng nấm vùng rễ 29 2.2.3.4. Xác định khả năng đối kháng giữa các chủng nấm vùng rễ 29 2.2.3.5. Kiểm tra tính an toàn của các chủng nấm lựa chọn 29 2.2.4. Tạo chế phẩm thử nghiệm trong quy mô phòng thí nghiệm. 30 2.2.4.1. Lên mem các chủng nấm lựa chọn tạo sinh khối vi sinh vật 30 2.2.4.2. Quy trình phối trộn tạo chế phẩm ở quy mô phòng thí nghiệm 31 2.2.4.3. Kiểm tra mật độ vi sinh trong chế phẩm theo thời gian 31 2.2.5. Thử nghiệm chế phẩm 32 2.2.5.1. Thử nghiệm chế phẩm trên cây lúa 32 2.2.5.2. Thử nghiệm chế phẩm trên cây cà chua 32 2.2.5.3. Thử nghiệm trên cây khoai tây 33 CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN……………………………………………………………… 33 3.1. THU THẬP MẪU 35 3.2. PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH TÊN CÁC CHỦNG NẤM RỄ 35 3.3. PHÂN LẬP CÁC CHỦNG NẤM RỄ (EM) TỪ CÁC MẪU RỄ CÂY. 40 3.4. ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH ENZYME NGOẠI BÀO CÁC CHỦNG NẤM (EM) 40 3.4.1. Hoạt tính enzyme của các chủng nấm vùng rễ (EM) 41 3.4.2. Định lƣợng khả năng phân giải phốt phát khó tan. 42 3.4.3. Đánh giá khả năng sinh tổng hợp indolacetic axit (IAA) thô của các chủng nấm 43 3.4.4. Xác định khả năng đối kháng của các chủng nấm vùng rễ. 44 3.4.5. Kiểm tra độ an toàn của các chủng nấm lựa chọn. 44 3.4.6. Định tên phân loại một số chủng nấm vùng rễ và lựa chọn tạo chế phẩm thử nghiệm. 45 3.4.7. Nghiên cứu các điều kiện lên men tạo chế phẩm thử nghiệm 53 3.4.7.1. Ảnh hưởng của môi trường lên men. 53 3.4.7.2. Ảnh hưởng của pH môi trường lên men. 54 3.4.7.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ 54 3.4.7.4. Ảnh hưởng của thời gian nuôi 55 3.4.8. Tạo chế phẩm thử nghiệm 56 3.4.9. Thử nghiệm chế phẩm 57 3.4.9.1. Thử nghiệm trên cây lúa……………………………………… 55 3.4.9.2. Thử nghiệm trên cây cà chua. 63 3.4.9.3. Thử nghiệm trên cây Khoai tây. 67 KẾT LUẬN 71 KIẾN NGHỊ. 72 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN LUẬN VĂN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ PHỤ LỤC HÌNH Hình 1.1. Hình ảnh nấm rễ ngoại cộng sinh 7 Hình 1.2. Hình ảnh nấm rễ nội cộng sinh 8 Hình 3.1. Số lƣợng bào tử AM tổng số trên 1g đất phân lập đƣợc 36 Hình 3.2. Hình ảnh bào tử phân lập đƣợc dƣới kính hiển vi điện tử 36 Hình 3.3. Hình ảnh khả năng cộng sinh của bào tử AM sau nhân nuôi bảo tồn trên cây Mã đề Ribwort. 37 Hình 3.4. Khả năng sinh tổng hợp IAA thô và phân giải phốt phát khó tan của các chủng nấm lựa chọn 44 Hình 3.5. Hình ảnh khuẩn lạc và bào tử của chủng NR1 46 Hình 3.6. Ảnh hiển vi của Penicillium vermiculatum NR4 47 Hình 3.7. Ảnh hiển vi của Penicillium levitum NR5 48 Hình 3.8. Ảnh cuống sinh bào tử, bào tử (trái) và thể quả (ảnh phải) của chủng NR7 49 Hình 3.9. Khuẩn lạc và cơ quan sinh sản của chủng NR8 50 Hình 3.10. Khuẩn lạc và cơ quan sinh sản của chủng NR11 51 Hình 3.11. Khuẩn lạc và cơ quan sinh bào tử của chủng NR12 52 Hình 3.12. Ảnh hiển vi của Trichoderma konilangbra NR13 53 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ PHỤ LỤC BẢNG Bảng 3.1. Số lƣợng bào tử AM tổng số /1g đất phân lập 35 Bảng 3.2. Bảng mô tả hình thái của một số bào tử nấm rễ 37 Bảng 3.3: Định tên một số bào tử nấm rễ 39 Bảng 3.4. Đánh giá hoạt tính enzyme phosphatase 41 Bảng 3.5. Khả năng phân giải phốt phát của các chủng nấm lựa chọn 42 Bảng 3.6. Khả năng sinh tổng hợp IAA thô của các chủng nấm 43 Bảng 3.7. Khả năng đối kháng giữa các chủng lựa chọn 44 Bảng 3.8. Kết quả đánh giá độ an toàn của các chủng lựa chọn 45 Bảng 3.9. Ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi đến sự sinh trƣởng và phát triển của các chủng nấm 53 Bảng 3.10. Ảnh hƣởng pH của môi trƣờng nuôi cấy đến sự sinh trƣởng và phát triển của các chủng nấm 54 Bảng 3.11. Ảnh hƣởng nhiệt độ đến sự sinh trƣởng và phát triển của các chủng nấm 54 Bảng 3.12. Ảnh hƣởng thời gian nuôi đến sự sinh trƣởng và phát triển của các chủng nấm 55 Bảng 3.13. Mật độ vi sinh trong chế phẩm ở thời gian khác nhau 57 Bảng 3.14. Ảnh hƣởng của chế phẩm nấm tới diện tích lá của giống lúa KD18 (dm 2 /cây) 58 Bảng 3.15. Ảnh hƣởng của chế phẩm nấm tới khối lƣợng rễ khô của giống KD18 (g/cây) 59 Bảng 3.16. Ảnh hƣởng của chế phẩm nấm tới khối lƣợng khô toàn cây của giống lúa KD18. 60 Bảng 3.17. Ảnh hƣởng của chế phẩm nấm tới năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất của giống lúa KD18. 61 Bảng 3.18. Ảnh hƣởng của chế phẩm nấm tới hàm lƣợng đạm, lân và kali trong đất (mg/100g đất) 62 Bảng 3.19. Ảnh hƣởng của nấm rễ với lƣợng lân bón khác nhau đến động thái tăng trƣởng chiều cao thân chính của cây cà chua (đơn vị tính: cm) 64 Bảng 3.20. Ảnh hƣởng của chế phẩm nấm đến sinh khối khô của cây cà chua 65 Bảng 3.21. Ảnh hƣởng của chế phẩm nấm đến khả năng ra hoa đậu quả và năng suất cây cà chua Savior. 66 Bảng 3.22. Ảnh hƣởng của chế phẩm nấm tới kích thƣớc quả cà chua. 66 Bảng 3.23. Ảnh hƣởng của chế phẩm nấm đến chiều dài thân chính và số lá trên thân chính qua các tuần theo dõi. 68 Bảng 3.24. Ảnh hƣởng của chế phẩm nấm rễ đến khối lƣợng chất khô qua các giai đoạn sinh trƣởng 68 Bảng 3.25. Ảnh hƣởng của các loại chế phẩm nấm rễ đến các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất 69 Bảng 3.26. Ảnh hƣởng của các loại chế phẩm nấm rễ đến kích thƣớc củ lúc thu hoạch (%) 69 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ [...]... đất và rễ xung quanh vùng rễ cây nông nghiệp; cà chua, lúa, khoai tây Phân lập và tuyển chọn các chủng nấm từ vùng rễ, lựa chọn các chủng nấm chuyên biệt có khả năng kích thích và chuyển hóa các chất làm tăng khả năng sinh trƣởng và phát triển của cây chủ Xác định tên một số chủng bằng hình thái và sinh học phân tử Tạo chế phẩm vi sinh từ khu hệ nấm rễ Bƣớc đầu thử nghiệm và đánh giá hiệu lực chế phẩm. .. áp dụng các công nghệ trên, phục vụ các nghiên cứu tiếp theo, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài Phân lập, tuyển chọn và bước đầu đánh giá hiệu quả sử dụng chế phẩm nấm vùng rễ trên một số cây nông nghiệp Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ MỞ ĐẦU Với mục tiêu của đề tài: Tạo sản phẩm phân bón sinh học cao cấp thân thiện môi trƣờng, giảm thiểu phân bón và thuốc trừ sâu hóa học... suất cây trồng cũng nhƣ làm bền vững hệ sinh thái đang thu hút sự quan tâm của nhiều nhà nghiên cứu Xu thế hƣớng đi mới trong phát triển công nghệ và ứng dụng các chế phẩm phân bón sinh học cho thực tiễn sản xuất là sử dụng các chế phẩm đa chủng nấm nhằm tăng năng suất và ổn định hiệu lực sản phẩm Việc nghiên cứu phát triển và ứng dụng chế phẩm vi sinh từ nấm rễ và nấm vùng rễ có thể áp dụng hiệu quả. .. chuyên hóa của nấm cộng sinh vùng rễ Do sự chọn lọc và tính thích nghi khác nhau, phạm vi tồn tại cây chủ khác nhau Một số loài nấm hình thành trên nhiều loài cây Một số loài chỉ cộng sinh trên một vài loài cây Tian Chengming (1995) chia những loài sống trên 5 loại cây gồm 10 loài thuộc Amanita, Cantharenlus; những loài sống trên 2 – 3 loại cây nhƣ Boletus, Ramaria; chỉ sống trên 1 loại cây có Suillus,... Sinh học Lâm nghiệp - Viện Khoa học Lâm nghiệp) đã tiến hành nghiên cứu sản xuất thử nghiệm chế phẩm nấm rễ ECM dƣới dạng viên nang; thử nghiệm một số dung dịch để bảo quản chế phẩm và đánh giá hiệu quả cộng sinh của chế phẩn dạng viên nang với cây sao đen trong vƣờn ƣơm và ngoài đồngruộng Kết quả nghiên cứu cho thấy, chế phẩm nấm rễ ECM dạng viên nang có nhiều ƣu điểm hơn các dạng khác, sợi nấm đƣợc bọc... thông) và tuyển chọn cho sản xuất nhiễm (1981-1985) Do trình độ phát triển công nghệ nên kết quả còn hạn chế, chƣa đáp ứng đƣợc nhu cầu sử dụng chế phẩm một cách hiệu quả với số lƣợng lớn cho sản xuất ƣơm và rừng trồng Phạm Quang Thu (2001-2004) với đề tài nghiên cứu sản xuất chế phẩm nấm nội cộng sinh đa chủng cho cây lâm nghiệp Đề tài đã nghiên cứu sản xuất chế phẩm nấm cộng sinh cho thông và bạch... nhiều loài cây trồng nông lâm nghiệp và sản xuất chế phẩm sinh học có khả năng thích nghi, sinh trƣởng và tăng năng suất cây trồng, đặc biệt tạo cơ hội sử dụng tài nguyên trên các vung đất khô cằn, đất nghèo dinh dƣỡng một cách có hiệu quả bền vững và thân thiện với môi trƣờng Đây là một lĩnh vực quan trọng và hết sức cần thiết Xuất phát từ vài trò thực tiễn của nấm vùng rễ và nhằm tạo cơ sở áp dụng các... nhau trên thế giới đã đem lại nhiều kết quả hết sức ý nghĩa cho ứng dụng mycorrhizal trong hệ sinh thái nông nghiệp, lâm nghiệp và môi trƣờng [9,22] 1.2 PHÂN LOẠI NẤM VÙNG RỄ Dựa trên đặc điểm xâm nhiễm của nấm vào rễ cây chủ, mycorrhiza đƣợc phân thành 2 nhóm chính là ngoại cộng sinh (Ectomycorrhiza, EM), và nội cộng sinh (Endomycorrhiza, AM) 1.2.1 Nấm ngoại cộng sinh (Ectomycorrhiza (EM) Nấm rễ ngoại... các chế phẩm sinh học trong canh tác cây trồng rất lớn, là một hƣớng đi đúng đắn, hƣớng tới một nền nông nghiệp hữu cơ, sinh thái bền vững và thân thiện với môi trƣờng Tuy nhiên, trên thực tế, việc sử dụng chế phẩm sinh học Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ MỞ ĐẦU ở Việt nam còn rất hạn chế, đặc biệt là các chế phẩm có nguồn gốc từ khu hệ nấm rễ Nấm có thể gây bệnh cho cây trồng,... nhánh ở tầng giữa và tầng trong của vỏ cây Nhánh sợi nấm trong tế bào rất nhỏ chỉ 0,5 – 1,0 µm Chỗ phân nhánh là nơi trao đổi chất dinh dƣỡng giữa nấm và rễ Bởi vì ở gốc nhánh sợi nấm ngƣời ta phát hiện nhiều hạt đƣờng và giọt dầu, và trong dịch bào phát hiện có muối photphorat và một số hợp chất hòa tan Nhánh phân ra bị phân giải lại cung cấp cho rễ cây sử dụng (https.//invam.wvu.edu) Số hóa bởi Trung . tôi tiến hành thực hiện đề tài Phân lập, tuyển chọn và bước đầu đánh giá hiệu quả sử dụng chế phẩm nấm vùng rễ trên một số cây nông nghiệp . MỞ ĐẦU Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/. và ứng dụng chế phẩm vi sinh từ nấm rễ và nấm vùng rễ có thể áp dụng hiệu quả cho nhiều loài cây trồng nông lâm nghiệp và sản xuất chế phẩm sinh học có khả năng thích nghi, sinh trƣởng và tăng. trƣởng và phát triển của cây chủ. Xác định tên một số chủng bằng hình thái và sinh học phân tử. Tạo chế phẩm vi sinh từ khu hệ nấm rễ. Bƣớc đầu thử nghiệm và đánh giá hiệu lực chế phẩm trên cây