Đang tải... (xem toàn văn)
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC TIỂU LUẬN CÔNG NGHỆ PROTEIN - ENZYME Đề tài: Trình bày quá trình biểu hiện protein- enzyme tái tổ hợp ở nấm, tế bào côn trùng, tế bào động vật có vú, động vật, thực vật Giáo viên hướng dẫn: TS. Đặng Xuân Nghiêm Sinh viên thực hiện : Trương Thị Thủy Lớp : CNSH55A MSV : 550404 A. Đặt vấn đề Mặc dù các tế bào vi khuẩn biểu hiện thành công rất nhiều protein từ tế bào nhân chuẩn, vẫn có những trường hợp protein tái tổ hợp được biểu hiện tốt nhất ở các tế bào nhân chuẩn. Một số protein nhân chuẩn không bền hay bất hoạt sau khi được biểu hiện ở vi khuẩn. Điều này đặc biệt đúng với những protein cần sự biến đổi sau dịch mã (posttranslational modification). Có nhiều loại biến đổi sau dịch mã ở nhân chuẩn xảy ra sau khi chuỗi polypeptide đã được tạo ra. Chúng bao gồm: (a) Biến đổi hóa học tạo thành amino acid mới trong chuỗi polypeptide. (b) Hình thành cầu nối disulfide giữa hai gốc cysteine đúng (ví dụinsulin). (c) Đường hóa (glycosylation), là quá trình thêm gốc đường vào các vịtrí nhất định trên phân tử protein. Rất nhiều protein trên bề mặt tế bào được đường hóa và sẽ không lắp ráp chính xác lên màng hay hoạt động chức năng được nếu thiếu thành phần đường. (d) Gắn thêm nhiều loại nhóm chức khác nhau như các chuỗi acid béo, các nhóm acetyl, phosphate và sulfate. (e) Cắt tiền chất protein. Việc này có thểxảy ra ởvài bước như được minh họa bởi insulin. Việc cắt bỏnày có thểliên quan đến việc tiết, cuộn gấp đúng và/hoặc hoạt hóa protein. Các enzyme cần cho quá trình cải biến và xửlý thường vắng mặt trong tếbào vi khuẩn, nên cần phải biểu hiện chúng trong tếbào nhân chuẩn. Các enzyme xửlý sau dịch mã có liên quan thường hiện diện ởmột loạt sinh vật bậc cao; do đó rất ít trường hợp cần biểu hiện protein tái tổhợp ở đúng sinh vật đó. Ở đây chúng ta quan tâm đến việc sản xuất protein ở tế bào nuôi cấy. Tuy nhiên, người ta có thể biến đổi gene của toàn bộmột động vật hay thực vật để sản xuất protein tái tổhợp. Thuận lợi tiếp theo trong việc sử dụng hệ thống biểu hiện protein của sinh vật nhân chuẩn loại bỏ được nguy cơ nhiễm tạp các protein vi khuẩn. Mặc dù được tinh sạch, các protein vi khuẩn tồn dư với lượng rất nhỏ sẽ gây độc hay sẽ kích hoạt hệ thống miễn dịch của sinh vật nhân chuẩn, gây sốt. Các vector con thoi (shuttle vector) được thiết kế đểdi chuyển gen qua lại giữa các nhóm sinh vật khác nhau. Bởi vì thao tác gene ở tế bào nhân chuẩn khó khăn hơn nên hầu hết các vector biểu hiện ở nhân chuẩn là vector con thoi Những vector như vậy cho phép việc cải biến gene diễn ra ởvi khuẩn, thường là E. coli, và cho phép chuyển vào các sinh vật khác đểbiểu hiện gene. Chúng ta sẽ xem xét tếbào nấm men, côn trùng và động vật có vú nhưlà những hệthống biểu hiện protein tái tổ hợp (Đặng Xuân Nghiêm-HUABIOTECH-Copyright©12/2010- all rights reserved Reference: David P. Clark and Nanette J. Pazdernik.2010.Biotechnology- applying the genetic revolution. Academic Press) B. NỘI DUNG I. Nấm men I.1 Đặc điểm Nấm men Saccharomyces cerevisiae được sử dụng như một sinh vật nhân chuẩn mẫu trong nghiên cứu sinh học phân tử. Bộ gene của nấm men đã được giải trình tự và nhiều gene đã được nghiên cứu đặc điểm. Dưới góc độ công nghệ sinh học, vài yếu tố tạo thành ưu thế của nấm men trong việc biểu hiện một số protein nhân chuẩn tái tổ hợp. (a) Nấm men có thể nuôi dễ dàng cả ở quy mô nhỏ lẫn các nồi lên men sinh học lớn. (b) Sau nhiều ngàn năm sử dụng để lên men rượu bia và bánh mỳ, nấm men được công nhận là sinh vật an toàn với con người. Chúng có thể được dùng để biểu hiện các protein dùng trong y học mà không cần sự chấp thuận thêm của các nhà quản lý. (c) Nấm men tiết rất ít protein. Do vậy nếu biến đổi gene để nó có thể sản xuất một protein tái tổhợp tiết ra môi trường thì việc tinh sạch sẽ dễ dàng. (d) Nấm men có thể được chuyển gene vào dễ dàng nhờ nhiều phương pháp khác nhau sau khi đã phân hủy thành tế bào bằng enzyme hay các chất hóa học, hay tạo lỗ nhờ sung điện. (e) Nấm men có plasmid 2 micron tự nhiên để làm cơ sở cho việc thiết kế các vector biểu hiện. (f) Nhiều promoter của nấm men đã được nghiên cứu kỹ và có thể dùng để kiểm soát việc biểu hiện protein tái tổ hợp. (g) Mặc dù là sinh vật nhân chuẩn đơn bào nguyên thủy, nấm men vẫn thực hiện nhiều quá trình biến đổi protein sau dịch mã đặc trưng cho sinh vật nhân chuẩn, như thêm các gốc đường (quá trình glycosylation). Tuy nhiên nấm men chỉ đường hóa các protein tiết. Protein tái tổhợp có thểthiết kế để được tiết bởi nấm men (Đặng Xuân Nghiêm-HUABIOTECH-Copyright©12/2010- all rights reserved Reference: David P. Clark and Nanette J. Pazdernik.2010.Biotechnology-applying the genetic revolution. Academic Press) II.2. Các hệ thống vector Có nhiều vector sử dụng cho nấm men đã được tạo ra và thương mại hóa. Các vector này đều sử dụng phương pháp chọn lọc khuyết dưỡng Chúng có thể được chia thành 3 loại chính: Các vector plasmid (YEp) được sửdụng nhiều nhất. Các vector dung nhập vào nhiễm sắc thể nấm men (Yip) Nhiễm sắc thể nấm men nhân tạo (YAC). 1. YEp( yeast episomal plasmids ) Đặc điểm: - Dựa vào plasmid 2µm - Vị trí đa nhân dòng (MCS) - Promoter điều khiển quá trình phiên mã và dịch mã - Gốc tái bản trong E.coli và trong nấm men ori.E và ori.2µ plasmid - Gen chọn lọc kháng ampiciline - Gen mã hóa cho leuxin 2 (LEU2) - Trong gen đích cần cài vào vector ngoài đoạn DNA quan tâm còn có các trình tự như : + Có đoạn DNA mã hóa cho trình tự amino acid giúp protein sau khi tạo thành sẽ đi ra khỏi tế bào giải phóng ra môi trường → thuận lợi cho việc tinh sạch , trình tự sử dụng là gen nhân tố giao phối α + Đoạn DNA làm tăng độ bền của protein + Các trình tự amino acid được bổ sung nhằm tăng độ bền và tăng khả năng tinh sạch sẽ được cắt bỏ bởi các protease đặc hiệu 2. YIp (yeast integrating plasmid ) Do các plasmid có thể mất đi, đặc biệt trong các mẻ môi trường nuôi cấy lớn, nên ứng dụng vector dung nhập sẽ làm tăng sự ổn định của gene ngoại lai. Điều bất lợi là chỉ một bản sao của gene chuyển có mặt, trừ khi các cấu trúc lặp lại liên tiếp được sử dụng. Những trình tự lặp liên tiếp này lại không ổn định vì xảy ra trao đổi chéo (Sách ”Công nghệ sinh học phân tử- nguyên lí và ứng dụng của ADN tái tổ hợp”- Bernard R.Glick & Jack J. Pasternak nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật xuất bản năm 2007) hp://www.discoverbiotech.com/wiki/-/wiki/Main/Cloning+Vectors 3. YAc (yeast artificial chromosome ) - Sử dụng để nhân dòng những đoạn DNA có kích thước lớn - Có độ bền cao dùng để lập bản đồ vật lý của AND hệ gen người, phân tích các đơn vị phiên mã lớn, lập thư viện gen người - Nó giống NST bình thường vì có vùng khởi đầu sao chép(ARS) , trình tự tâm động của nấm men (CEN), Các telomere nằm ở cuối nhiễm sắc thể, bảo vệ DNA khỏi tác động của nuclease (TEL) - Ngoài ra còn có các gen đánh dấu chọn lọc và vị trí nhận biết của enzyme cắt giới hạn (Sách ”Công nghệ sinh học phân tử- nguyên lí và ứng dụng của ADN tái tổ hợp”- Bernard R.Glick & Jack J. Pasternak nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật xuất bản năm 2007) hp://www.accessexcellence.org/RC/VL/GG/YAC.php Ứng dụng Protein hỗn hợp cho người bây giờ đã được sản xuất nhờ nấm men Saccharomyces cerevisiae. Chúng bao gồm insulin, yếu tố đông máu XIIIa, vài yếu tố sinh trưởng và protein virus (từ HIV, viêm gan B, C, v.v.) được sử dụng như là các vacine hay trong chuẩn đoán. Mặc dù nhiều protein tái tổhợp đã được biểu hiện thành công ở nấm men, năng suất của chúng thường thấp. (Đặng Xuân Nghiêm-HUABIOTECH-Copyright©12/2010- all rights reserved Reference: David P. Clark and Nanette J. Pazdernik.2010.Biotechnology-applying the genetic revolution. Academic Press) Các khó khăn bao gồm: (a) Sự thất thoát plasmid biểu hiện trong quá trình sinh trưởng trong các nồi lên men lớn. (b) Các protein được cho là sẽ được tiết thường bị giữ lại ở khoảng giữa màng và thành tế bào chứ không thoát ra ngoài môi trường. (c) Quá trình đường hóa protein thường quá đà và sản phẩm protein tái tổ hợp thường có quá nhiều gốc đường để có thể hoạt động đúng Vì sự biểu hiện trong S.cerevisiae có một số nhược điểm là : - sự biểu hiện thấp năng suất không đáng kể - sự gắn gốc đường không chính xác làm biến đổi chức năng và làm cho protein tái tổ hợp có tình kháng nguyên - protein tái tổ hợp thường bị giữ lại tại nhu chất do đó làm tăng thời gian và chi phí để tinh sạch - trong quá trình sinh trưởng S.cerevisiae sản sinh ra etanol là chất độc đối với tế bào → giảm lượng protein tiết ra vì vậy người ta tìm kiếm các hệ thống nấm men khác để khắc phục những nhược điểm của S.serevisiae và P.pastoris có những ưu điểm - có promoter hiểu quả cao - không tổng hợp etanol - tiết rất ít loại protein nên dễ tinh sạch có rất nhiều vector biểu hiện của P. pastoris đã được thiết kế cấu trúc của mối loại đều có những điểm chung như: - các plasmid cài nhập - có gen quan tâm chịu sự điều khiển của promoter - trình tự kết thúc phiên mã từ gen AOX1 của P.pastoris - gen đánh dấu chọn lọc trong nấm men (Sách ”Công nghệ sinh học phân tử- nguyên lí và ứng dụng của ADN tái tổ hợp”- Bernard R.Glick & Jack J. Pasternak nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật xuất bản năm 2007) cấu tạo của vector biểu hiện trong P.pastoris hp://openi.nlm.nih.gov/detailedresult.php?img=3118338_1472-6750-11-47-6&req=4 II. BIỂU HIỆN PROTIEN Ở TẾ BÀO CÔN TRÙNG II.1 Đặc điểm Các tế bào động vật có vú khá mỏng manh và có các đòi hỏi dinh dưỡng phức tạp. Điều này làm cho việc nuôi cấy chúng khó khăn và đắt đỏ so với tế bào nấm men hay vi khuẩn. Tuy nhiên tế bào côn trùng khá khỏe và có thể được nuôi cấy trong các môi trường đơn giản hơn các tếbào động vật. Kết quả là, các hệ thống biểu hiện dựa vào côn trùng đã được phát triển. Những hệ thống này có thêm thuận lợi là có thể tiến hành các biến đổi sau dịch mã giống với các hệ thống ở tế bào động vật có vú. Các vector được sử dụng trong các tế bào vi khuẩn hầu hết đều có nguồn gốc từ một họ virus có tên là baculovirus, chỉxâm nhiễm côn trùng (và các động vật
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC TIỂU LUẬN CƠNG NGHỆ PROTEIN - ENZYME Đề tài: Trình bày trình biểu protein- enzyme tái tổ hợp nấm, tế bào trùng, tế bào động vật có vú, động vật, thực vật Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực : Lớp : MSV : TS Đặng Xuân Nghiêm Trương Thị Thủy CNSH55A 550404 A Đặt vấn đề Mặc dù tế bào vi khuẩn biểu thành công nhiều protein từ tế bào nhân chuẩn, có trường hợp protein tái tổ hợp biểu tốt tế bào nhân chuẩn Một số protein nhân chuẩn không bền hay bất hoạt sau biểu vi khuẩn Điều đặc biệt với protein cần biến đổi sau dịch mã (posttranslational modification) Có nhiều loại biến đổi sau dịch mã nhân chuẩn xảy sau chuỗi polypeptide tạo Chúng bao gồm: (a) Biến đổi hóa học tạo thành amino acid chuỗi polypeptide (b) Hình thành cầu nối disulfide hai gốc cysteine (ví dụinsulin) (c) Đường hóa (glycosylation), q trình thêm gốc đường vào vịtrí định phân tử protein Rất nhiều protein bề mặt tế bào đường hóa khơng lắp ráp xác lên màng hay hoạt động chức thiếu thành phần đường (d) Gắn thêm nhiều loại nhóm chức khác chuỗi acid béo, nhóm acetyl, phosphate sulfate (e) Cắt tiền chất protein Việc có thểxảy ởvài bước minh họa insulin Việc cắt bỏnày có thểliên quan đến việc tiết, cuộn gấp và/hoặc hoạt hóa protein Các enzyme cần cho trình cải biến xửlý thường vắng mặt tếbào vi khuẩn, nên cần phải biểu chúng tếbào nhân chuẩn Các enzyme xửlý sau dịch mã có liên quan thường diện ởmột loạt sinh vật bậc cao; trường hợp cần biểu protein tái tổhợp sinh vật Ở quan tâm đến việc sản xuất protein tế bào nuôi cấy Tuy nhiên, người ta biến đổi gene tồn bộmột động vật hay thực vật để sản xuất protein tái tổhợp Thuận lợi việc sử dụng hệ thống biểu protein sinh vật nhân chuẩn loại bỏ nguy nhiễm tạp protein vi khuẩn Mặc dù tinh sạch, protein vi khuẩn tồn dư với lượng nhỏ gây độc hay kích hoạt hệ thống miễn dịch sinh vật nhân chuẩn, gây sốt Các vector thoi (shuttle vector) thiết kế đểdi chuyển gen qua lại nhóm sinh vật khác Bởi thao tác gene tế bào nhân chuẩn khó khăn nên hầu hết vector biểu nhân chuẩn vector thoi Những vector cho phép việc cải biến gene diễn ởvi khuẩn, thường E coli, cho phép chuyển vào sinh vật khác đểbiểu gene Chúng ta xem xét tếbào nấm men, côn trùng động vật có vú nhưlà hệthống biểu protein tái tổ hợp (Đặng Xuân Nghiêm-HUABIOTECH-Copyright©12/2010- all rights reserved Reference: David P Clark and Nanette J Pazdernik.2010.Biotechnologyapplying the genetic revolution Academic Press) B NỘI DUNG I Nấm men I.1 Đặc điểm Nấm men Saccharomyces cerevisiae sử dụng sinh vật nhân chuẩn mẫu nghiên cứu sinh học phân tử Bộ gene nấm men giải trình tự nhiều gene nghiên cứu đặc điểm Dưới góc độ cơng nghệ sinh học, vài yếu tố tạo thành ưu nấm men việc biểu số protein nhân chuẩn tái tổ hợp (a) Nấm men ni dễ dàng quy mô nhỏ lẫn nồi lên men sinh học lớn (b) Sau nhiều ngàn năm sử dụng để lên men rượu bia bánh mỳ, nấm men cơng nhận sinh vật an tồn với người Chúng dùng để biểu protein dùng y học mà không cần chấp thuận thêm nhà quản lý (c) Nấm men tiết protein Do biến đổi gene để sản xuất protein tái tổhợp tiết mơi trường việc tinh dễ dàng (d) Nấm men chuyển gene vào dễ dàng nhờ nhiều phương pháp khác sau phân hủy thành tế bào enzyme hay chất hóa học, hay tạo lỗ nhờ sung điện (e) Nấm men có plasmid micron tự nhiên để làm sở cho việc thiết kế vector biểu (f) Nhiều promoter nấm men nghiên cứu kỹ dùng để kiểm sốt việc biểu protein tái tổ hợp (g) Mặc dù sinh vật nhân chuẩn đơn bào nguyên thủy, nấm men thực nhiều trình biến đổi protein sau dịch mã đặc trưng cho sinh vật nhân chuẩn, thêm gốc đường (quá trình glycosylation) Tuy nhiên nấm men đường hóa protein tiết Protein tái tổhợp có thểthiết kế để tiết nấm men (Đặng Xuân Nghiêm-HUABIOTECH-Copyright©12/2010- all rights reserved Reference: David P Clark and Nanette J Pazdernik.2010.Biotechnology-applying the genetic revolution Academic Press) II.2 Các hệ thống vector Có nhiều vector sử dụng cho nấm men tạo thương mại hóa Các vector sử dụng phương pháp chọn lọc khuyết dưỡng Chúng chia thành loại chính: Các vector plasmid (YEp) sửdụng nhiều Các vector dung nhập vào nhiễm sắc thể nấm men (Yip) Nhiễm sắc thể nấm men nhân tạo (YAC) YEp( yeast episomal plasmids ) Đặc điểm: - Dựa vào plasmid 2µm - Vị trí đa nhân dịng (MCS) - Promoter điều khiển q trình phiên mã dịch mã - Gốc tái E.coli nấm men ori.E ori.2µ plasmid - Gen chọn lọc kháng ampiciline - Gen mã hóa cho leuxin (LEU2) - Trong gen đích cần cài vào vector ngồi đoạn DNA quan tâm cịn có trình tự : + Có đoạn DNA mã hóa cho trình tự amino acid giúp protein sau tạo thành khỏi tế bào giải phóng môi trường → thuận lợi cho việc tinh , trình tự sử dụng gen nhân tố giao phối α + Đoạn DNA làm tăng độ bền protein + Các trình tự amino acid bổ sung nhằm tăng độ bền tăng khả tinh cắt bỏ protease đặc hiệu YIp (yeast integrating plasmid ) Do plasmid đi, đặc biệt mẻ môi trường nuôi cấy lớn, nên ứng dụng vector dung nhập làm tăng ổn định gene ngoại lai Điều bất lợi gene chuyển có mặt, trừ cấu trúc lặp lại liên tiếp sử dụng Những trình tự lặp liên tiếp lại khơng ổn định xảy trao đổi chéo (Sách ”Cơng nghệ sinh học phân tử- ngun lí ứng dụng ADN tái tổ hợp”Bernard R.Glick & Jack J Pasternak nhà xuất khoa học kỹ thuật xuất năm 2007) http://www.discoverbiotech.com/wiki/-/wiki/Main/Cloning+Vectors YAc (yeast artificial chromosome ) - Sử dụng để nhân dịng đoạn DNA có kích thước lớn - Có độ bền cao dùng để lập đồ vật lý AND hệ gen người, phân tích đơn vị phiên mã lớn, lập thư viện gen người - Nó giống NST bình thường có vùng khởi đầu chép(ARS) , trình tự tâm động nấm men (CEN), Các telomere nằm cuối nhiễm sắc thể, bảo vệ DNA khỏi tác động nuclease (TEL) - Ngồi cịn có gen đánh dấu chọn lọc vị trí nhận biết enzyme cắt giới hạn (Sách ”Công nghệ sinh học phân tử- nguyên lí ứng dụng ADN tái tổ hợp”- Bernard R.Glick & Jack J Pasternak nhà xuất khoa học kỹ thuật xuất năm 2007) http://www.accessexcellence.org/RC/VL/GG/YAC.php Ứng dụng Protein hỗn hợp cho người sản xuất nhờ nấm men Saccharomyces cerevisiae Chúng bao gồm insulin, yếu tố đông máu XIIIa, vài yếu tố sinh trưởng protein virus (từ HIV, viêm gan B, C, v.v.) sử dụng vacine hay chuẩn đoán Mặc dù nhiều protein tái tổhợp biểu thành công nấm men, suất chúng thường thấp (Đặng Xuân Nghiêm-HUABIOTECH-Copyright©12/2010- all rights reserved Reference: David P Clark and Nanette J Pazdernik.2010.Biotechnology-applying the genetic revolution Academic Press) Các khó khăn bao gồm: (a) Sự thất plasmid biểu q trình sinh trưởng nồi lên men lớn (b) Các protein cho tiết thường bị giữ lại khoảng màng thành tế bào khơng ngồi mơi trường (c) Q trình đường hóa protein thường đà sản phẩm protein tái tổ hợp thường có nhiều gốc đường để hoạt động Vì biểu S.cerevisiae có số nhược điểm : - biểu thấp suất không đáng kể - gắn gốc đường không xác làm biến đổi chức làm cho protein tái tổ hợp có tình kháng ngun - protein tái tổ hợp thường bị giữ lại nhu chất làm tăng thời gian chi phí để tinh - trình sinh trưởng S.cerevisiae sản sinh etanol chất độc tế bào → giảm lượng protein tiết người ta tìm kiếm hệ thống nấm men khác để khắc phục nhược điểm S.serevisiae P.pastoris có ưu điểm - có promoter hiểu cao - khơng tổng hợp etanol - tiết loại protein nên dễ tinh có nhiều vector biểu P pastoris thiết kế cấu trúc mối loại có điểm chung như: - plasmid cài nhập - có gen quan tâm chịu điều khiển promoter - trình tự kết thúc phiên mã từ gen AOX1 P.pastoris - gen đánh dấu chọn lọc nấm men (Sách ”Công nghệ sinh học phân tử- nguyên lí ứng dụng ADN tái tổ hợp”- Bernard R.Glick & Jack J Pasternak nhà xuất khoa học kỹ thuật xuất năm 2007) cấu tạo vector biểu P.pastoris http://openi.nlm.nih.gov/detailedresult.php?img=3118338_1472-6750-11-47-6&req=4 II BIỂU HIỆN PROTIEN Ở TẾ BÀO CÔN TRÙNG II.1 Đặc điểm Các tế bào động vật có vú mỏng manh có địi hỏi dinh dưỡng phức tạp Điều làm cho việc ni cấy chúng khó khăn đắt đỏ so với tế bào nấm men hay vi khuẩn Tuy nhiên tế bào côn trùng khỏe ni cấy mơi trường đơn giản tếbào động vật Kết là, hệ thống biểu dựa vào côn trùng phát triển Những hệ thống có thêm thuận lợi tiến hành biến đổi sau dịch mã giống với hệ thống tế bào động vật có vú Các vector sử dụng tế bào vi khuẩn hầu hết có nguồn gốc từ họ virus có tên baculovirus, chỉxâm nhiễm trùng (và động vật khơng xương có họ hàng lớp nhện giáp xác) Baculovirus có kiểu hình thành hạt virus dị thường dạng polyhedrons (đa diện) Nhưng côn trùng bị chết, hạt virus giải phóng gắn vào chất protein Protein chất gọi polyhedrin, cấu trúc polyhedron bảo vệ hạt virus chúng ngồi mơi trường Khi nuốt côn trùng khác, polyhedrin bị dung giải nhờ q trình tiêu hóa polyhedron tách Q trình giúp giải phóng hạt virus xâm nhiễm tế bào trùng Gene mã hóa polyhedrin có promoter khỏe, giai đoạn muộn trình dịch mã, protein polyhedrin tạo với lượng lớn Do polyhedrin không thật cần thiết cho việc xâm nhiễm virus vào tế bào trùng ni cấy, polyhedrin promoter sử dụng để biểu protein tái tổ hợp Trình tự mã hóa cho polyhedrin loại bỏ thay cDNA mã hóa cho protein tái tổ hợp quan tâm Có nhiều loại baculovirus khác nhau, loại thường sử dụng nhiều MNPV (multi nuclear polyhedrosis virus) Virus xâm nhiễm nhiều tế bào côn trùng sinh sôi tốt nhiều dịng tế bào trùng ni cấy Một dịng tế bào phổ thông sử dụng để nhân virus lên từ loài sâu fall armyworm (sâu keoSpodoptera frugiperda) Sản lượng polyhedrin-và sản lượng protein tái tổhợp sử dụng polyhedrin promoter thường đặc biệt cao dịng tế bào (Đặng Xn Nghiêm-HUABIOTECH-Copyright©12/2010- all rights reserved Reference: David P Clark and Nanette J Pazdernik.2010.Biotechnology- applying the genetic revolution Academic Press) II.2 Hệ thống vectoter biểu baculovirut DNA Vector DNA 5’ Pp MCS Pt DNA 3’ AcMNPV AcMNPV a Cấu trúc đơn vị biểu vector chuyển nạp baculovirus(AcMNPV ), MCS vị trí đa nhân dịng, Pp promoter gen polyheđrin,Pt trình tự kết thúc phiên mã gen polyheđrin 5’,3’ DNA AcMNPV trình tự khởi đầu kết thúc phiên mã Sự thay gen polyheđrin AcMNPV đơn vị biểu từ vector chuyển nạp Trao đổi chéo kép(x) đoạn DNA tương đồng vector chuyển nạp hệ AcMNPV dẫn đến cài nhập đơn vị biểu vào gen AcMNPV GOI đoạn gen quan tâm Các tế bào côn trùng sau cấy AcMNPV tái tổ hợp tạo vết tan trình chọn lọc do tế bào có AcMNPV tái tổ hợp gen polyheđrin bị bất hoạt, cịn tế bào khơng có AcMNPV tái tổ hợp gen polyheđrin hoạt động bình thường Việc định loại vết tan mắt dễ gây mệt mỏi mang tính chủ quan người ta thêm số tác nhân chọn lọc khác gen lacZ E.coli ,gen mã hóa cho β-galactosidase, đặt kiểm soát promoter baculovirus, thiết kế gắn DNA đích →những tế bào trùng có AcMNPV tái tổ hợp tạo vết tan có màu xanh mơi trường ni cấy có bổ sung thêm X-gal b Để tăng sản lượng baculovirus tái tổ hợp có nhiều quy trình tìm có phương pháp thẳng hóa gen AcMNPV trước chuyển nhiễm vào tế bào côn trùng Sử dụng Bsu36I để cắt gen AcMNPV hai vị trí gen polyheđrin,một gen 603 vị trí gen 1629 cần thiết cho nhân lên virus, DNA từ baculovirus xử lý với Bsu36I chuyển nhiễm vào tế bào côn trùng , nhân lên virus không xảy thiếu gen 1629 Vector chuyển nạp gồm có gen quan tâm có gen đánh dấu chọn lọc vector chuyển nạp đưa vào tế bào côn trùng trước chuyển nhiễm với hệ gen AcMNPV thẳng hóa Sự trao đổi kép vừa tạo nên phiêm có chức gen 1629 vừa gắn kết gưn nhân dòng vào gen AcMNPV Với hệ thống này, tới 99% vết tan baculovirus virut tái tổ hợp Quá trình tạo baculovirus tái tổ hợp c Vector thoi baculovirus E.coli –tế bào côn trùng - hệ thống có khả thực thao tác di truyền để tạo vector biểu baculovirus E.coli phát triển, tế bào côn trùng cần cho việc tạo protein tái tổ hợp - plasmid tái E.coli thiết kế gồm gen kháng Kanamycine, vị trí cài nhập (att) chèn vào gen lacZ mà không làm chức ( hình A) - sau qua trình tái tổ hợp kép DNA AcMNPV plasmid E.coli tạo nên vector thoi baculovirut E.coli – tế bào côn trùng gọi bacmit Trong trình chuyển nạp đoạn gen cho vào bacmit cần phải có - plasmid cho (plasmid E.coli ), gồm có gen kháng gentamycine đơn vị biểu gen đích chặn hai đầu trình tự cài nhập gen kháng ampiciline nằm ngồi vị trí gắn - plasmid phụ trở gồm có gen chuyển vị, gen kháng tetraciline tế bào virus biến nạp kép, đoạn DNA chuyển vị vào vị trí gắn bacmit Sự gắn kết đoạn DNA plasmid cho với với đơn vị biểu gen kháng gentamicine vào vị trí gắn bacmit phá vỡ khung đọc gen lacZ Vì vậy,vi khuẩn chứa bacmit tái tổ hợp tạo khuẩn lạc trắng môi trường có IPTG X-Gal, ngồi khuẩn lạc trắng kháng với kanamicine nhảy cảm với ampiciline tetraciline mang bacmit tái tổ hợp mà không mang plasmid cho hay trở giúp.Sau tất thao tác này, gắn kết gen nhân dịng khẳng định PCR Cuối bacmit tái tổ hợp chuyển nhiễm vào tế bào trùng gen nhân dịng phiên mã protein tái tổ hợp tạo (Sách ”Cơng nghệ sinh học phân tử- ngun lí ứng dụng ADN tái tổ hợp”Bernard R.Glick & Jack J Pasternak nhà xuất khoa học kỹ thuật xuất năm 2007) Q TRÌNH ĐƯỜNG HĨA (glycosylation) Nhiều protein sinh vật nhân chuẩn đường hóa sau dịch mã Q trình đường hóa cần thiết cho chức sốprotein Một thuận lợi biểu protein tái tổ hợp sinh vật nhân chuẩn tế bào trùng chúng có hệ thống/con đường đường hóa Con đường đường hóa sau dịch mã amino acid arginine động vật có vú côn trùng giống thêm gốc manose Tuy nhiên đường chuyển hóa khác lại khác Tuy vậy, đường hóa phần cịn khơng Hiện có dịng tế bào trùng khác cải biến gene để biểu tồn bộcon đường đường hóa động vật có vú Ứng dụng : sản xuất β-iterferol, rhodopsin bò, protein vỏ virus HIV-1, interleukin, lipaza tủy người, kháng nguyên virus hợp bào hô hấp, phức hệ protein vận chuyển, chấ hoạt hóa plasmid mơ, protein virus bại liệt… (Đặng Xuân Nghiêm-HUABIOTECH-Copyright©12/2010- all rights reserved Reference: David P Clark and Nanette J Pazdernik.2010.Biotechnology-applying the genetic revolution Academic Press) III BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔHỢP Ở TẾ BÀO ĐỘNG VẬT CÓ VÚ - Các hệ thống biểu tế bào động vật có vú có vai trị quan trọng để sản xuất protein tái tổ hợp với đầy đủ biến đổi sau dịch mã Một số dòng tế bào phát triển cho mục đích Các tế bào có nguồn gốc từ thận khỉ xanh Châu Phi (COS) thận chuột Hamster non(BHK ), thận phôi người (HEK-239) dung để biểu gen ngắn hạn cho việc tạo nhanh lượng nhỏ protein Các tế bào buồng trứng chuột Hamter Trung Quốc (CHO) thường sử dụng để biểu dài hạn cần lượng lớn protein tái tổ hợp - Một vector biểu động vật có vú tiêu biểu chứa vùng khởi đầu chép nhân chuẩn(orieuk) thường từ virus động vật Vd virus khỉ (simian virus 40 SV40) Các trình tự promoter điều khiển gen nhân dòng, gen đánh dấu chọn lọc trình tự kết thúc phiên mã phải nhân chuẩn thường lấy từ virus người hay từ gen động vật có vú Sự biểu gen quan tâm tăng cường việc đặt trình tự intron promoter vùng nhân dòng đa vị thiế kế phiên mã Các trình tự cần cho việc chọn lọc nhân vector biểu tế bào động vật có vú E.coli thường có nguồn gốc từ vector nhân dòng chuẩn E.coli pBR322 Vector biểu động vật có vú tiêu biểu Để có kết tốt gen quan tâm phải trang bị trình tự điều hịa dịch mã Sự khởi đầu dịch mã sinh vật nhân chuẩn bậc cao phụ thuộc vào trình tự nucleotide đặc hiệu bao quanh codon mở đầu (AUG) gọ trình tự kozak (K), CC(A G)CCAUGG Một tín hiệu phiên DNA trình tự kozak gồm có trình tự tín hiệu (S) tạo điều kiện cho việc tiết, trình tự protein (T) để tăng khả tinh protein tái tổ hợp trình tự cắt protease (P) cho phép việc cắt bỏ đuôi khỏi protein tái tổ hợp đặt vào đầu gen quan tâm Việc bổ sung codon kết thúc (SC) đảm bảo cho trình dịch mã kết thúc vị trí xác Cuối cùng, trình tự chứa vùng không dịch mã (UTR) 3’, 5’ có vai trị quan trọng việc dịch mã độ bền RNAtt Các yếu tố điều hòa dịch mã Đa số vector biểu tế bào động vật có vú mang gen mã hóa cho polipeptit có chức Tuy nhiên, dang hoạt động số proein quan trọng thương mại chứa hai chuỗi protein khác Vd: hoocmon kích tuyến giáp người protein có hai chuỗi hemoglobin kháng thể có tiểu phần Có thể nhân dịng gen hay DNA bổ sung cho tiểu phần protein nhiều tiểu phần tổng hợp tích tiểu phần cách độc lập, sau trộn với ống nghiệm tỉ lệ lắp ráp xác trường hợp thấp ngược lại trình lắp protein dime tetrae invivo lại tốt nhiều phương pháp khác phát triển để sản xuất hai protein tái tổ hợp khác tế bào Điều giải theo ba cách: Hai vector riêng biệt sử dụng, vector mang gene mã hóa tiểu phần Tuy nhiên, thường xảy tưởng hai vector tế bào chuyển nhiệm kép Ngoài ra, số lượng hai vector khơng ln trì nhau, gây ảnh hưởng đến sản lượng sản phẩm cuối Để giải vấn đề vector mang hai gen nhân dòng phát triển Một vector sử dụng mang hai gene tách biệt mã hóa cho hai tiểu phần, gene chịu điều khiển promoter riêng 3 Một vector sử dụng mang hai gene tách biệt mã hóa cho hai tiểu phần, hai gen chịu điều khiển promoter ( vector bixistron) Có thể thực điều hai gen nhân dịng tách biệt với trình tự IRES (trình tự DNA chứa vị trí gắn ribosom ), cho phép dịch mã đồng thời protein khac từ phân tử RNAtt Sự phiên mã cấu trúc “gen α- IRES- gen β” điều hòa promoter tín hiệu polyađenyl hóa Lưu ý phân tử mRNA dịch mã lần hai ribosome khác bám vào hai vị trí khác (đầu 5’ bình thường vịtrí IRES) Quá trình khác với dịch mã mRNA polycistronic vi khuẩn, nơi mà ribosome chạy dọc phân tử mRNA qua tất cảcác khung đọc mở có Các hệ thống đánh dấu chọn lọc cho vector biểu hiện: hệ thống biểu sử dụng để chọn lọc tế bào động vật có vú chuyển nhiễm giống với hệ thống tương tự vật chủ khác hầu hết phần Một số phương pháp chọn lọc thiết kế không để xác định tế bào chuyển nhiiễm mà để tăng sản lượng protein tái tổ hợp việc nhân bội vector biểu Hệ thống đihyđrofolat reductaza – methotrexat (DHFR- MTX) thuộc loại này, DHFR xúc tác việc khử đihyđrofolat thành tetrahyđrofolat, chất cần để tổng hợp purin, MTX chất ức chế cạnh tranh với DHFR Sự mẫn cảm với MTX vượt qua tế bào tạo thừa DHFR , nồng độ MTX tăng lên, gen DHFR tế bào nuôi cấy nhân bội ngồi cịn có hệ thống glutamine synthetaza- methionine sulfoximin(GS- MSX) VI ĐỘNG VẬT CHUYỂN GEN Trong thực tế, động vật biến đổi gen sử dụng để sản xuất protein tái tổ hợp sữa, lòng trắng trứng, máu, urin, huyết tương, kén tơ Ý tưởng đơn giản: tận dụng lợi chế sản sinh chất dịch để lắp ghép protein tái tổ hợp, với lợi việc tinh dễ dàng Sử dụng tuyến vú để sản xuất protein sữa phương pháp tiếp cận khám phá nhiều nhất.ngoài lợi ích để tạo hệ động vật biến đổi gen tốn kém, đội ngũ nhân viên có trình độ cao cần thiết, với sở thiết bị đặc biệt, tỷ lệ thành cơng thấp Có phương pháp để chuyển gen vào động vật - Các retrovirus nhiễm vào vào giai đoạn phôi sớm trước cấy vào nhận ưu điểm có hiệu việc cài nhập gen chuyển vào tế bào nhận, nhược điểm chuyển đoạn DNA có kích thước nhỏ, retrovirus cài vào nhân vật chủ - Vi tiêm vào nhân nguyên đực trương to trứng thụ tinh Khắc phục nhược điểm phương pháp dùng retrovirus, nhược điểm số nhiều gây biểu mức làm rối loạn sinh lý bình thường vật - Đưa tế bào gốc phôi cải biến gen vào phôi giai đoạn sớm trước cấy vào nhận ưu điểm tránh tính cài ngẫu nhiên gen chuyển V Hệ thống biểu tái tổ hợp thực vật V.1 Tế bào thực vật Nuôi cấy tế bào thực vật sử dụng để sản xuất sản phẩm tự nhiên cách 20 năm gần chúng dùng để sản xuất protein tái tổ hợp Các tế bào thực vật thích hợp cho nguyên liệu tái tổ hợp chúng sinh trưởng mơi trường tương đối đơn giản không cần bổ sung protein Nếu protein ngoại lai sản xuất nuôi cấy tế bào tiết môi trường, nhiều phần tích lũy tế bào, việc thu hồi tinh sản phẩm tiến hành mà khơng có nhiều protein nhiễm bẩn Các protein có nguồn gốc thực vật an tồn cho người protein có nguồn gốc từ tế bào động vật chất nhiễm bẩn virus thực vật tác nhân gây bệnh người Phương pháp thường sử dụng : Nuôi callus nuôi cấy dịch huyền phù tế bào chứa tế bào khối tế bào, sinh trưởng phân tán mơi trường lỏng Ni cấy dịch huyền phù thích hợp cho việc sản xuất sinh khối tế bào thực vật so với nuôi cấy callus, nuôi cấy dịch huyền phù trì thao tác tương tự với hệ thống lên men vi sinh vật ngập chìm mơi trường lỏng Một số protein tái tổ hợp sản xuất nuôi cấy tế bào thực vật Proteinđượcbiểuhiện Nhân tố sinh trưởng biểu mô người Hormone sinh trưởng người Albumin huyết người Loàithựcvật Nicotianatabacum N.tabacum N.tabacum,Solanumtuberosum Nhân tố sinh trưởng cá hồi N.tabacum α-interferon người Oryzasativa Hirudin(chống đông máu) N.tabacum Erythropoietin người N.tabacum α and β hemoglobin người N.tabacum (http://baigiang.violet.vn/present/show?entry_id=7578017) V.2 Cây chuyển gen http://bio3400.nicerweb.com/Locked/media/ch22/edible_vaccine.html Hệ vector thường sử dụng vector có nguồn gốc từ plasmid Ti vi khuẩn A.tumefaciens, vi khuẩn gram âm, có khả biến nạp đoạn gen vào thực vật,có hai vector thường sử dụng là: - Thứ vector đồng cài nhập - Thứ hai Vector kép có vùng khởi động chép DNA E.coli A tumefaciens Ứng dụng - Sản xuất vaccine chống bệnh infectious bursan desease virus (IBDV) gà chuyển vào cỏ Arabidopsis.Chuyển gen ORF2 virus gây bệnh viêm gan E vào cà chua, Pichia pastoris.Sản xuất vaccine viêm gan B chuối chuyển gen, cherry tomatillo (Physalis ixocarpa), yellow lupin, rau diếp cà chua.Chuyển LT-B E coli gây bệnh đường ruột vào khoai tây Tuy có nhiều ưu điểm động vật thực vật tốc độ biểu protein chậm, khả kiểm sốt việc biểu cịn thấp so với hệ thống biểu khác 2,Khả đường hóa khả giúp protein cuộn gấp so với tế bào động vật côn trùng (Sách ”Cơng nghệ sinh học phân tử- ngun lí ứng dụng ADN tái tổ hợp”Bernard R.Glick & Jack J Pasternak nhà xuất khoa học kỹ thuật xuất năm 2007) C KẾT LUẬN Rất nhiều protein cần biến đổi hậu dịch mã để thành proein hoạt tính nên phát triển hệ thống vector biểu eukaryote.Tất hệ thống vector biểu eukaryote có chung dạng bản: gen quan tâm gắn thêm trình tự giúp việc tiết tinh protein tái tổ hợp, điều khiển trình tự Promotor, polyadenyl hóa, kết thúc phiên mã Eukaryote Để đơn giản hóa cho trì thao tác AND tái tổ hợp, vector biểu Euk thường trì E.coli Tùy vào mục đích sử dụng mà lựa chọn hệ thống vector biểu nấm men trùng động vật có vú để sản xuất protein có đầy đủ biến đổi hậu dịch mã Nhưng hệ thống biểu tế bào côn trung lựa chọn hàng đầu ưu điểm ... revolution Academic Press) III BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔHỢP Ở TẾ BÀO ĐỘNG VẬT CÓ VÚ - Các hệ thống biểu tế bào động vật có vú có vai trị quan trọng để sản xuất protein tái tổ hợp với đầy đủ biến đổi... tái tổ hợp thực vật V.1 Tế bào thực vật Nuôi cấy tế bào thực vật sử dụng để sản xuất sản phẩm tự nhiên cách 20 năm gần chúng dùng để sản xuất protein tái tổ hợp Các tế bào thực vật thích hợp cho... đơn vị biểu vào gen AcMNPV GOI đoạn gen quan tâm Các tế bào côn trùng sau cấy AcMNPV tái tổ hợp tạo vết tan trình chọn lọc do tế bào có AcMNPV tái tổ hợp gen polyheđrin bị bất hoạt, cịn tế bào khơng