Công nghệ sinh học ( phần 4 ) Dung hợp protoplast và lai vô tính tế bào thực vật Các phương pháp lai tế bào thực vật - dung hợp tế bào trần được ứng dụng trong tạo giống thực vật. Hiện nay có các phương pháp dung hợp tế bào trần như sau : 1. Xử lý bằng NaNO 3 Năm 1970, Power và cs. Đã dung NaNO 3 (0,25 M) kích thích dung hợp hai protoplast. Carlson và cs. (1972) cũng dung phương pháp này để sản xuất cây lai đầu tiên (Nicotiana glance × N. langsdorffii). Tuy nhiên phương pháp này cho hiệu suất thấp vì NaNO 3 không thích hợp với tế bào bị không bào hoá mạnh như protoplast từ nhu mô lá. 2. Xử lý bằng PEG Tác nhân kích thích dung hợp là PEG (polyethylene glycol). Nồng độ và trọng lượng phân tử của PEG quyết định sự thành công của thí nghiệm dung hợp. PEG có trọng lượng phân tử thấp (<100) không thể tạo ra một sự dính chặt chắc chắn, trong khi PEG trọng lượng phân tử 6000 cho hiệu quả dung hợp cao hơn. Xử lý PEG cùng với pH/Ca 2+ có hiệu quả tăng tần số dung hợp và khả năng sống sót của protoplast. PEG có hai tác dụng: hoặc cung cấp cầu nối để Ca 2+ có thể liên kết các bề mặt màng với nhau hoặc dẫn đến sự rối loạn điện tích bề mặt màng trong suốt quá trình rửa giải. 3. Dung hợp bằng điện Phương pháp này đơn giản hơn, nhanh hơn và hiệu quả hơn dung hợp bằng hóa chất. Điều quan trọng hơn cả là dung hợp bằng điện không gây độc đối với tế bào như thường tìm thấy ở các protoplast hoặc các thể dị nhân được xử lý bằng PEG. Senda và cs. (1979) là những người đầu tiên nghiên cứu theo hướng dung hợp bằng điện ở Rauwolfia. Sau đó Zimmermann và Scheurich (1981) cũng đã chứng minh rằng các protoplast có thể dung hợp bằng điện trường và đưa ra một protocol có thể sử dụng rộng rãi. Quá trình dung hợp bao gồm hai bước: Đầu tiên các protoplast được đưa vào một ngăn dung hợp nhỏ có 2 dây kim loại song song với nhau đóng vai trò là các điện cực. Tiếp theo, sử dụng điện áp thấp và trường AC dao động nhanh, kích thích các protoplast sắp xếp thành chuỗi tế bào giữa các điện cực. Phương pháp này cho phép tế bào tiếp xúc hoàn toàn với nhau trong một vài phút. Sau khi các tế bào xếp hàng hoàn chỉnh, quá trình dung hợp được thực hiện theo từng đợt ngắn của xung DC điện áp cao. Xung DC điện áp cao tạo ra sự phá vỡ thuận nghịch của màng nguyên sinh chất ở vị trí tiếp xúc của các tế bào, tạo ra sự dung hợp và tái tổ chức lại màng một cách hợp lý. Quá trình bắt đầu từ lúc đưa các protoplast vào bên trong ngăn và chuyển chúng lên môi trường nuôi cấy, có thể được hoàn chỉnh trong 5 phút hoặc ít hơn. Các thể dị nhân hình thành nhờ dung hợp bằng điện đã phân chia trong môi trường nuôi cấy và có khả năng tái sinh chồi hoặc cây lai soma. Phương pháp tạo tế bào trần trong lai tế bào Tế bào thực vật khác biệt với tế bào động vật về nhiều đặc tính trong đó có đặc tính là tế bào thực vật có thành cellulose bao quanh (cell wall) sau đó đến màng nguyên sinh (membrane). Thành cellulose giữ cho tế bào thực vật có hình dáng nhất định, còn các hợp chất pectin nằm trong thành có nhiệm vụ liên kết gắn các tế bào với nhau thành mô. Màng nguyên sinh cho phép protoplast có thể hấp thu vào tế bào các đại phân tử (acid nucleic, protein) thậm chí cả các cơ quan tử như lục lạp, ty thể. Nếu để các protoplast cạnh nhau, chúng có thể hòa làm một, đó là hiện tượng dung hợp tế bào. Nếu các protoplast có nguồn gốc từ các tế bào soma thuộc các giống, loài hoặc chi dung hợp lại thì có thể dẫn đến hiện tượng lai tế bào soma. Có một số phương pháp phân lập protoplast sau đây: 1. Phương pháp cơ học Cho miếng mô vào dung dịch ưu trương để khối tế bào chất cùng màng sinh chất tách khỏi vỏ cellulose. sử dụng kim nhọn và dao phẩu tích để cắt các mô cùng lớp vỏ, sau đó ngâm vào môi trường nuôi cấy pha loãng, tế bào chất sẽ phồng to và tách khỏi vỏ cellulose ra ngoài, tạo thành các protoplast tự do. Phương pháp này cho hiệu suất thấp. Sự phân lập protoplast của thực vật bậc cao bằng phương pháp cơ học được Klercker tiến hành đầu tiên vào năm 1892. Nói chung, các protoplast được phân lập từ các tế bào không bào hóa cao của các mô dự trữ như chồi hành (bulbs) và vảy hành (scales) của các loài thân hành, rễ củ cải, vỏ quả giữa của dưa chuột và rễ củ cải đường. 2. Phương pháp sử dụng enzyme Phương pháp này có hiệu quả cao hơn rất nhiều so với phương pháp cơ học. Phương pháp enzyme cho phép tách được hàng gram protoplast. Do vách tế bào có thành phần gồm pectin, cellulose, hemicellulose, nên sử dụng enzyme pectinase, cellulase, hemicellulase để phân hủy lớp vỏ tạo tế bào trần. Tùy theo loại mô và cây được sử dụng, người ta thay đổi nồng độ enzyme thích hợp. Protoplast thực chất là tế bào trần không có thành nên có thể tách được từ nhiều nguồn khác nhau như các bộ phận của cây (lá, rễ, hạt phấn …), callus, tế bào đơn,… Để protoplast không bị vỡ sau khi thành cellulose bị phân hủy, phải bổ sung những chất tăng áp lực vào dung dịch enzyme để duy trì thẩm thấu giữa nội bào và môi trường bên ngoài Phương pháp gây đa bội Năm 1895 lần đầu tiên Hugo De Vries tìm ra một dạng đa bội trong tự nhiên ở cây Oenothera lamarckiana. Cây này có kích thước khổng lồ và sinh trưởng rất nhanh. Nhưng mãi đến 1907, sau công trình nghiên cứu về tế bào học của Lute người ta mới biết nó là một cây tứ bội. Bằng phương pháp gây mô tái sinh, Winkler (1916) là người đầu tiên đã thu được những dạng đa bội ở một số loài cà như Solanum nigrum và S. lycopersicum. Phương pháp này khá đơn giản: khi cây con được 6; 7 lá thật thì khía 1/2 ngọn cây rồi ghép trở lại chổ cũ, hoặc cắt ngọn chính và những cành bên. Sau 10-14 ngày, từ vết ghép hoặc chổ bị thương tổn sẽ hình thành nên những cành mới. Trong số những cành như vậy, có thể có một số là đa bội. Nguyên nhân gây ra hiện tượng đa bội ở phương pháp này có thể là do sự hình thành các cành đa bội từ những mô đã bị phân hoá sau khi xử lý hoặc do sự kết hợp nhân giữa các tế bào của các mô sát thương. Với phương pháp dùng tia Rơnghen để xử lý, lần đầu tiên vào năm 1930 Goodspeed và Demol đã thu được những dạng đa bội ở thuốc lá và một số cây khác. Bằng phương pháp lai cũng có khả năng thu được những dạng cây đa bội. Có ý nghĩa lớn nhất là công trình của Carpesenco (1927) khi lai giữa củ cải Raphanus sativus với bắp cải Brassica oleracea, con lai thu được bất thụ, nhưng dạng dị tứ bội của nó lại hữu thụ cao. Song, việc tạo dạng đa bội bằng những tác nhân hoá học vẫn là phương pháp được nhiều người chú ý và có hiệu quả nhất. Ngay từ 1896 Gheraximop đã dùng clorofooc, ete, cloralhydrat tác động đến tảo Spyrogyra. Tuy nhiên, chỉ sau những công trình thực nghiệm của Blakeslee và Avery (1937) về việc sử dụng chất colchicine thì vấn đề đa bội thể thực nghiệm mới có những bước tiến khổng lồ. Cùng với Blakeslee và Avery, những công trình rất có giá trị tiếp theo của Levan, Dustin, Kostov, Navasin, Gheraximop, Lương Đình Của v.v. đã mở ra một kỷ nguyên mới trong phương pháp gây đa bội thể thực nghiệm. Khi sử dụng colchicine người ta rút ra những kết luận sau: (i) Colchicine ở dạng dung dịch có khả năng khuếch tán mạnh vào các mô thực vật; (ii) Hiện tượng đa bội hoá chỉ xảy ra do tác dụng của colchicine đến những mô đang phân chia mạnh; (iii) Khả năng cho cây đa bội tăng lên trong những điều kiện gieo trồng tốt; (iv) Thời gian xử lý thích hợp tuỳ thuộc vào thời gian phân bào khác nhau của các loài cây; (v) Nồng độ colchicine được sử dụng tuỳ từng loài cây. Phương pháp xử lý và thời gian xử lý Colchicine là một alkaloid có ở nhiều loài thực vật, nhưng chủ yếu là ở loài Colchicum autumnale (tập trung ở vùng Địa trung hải). Bộ phận của đối tượng được xử lý có thể là hạt, mầm cây, chồi, nách, rễ, hoa Colchicine rất dễ tan trong nước, ở dạng dung dịch nó khuếch tán rất mạnh vào các mô. Trong phạm vi nồng độ từ 0,01% - 1% colchicine đều gây hiệu quả. Nhưng nồng độ thông dụng nhất cho mọi cây trồng là 0,2%. Khi xử lý colchicine ở nồng độ cao, thời gian ngắn cho hiệu quả hơn khi xử lý nồng độ thấp, thời gian dài. Thời gian xử lý có thể thay đổi từ vài giờ cho đến vài ngày hoặc hơn. Tuy nhiên, nếu thời gian xử lý quá ngắn thì hiệu quả rất thấp. Theo Dermen, nếu thêm vào dung dịch colchicine một vài giọt glycerin thì hiệu quả có thể tăng.  Kỹ thuật xử lý Xử lý hạt hay mầm: Phương pháp xử lý hạt áp dụng cho nhiều loại cây có hạt nhỏ và dễ nảy mầm. Nồng độ thích hợp nhất là 0,1% và 0,2%, xử lý từ 3 giờ đến vài ngày hoặc hơn. Trong một giới hạn nhất định khi nhiệt độ tăng thì hiệu quả tác dụng của colchicine tăng. Đơn giản nhất là ngâm hạt khô vào trong dung dịch colchicine hay đặt trên lớp giấy thấm có tẩm colchicine. Đối với hạt to và khó nảy mầm, nếu xử lý trực tiếp hạt khô vào colchicine thì hiệu quả rất kém, mà trước đó phải ngâm hạt bằng nước. Phương pháp xử lý mầm cho hiệu quả cao nhất. Phương pháp chung la ngâm hạt đang nảy mầm vào dung dịch vào dung dịch xử lý. Với từng loại cây thời gian và nồng độ xử lý mầm thích hợp có khác nhau. Ở những hạt nảy mầm đã có rễ hay cây con thì chỉ xử lý mầm bằng cách đặt ngược mầm vào dung dịch colchicine chứa trong đĩa Petri qua lớp vaỉ màn hoặc thấm colchicine lên mầm bằng bàn chải mềm. Ví dụ: - Lúa (Lương Đình Của, 1951): Đặt hạt trong đĩa Petri cho nảy mầm. Khi mầm dài 3 -5 cm dùng dao khía xiên một nhát ở gốc mầm. Kẹp một sợi bông thấm nước có tẩm dung dịch colchicine 0,05 - 0,1% hoặc rỏ dung dịch colchicine ấy vào vết cắt. Xử lý 2 lần /1 ngày. Sau lần xử lý thứ hai rửa sạch mầm và trồng trong nhà kính. - Củ cải (Taraxevich, 1965): Ngâm hạt nảy mầm trong dung dịch colchicine 0,05%-0,1% trong 6-12 giờ hoặc ngâm mầm non trong dung dịch colchicine 0,1% trong 6 giìơ. - Ngô (Sumnui, 1961)" Hạt sau khi nảy mầm ngâm vào dung dịch colchicine 0,2% trong 18-24 giờ. Cũng có thể xử lý như sau: Khi chồi mầm dài 2-3cm khía một nhát ở gốc mầm rồi nhét vào đấy một lát bông có tẩm dung dịch colchicine 0,2% một ngày đêm; tẩm ướt lát bông bằng colchicine 2-3 lần. Xử ký các bộ phận khác của cây - Ở cây thuộc họ Hoà thảo (Poaceae) phương pháp xử lý cho hiệu quả cao: ngâm toàn bộ rễ vào dung dịch xử lý. Ngâm luân phiên 12 giờ ở dung dịch xử lý rồi lại 12 giờ ở trong nước. - Với các mầm nách, người ta đặt lên đấy hỗn hợp ở dạng sền sệt của colchicine với lanonin hay tiêm trực tiếp dung dịch colchicine vào mầm. - Với hoa, có thể ngâm trực tiếp vào dung dịch colchicine 0,02-0,05%. Ngoài colchicine, để gây tạo cây đa bội người ta còn hay dùng chất acenaphthen. Vì chất này tan rất kém trong nước, nên thường được dùng ở nồng độ thấp. Ví dụ, với hạt lúa mì dùng dung dịch acenaphthen 0,002%. . Công nghệ sinh học ( phần 4 ) Dung hợp protoplast và lai vô tính tế bào thực vật Các phương pháp lai tế bào. Đã dung NaNO 3 (0 ,25 M) kích thích dung hợp hai protoplast. Carlson và cs. (1 97 2) cũng dung phương pháp này để sản xuất cây lai đầu tiên (Nicotiana glance × N. langsdorffii). Tuy nhiên phương. lồ và sinh trưởng rất nhanh. Nhưng mãi đến 1907, sau công trình nghiên cứu về tế bào học của Lute người ta mới biết nó là một cây tứ bội. Bằng phương pháp gây mô tái sinh, Winkler (1 91 6) là