Chơng iii Các kỹ thuật công nghệ nuôi cấy mô, tế bào thực vật I.nhân giống vô tính in vitro ( vi nh© nh©n giè gièng c©y trå trồng ) 1.Khá 1.KháI niệ niệm chung Nhân giống vô tính in vitro:
Là trình sản xuất lợng lớn hoàn chỉnh, từ phận, quan nh chồi, mắt ngủ, vảycủ, đoạn thân, lá, mẹ ban đầu thông qua kỹ thuật nuôi cấy in vitro Nhân nhanh in vitro đợc ứng dụng vào:
Duy trì nhân nhanh kiểu gen quí làm vật liệu cho công tác giống
Nhân nhanh loài hoa, cảnh khó trồng hạt
Duy trì nhân nhanh dòng bố mẹ dòng lai để tạo hạt giống rau, hoa trồng khác
Nhân nhanh kết hợp với làm virus
Bảo quản nguồn gen in vitro u điểm kỹ thuật nhân nhanh in vitro:



Phơng pháp có hệ số nhân cao cho cá thể tơng đối đồng mặt di truyền Có thể nhân giống trồng qui mô công nghiệp (kể đối tợng khó nhân phơng pháp thông thờng) Dễ dàng tạo đợc virus Các sau nhân in vitro có xu hớng đợc trẻ hoá >nâng cao hiệu nhân phơng pháp thông thờng sau Hạn chế kỹ thuật nhân nhanh in vitro:


Chi phÝ cao so với phơng pháp nhân giống vô tính khác nên giá thành không cạnh tranh Không phải loài vi nhân giống Một số loài trồng dễ bị biến dị nhân giống in vitro 2.Các bớc nhân vô tính in vitro Lấy mẫu Bớc I Nuôi cấy khởi động B−íc B−íc Nh©n nhanh lùa chän c©y mĐ Vi giâm cành Thích nghi Bớc Ra rễ Bớc Giai đoạn vờn ơm Chuyển môi trờng tự nhiên Hình 27 Các bớc nhân trồng nu«i cÊy m« Nguån: Robert N Trigiano Dennis J Gray, 2000 Bớc 0: Chọn lọc chuẩn bị mẹ


Trớc tiến hành nhân giống in vitro cần chọn lọc cẩn thận mẹ (cây cho nguồn mẫu nuôi cấy) Các cần phải bênh, đặc biệt bệnh virus giai đoạn sinh trởng mạnh Việc trồng mẹ điều kiện môi trờng thích hợp với chế độ chăm sóc phòng trừ sâu bệnh hiệu trớc lấy mẫu cấy làm giảm tỷ lệ mẫu nhiễm, tăng khả sống sinh trởng mẫu cấy in vitro Bớc 1: Nuôi cấy khởi động Là giai đoạn khử trùng đa mẫu vào nuôi cấy in vitro Giai đoạn cần đảm bảo yêu cầu: Tû lƯ nhiƠm thÊp, tû lƯ sèng cao, m« tån sinh trởng tốt -Khi lấy mẫu cần chọn loại mô, giai đoạn phát triển cây: mô non, chuyên hoá ( đỉnh chồi, mắt ngủ, non, vảy củ ) -Xác định chế độ khử trùng mẫu cấy thích hợp:thờng dùng chất: HgCl2 0,1% xư lý 5-10 phót, NaOCl, Ca(OCl)2 5-7% xư lý 15-20 phút, H2O2, dung dịch Br Bớc 2: Nhân nhanh   Là giai đoạn kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái vă tăng nhanh số lợng thông qua đờng: hoạt hoá chồi nách, tạo chồi bất định tạo phôi vô tính Vấn đề phải xác định đợc môi trờng điều kiện ngoaị cảnh thích hợp để có hiệu cao Theo nguyên tắc chung môi trờng có nhiều xytokinin kích thích tạo chồi Chế độ nuôi cấy thờng là: 25-270C, 16 chiếu sáng/ ngày, cờng độ ánh sáng 2000- 4000 lux Bớc 3: tạo in vitro hoàn chỉnh

Để tạo rễ cho chồi, ngời ta chuyển chồi từ môi trờng nhân nhanh sang môi trờng tạo rễ Môi trờng tạo rễ thờng đợc bổ sung lợng nhỏ auxin Một số chåi cã thĨ ph¸t sinh rƠ sau chun từ môi trờng nhân nhanh giàu xytokinin sang môi trờng không chứa chất điều tiết sinh trởng Đối với phôi vô tính thờng cần gieo chúng môi trờng chất điều tiết sinh trởng môi trờng có chứa nồng độ thấp xytokinin để phôi phát triển thành hoàn chỉnh Bớc 4: thích ứng in vitro điều kiện tự nhiên



Để đa từ ống nghiệm vờn ơm với tỷ lệ sống cao, sinh trởng tốt cần đảm bảo số yêu cầu: Cây ống nghiệm đn đạt tiêu chuẩn hình thái định (số lá, số rễ, chiều cao cây) Có giá thể tiếp nhận invitro thích hợp: giá thể sạch, tơi xốp, thoát nớc Phải chủ động điều chỉnh đợc ẩm độ, chiếu sáng vờn ơm nh có chế độ dinh dỡng phù hợp Các phơng thức nhân giống vô tính in vitro (Nguồn: E.F George, 1993) Meristem Nuôi cấy chồi đỉnh Nhân giống từ chồi nách Đỉnh chồi Mắt ngủ Mẫu cấy Phát sinh hình thái trực tiếp Nhân giống từ chồi bất định phôi vô tính Cây mẹ Cây Nuôi cấy đoạn thân Tạo chồi trực tiếp Tạo phôi trực tiếp Mẫu cấy Callus Phát sinh hình thái gián tiếp Callus Cây từ phôi Tạo chồi gián tiếp Cây Chồi bất định Tạo phôi gián tiếp Phôi vô tính Cây giống Huyền phù tế bào Hoạt hoá chồi nách
Sự phát triển chồi nách đợc kích thích cách loại bỏ u nuôi cấy đỉnh chồi đoạn thân mang mắt ngủ Theo phơng thức phát triển chồi diễn theo hai cách: -Cây phát triển trực tiếp từ chồi đỉnh chồi nách Trờng hợp thờng xảy nuôi cấy hai mầm nh thuốc lá, khoai tây, hoa cúc -Tạo cụm chồi từ chồi đỉnh chồi nách Trờng hợp hay gặp với mầm nh mía, lúa, Tạo chồi bất định

Trong trờng hợp cần phải thực trình phản phân hoá tái phân hoá tế bào để bắt tế bào soma hình thành chồi trực tiếp gián tiếp thông qua giai đoạn phát triển mô seo đối tợng mầm nh− lan, døa, chi, hoa loa kÌn th−êng gỈp phát triển qua giai đoạn dẻ hành (protocorm): lúc mẫu cấy tạo thành hàng loạt protocorm, thể tiếp tục sản sinh protocorm phát triển thành Tạo phôi vô tính

Tơng tự nh tạo chồi bất định, để tạo phôi vô tính cần phải thực trình phản phân hoá tái phân hoá tế bào để bắt tế bào soma hình thành phôi trực tiếp gián tiếp thông qua giai đoạn phát triển m« sĐo.Nh−ng ph«i v« tÝnh cã cÊu tróc l−ìng cùc bao gồm chồi mầm rễ mầm Các phôi vô tính tái sinh thành hoàn chỉnh sử dụng làm nguyên liệu sản xuất hạt giống nhân tạo Tạo phôi vô tính Sự hình thành phôi có bớc:
Sự phân hoá tế bào có khả phát sinh phôi: cần môi trờng giàu auxin Các tế bào có khả phát sinh phôi tế bào nhỏ, nhân lớn, nhiều hạch nhân, không bào, tế bào chất đậm đặc, giàu protein ARN thông tin
Sự phát triển tế bào phôi hình thành: cần môi trờng nghèo auxin Nồng độ cao auxin kích thích hình thành phôi vô tính nhng ức chế trình phân hoá phát triển phôi A B C Hình 28 Sự hình thành phôi vô tính cải dầu A: giai đoạn sớm (7-10 ngày); B: giai đoạn (10-14 ngày); C: giai đoạn cuối 10 Sản xuất hạt nhân tạo từ phôi vô tính Điều kiện:
Hệ thống sản xuất hạt giống nhân tạo phải có khả sản xuất với số lợng lớn thể phôi soma phôi soma đợc sản xuất đồng nhất, để đợc trồng trọt kỹ thuật truyền thống cách trực tiếp
Hệ thống sản xuất hạt nhân tạo phải đợc giới hóa không phụ thuộc vào thiết bị đắt tiền thỏa mnn yêu cầu vô trùng Sản xuất hạt nhân tạo từ phôi vô tính
  Các bớc tạo hạt nhân tạo Tạo huyền phù phôi vô tính môi trờng dinh dỡng với mật độ phù hợp bổ sung Na-alginate đợc làm tan nớc với nồng độ 2-4% Dùng pipet (máy nhỏ giọt) nhỏ 100-150àl huyền phù nêu có chứa phôi soma vào dung dịch CaCl2 (22,5%) Khi sinh phản ứng trao đổi ion Na-Ca hạt nhân tạo đợchình thành, có đủ độ cứng thích hợp Sau chuyển qua ngâm nớc làm cứng hạt 12 Sản xuất hạt nhân tạo từ phôi vô tính   Dùng Ca-alginate thờng hạt luôn ẩm ớt bề mặt, hiƯn ng−êi ta dïng mét lo¹i polymer Elvax 4260 để bao lớp alginate Giai đoạn làm khô hạt để giúp hạt nhân tạo dễ dàng bảo quản nẩy mầm cần thiết Kitto & Janick, đặt hạt cà rốt khay có chứa 25% polyoxyethylene để làm nớc, làm ớt lại hạt đợc tái sinh phát triển thành hoàn chỉnh Callus phôi hoá Cây mẹ Protocor m Cây mẹ Cụm phôi vô tính Tạo hạt nhân tạo Hạt nảy mầm in vitro Cây từ hạt nhân tạo Hạt tạo từ phôi vô tính Hạt tạo từ protocorm Cây in vitro vờn ơm Hạt nảy mầm in vitro Cây từ hạt nhân tạo 13 Nhân giống qua tạo củ in vitro Tạo củ khoai tây in vitro Nhân gièng qua t¹o cđ in vitro T¹o cđ loa kÌn in vitro 14 Các tồn nhân giống trồng nuôi cấy mô 1.Tính bất định mặt di trun (genetic instability)

   Mơc đích nhân giống in vitro tạo quần thể đồng (True-to-type) với số lợng lớn Tuy nhiên, số trờng hợp phơng pháp tao biến dị soma Tần số biến dị hoàn toàn khác không lặp lại tạo nuôi cấy tế bào mô sẹo có nhiều biến dị so với nuôi cấy chồi đỉnh Những nhân tố gây biến dị tế bào soma là; Kiểu di truyền (Genotype): Tần số biến dị ảnh hởng genotyp loài trồng khác Nói chung có mức bội thể cao dễ biến bị Số lần cấy chuyển (Subcultures) số lần cấy chuyển nhiều độ biến dị cao Theo Amstrong Phillips (1988): nuôi cấy lâu dài thờng gây biến dị nhiễm sắc thể Loại mô (Tissue): Nói chung nuôi cấy đỉnh sinh trởng nhân nhanh in vitro bị biến dị so với nuôi cấy quan khác Biến dị nhân giống dứa Cayen Chồi dị dạng Chồi bị sọc lá, bạch tạng 15 Các tồn nhân giống trồng nuôi cấy mô 2.Sự nhiƠm mÉu (explant contamination)   C¸c vi sinh vËt nh nấm, vi khuẩn nói chung bị loại trừ khử trùng mẫu đa vào nuôi cấy Tuy nhiên, mét sè lo¹i vi khuÈn nh−: Agrobacterium, Bacillus, Corylabacterium, Erwinnia Pseudomonas xâm nhiễm vào mô dẫn, tồn mô bắt đầu gây tác hại tế bào bắt đầu phân chia (sau 1-2 tuần nuôi cấy) Để khắc phục đợc tợng cần: Trớc hết cần phải lựa chọn mẹ tiêu chuẩn Có thể sử dụng số chất kháng sinh để chống tợng nhiễm khuẩn nấm Nhng mô thực vật mẫn cảm với kháng sinh có phản ứng đến kiểu di truyền cần thËn träng sư dơng kh¸ng sinh ChÊt kh¸ng sinh thờng gây huỷ hoại ty thể lạp thể nên có ảnh hởng đến di truyền tế bào chất Sự nhiễm mẫu cấy 16 Các tồn nhân giống trồng nuôi cấy mô 3.Việc sản sinh chất độc từ mô nuôi cấy (Toxic compounds phenol) Trong nuôi cấy mô thờng quan sát thấy tợng hoá nâu hay đen mẫu, mẫu khuyếch tán môi trờng Hiện tợng mẫu nuôi cấy có chứa nhiều chất tanin hydroxyphenol Thí dụ chất phenol eucomicacid tyramine đn làm hoá nâu mẫu lan Cattleya nuôi cấy Các phơng pháp loại trừ hoá nâu:  Bổ sung than hoạt tính vào môi trờng nuôi cấy (0,1 - 0,3%): phơng pháp đặc biệt có hiệu loài phong lan Phalenopsis, Cattleya Aerides Tuy nhiên than hoạt tính làm chậm trình nhân nhanh hấp phụ số chất điều tiết sinh trởng dinh dỡng cần thiết khác  Bổ sung polyvinyl pyrolidone (PVP) có tác dụng khử nâu hoá tốt mẫu số ăn quả, (táo, hồng)  Sử dụng mô non, gây vết thơng nhỏ khử trùng  Ngâm mẫu vào dung dịch ascorbic xytric vài trớc cấy  Nuôi cÊy mÉu m«i tr−êng láng, O2 thÊp, kh«ng cã ¸nh s¸ng (1 - tn)  CÊy chun mÉu liên tục(1-2ngày/lần) sang môi trờng tơi - tuần Sự tiết độc tố từ mẫu cấy 17 Các tồn nhân giống trồng nuôi cấy mô 4.Hiện tợng thuỷ tinh hoá (Vitrification)    Cây bị thuỷ tinh hoá- thân mọng nớc,trong suốt, khó sống đa môi trờng bị nớc mạnh Thờng xảy nu«i cÊy m«i tr−êng láng hay m«i tr−êng agar, trao đổi khí thấp Đặc biệt thờng xảy nuôi cấy táo, mận, hoa cẩm chớng, hoa đồng tiền hoa cúc Cây bị thuỷ tinh hoá thờng có hàm lợng lớp sáp bảo vệ thấp, cấu tạo có nhiều phân tử phân cực nên dễ hấp thụ nớc Cây in vitro thờng có mật độ khí khổng cao, khí khổng có dạng tròn không elip, khí khổng mở liên tục trình nuôi cấy Để tránh tợng thuỷ tinh hoá tiến hành số giải pháp:     Giảm hút nớc cách tăng nồng độ đờng chất gây áp suất thẩm thấu cao Giảm nồng độ chất chứa nitơ môi trờng Giảm sản sinh ethylen bình nuôi cấy Sư lý axit absixic hc mét sè chÊt øc chÕ sinh trởng Những công nghệ vi nhân giống trồng 1.Công nghệ vi nhân giống quang tự dỡng  Là bớc phát triển công nghệ nuôi cấy mô tế bào giáo s T Koyoki Kozai đề xuất nghiên cứu từ thập kỷ qua  Công trình nghiên cứu tập trung vào vấn đề nhân giống nuôi cấy mô môi trờng đờng nhng đợc điền khiển chủ động chế độ ánh sáng cung cấp CO2  Công nghệ đn đợc thử nghiệm thành công nhiều đối tợng trồng nh cà chua; khoai lang; rau spinach; da chuột; xà lách; keo; cà phê; xoài; tre; thông;  Công nghệ đợc tiếp tục hoàn thiện để làm sở cho hệ thống nhân giống công nghiƯp hãa (T Kozai; F.Afreen; S.M.A.Zobayed - 2005) 18 Nh÷ng công nghệ vi nhân giống trồng(tiếp) 



Lợi ích vi nhân giống sư dơng hƯ thèng quang tù d−ìng Tèc ®é sinh trỏng, chất lợng tỷ lệ sống mô thực vật đợc nâng cao tất các bớc nhân giống điều kiện tự dỡng Thiệt hại nhiễm mẫu đợc hạn chế không sử dụng ®−êng m«i tr−êng Tû lƯ ®ét biÕn cã thĨ đợc giảm đựoc nuôi điều kiện môi trờng giống tự nhiên Tự động hoá giảm đợc chi phí lao động Những công nghệ vi nh©n gièng c©y trång (tiÕp) 

Nhợc điểm: Chi phí cao cho việc điều khiển môi trờng ( ánh sáng, nhiệt độ, CO2, O2) Cây sinh trởng điều kiện vô trùng dẫn đến chi phí cao cho hệ thống bình nuôi chuyên dụng chuẩn bị giá thể Hộp nuôi sư dơng hƯ thèng quang tù d−ìng Dµi x Réng x Cao = 610 x 31 x 105 mm, thÓ tÝch 20 lÝt ( Zobayed et al., 2000) 19 20 ... ethylen bình nuôi cấy Sử lý axit absixic số chất ức chế sinh trởng Những công nghệ vi nhân giống trồng 1 .Công nghệ vi nhân giống quang tự dỡng  Là bớc phát triển công nghệ nuôi cấy mô tế bào giáo... phôi có bớc:
Sự phân hoá tế bào có khả phát sinh phôi: cần môi trờng giàu auxin Các tế bào có khả phát sinh phôi tế bào nhỏ, nhân lớn, nhiều hạch nhân, không bào, tế bào chất đậm đặc, giàu protein... Tần số biến dị hoàn toàn khác không lặp lại tạo nuôi cấy tế bào mô sẹo có nhiều biến dị so với nuôi cấy chồi đỉnh Những nhân tố gây biến dị tế bào soma là; Kiểu di truyền (Genotype): Tần số biến