i Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT –––––––––––––––––– MAI HƢƠNG NGHI£N CøU HO¹T TÝNH SINH HäC Vµ THµNH PHÇN HãA HäC TRONG RÔ C¢Y THæ PHôC LINH ( SMILAX GLABRA ROXB.) CñA VIÖT NAM Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. NGUYỄN QUỐC VƢỢNG HÀ NỘI, 2013 ii Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc của mình tới TS. Nguyễn Quốc Vượng, người thầy đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện luận văn này. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới mọi thành viên phòng Công nghệ Hóa dược, Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành luận văn này. Đồng thời tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới phòng hoạt chất sinh học - Viện Hóa sinh biển, phòng thử nghiệm sinh học - Viện Công nghệ sinh học và tập thể cán bộ Viện Hóa sinh biển đã giúp đỡ tôi thực hiện các nội dung của đề tài. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến lãnh đạo Viện và cơ sở đào tạo Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật đã tạo điều kiện cho tôi trong thời gian tôi học tập và hoàn thiện luận văn này. Cuối cùng, với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin bày tỏ lời cảm ơn tới những người thân trong gia đình, các anh chị em lớp CHST K15 những người đã luôn ủng hộ, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu. Đề tài luận văn được thực hiện tại phòng Công nghệ hóa dược – Viện Hóa sinh biển, theo tiến độ thực hiện đề tài VAST0402/13 – 14 thuộc Viện Hàn lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam. Hà Nội, Tháng 11 năm 2013 Tác giả luận văn Mai Hƣơng iii Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC iii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT vi DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH VẼ ix MỞ ĐẦU 1 MỤC ĐÍCH VÀ Ý NGHĨA KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI 3 CHƢƠNG 1 : TỔNG QUAN 4 1.1. Thực vật học và tác dụng chữa bệnh của Thổ phục linh (Smilax glabra Roxb.) 4 1.1.1. Thực vật 4 1.1.2. Tác dụng chữa bệnh 6 1.2. Astilbin và thành phần hóa học trong rễ cây Thổ phục linh 8 1.2.1. Astilbin 8 1.2.2. Thành phần hóa học trong rễ Thổ phục linh 9 1.3. Hoạt tính sinh học của rễ cây Thổ phục linh 13 1.4. Tình hình nghiên cứu cây Thổ phục linh trên thế giới và trong nước 16 1.4.1. Tình hình nghiên cứu trong nước 16 1.4.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước 17 CHƢƠNG 2: CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1. Phương pháp tạo các cao chiết và phân lập các hoạt chất 19 2.1.1. Phương pháp tạo cao chiết 19 2.1.2. Các phương pháp phân lập 20 2.1.2.1. Sắc ký lớp mỏng (thin layer chromatography- TLC) 20 2.1.2.2.Sắc ký lớp mỏng điều chế (Preparative thin layer chromatography – PTLC) 21 2.1.2.3. Sắc ký cột (Column chromatography- CC) 22 2.2. Phương pháp xác định cấu trúc 22 2.2.1. Phổ hồng ngoại (Infrared - IR) 22 2.2.2. Phổ tử ngoại (UV-VIS) 23 2.2.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 23 2.2.4. Phổ khối lượng (Mass spectrometry- MS) 24 iv Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 2.3. Phương pháp HPLC xác định hàm lượng các hợp chất 24 2.4. Phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học của các cao chiết 25 2.4.1. Hoạt tính độc tế bào invitro 25 2.4.1.1. Nguyên liệu 25 2.4.1.2. Phương pháp nuôi cấy tế bào invitro 25 2.4.1.3. Phép thử sinh học xác định hoạt tính gây độc tế bào (cytotoxic assay) 25 2.4.2. Hoạt tính chống oxy hóa 26 2.4.2.1. Phương pháp đo MDA 26 2.4.2.2. Phương pháp phân lập và nhân nuôi trực tiếp tế bào gan chuột 28 CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM 30 3.1. Phân lập astilbin, một số hợp chất và tạo các cao chiết TPL- EtOH, TPPL-As40 30 3.1.1. Phân lập astilbin và các hợp chất gần astilbin trên sắc ký lớp mỏng 30 3.1.1.1. Qui trình phân lập astilbin và các hợp chất gần astilbin theo SKLM 30 3.1.1.2. Số liệu phổ của các chất phân lập được 32 3.1.2. Khảo sát một số vùng nguyên liệu Thổ phục linh ở miền Bắc 33 3.1.2.1. Thu mua Thổ phục linh tại các vùng khảo sát 33 3.1.2.2. Quy trình chung phân lập và xác định hàm lượng astilbin từ rễ Thổ phục linh khô 35 3.1.3. Giám định thu mua mẫu và xử lý mẫu Thổ phục linh 37 3.1.3.1. Giám định mẫu thực vật 37 3.1.3.2. Thu mua và xử lý mẫu 37 3.1.4. Tạo các cao chiết TPL-EtOH, TPL-As40 38 3.2. Xác định hàm lượng astilbin trong các cao chiết TPL-EtOH, TPL-As40 39 3.2.1. Thiết lập thông số cho sắc ký lỏng 39 3.2.2. Thiết lập chương trình chạy 40 3.2.3. Thiết lập các điều kiện thí nghiệm cho hệ thống sắc ký lỏng 40 3.2.4. Thiết lập trình tự chạy cho các mẫu 41 3.2.5. Kiểm tra sự có mặt của hợp chất cần phân tích trong các mẫu 42 v Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 3.3. Thử nghiệm hoạt tính độc tế bào và hoạt tính chống oxy hóa của các cao chiết 45 3.3.1. Thử nghiệm hoạt tính độc tế bào các cao chiết TPL-EtOH, TPL- As40 45 3.3.2. Thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa 47 CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 49 4.1. Astilbin và một số hoạt chất tách được từ rễ Thổ phục linh 49 4.2. Khảo sát hàm lượng astilbin trong rễ TPL tại miền Bắc…….……….58 4.3. Cao chiết TPL-EtOH, TPL-As40…………………………………….58 4.4. Hàm lượng astilbin trong các cao chiết TPL-EtOH, TPL-As40 58 4.4.1. Kết quả xây dựng đường chuẩn định lượng astilbin 59 4.4.2. Đánh giá hàm lượng hợp chất astilbin trong mẫu cao chiết Thổ phục linh 61 4.5. Hoạt tính độc tế bào và hoạt tính chống oxy hóa của các dịch chiết 63 4.5.1. Kết quả sàng lọc tính độc tế bào trên 3 dòng tế bào ung thư KB, LU-1, MCF-7 63 4.5.2. Hoạt tính chống oxy hóa của các dịch chiết 65 KẾT LUẬN 67 KIẾN NGHỊ 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO 69 PHỤ LỤC 76 vi Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Viết tắt Viết đầy đủ Ac Nhóm axetyl ACN Axetonnitrin n-Bu Nhóm n-butyl BALB/c Chuột bạch tạng 13 C-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Cacbon 13 (Cacbon-13 Nuclear Magnetic Resonance) CC Sắc ký cột (Column chromatography) DCM Diclometan DMF N,N-Dimethylformamit DMSO Dimethylsulfoxid ((CH 3 ) 2 SO) DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl ED 50 Nồng độ bảo vệ tối thiểu 50% EMME Ethoxymethylenmalonat ESI-MS Phổ khối lượng phun mù điện tử (Electrospray Ionization Mass Spectrometry ) Et Nhóm etyl EtOAc Etyl axetat EtOH Etanol 1 H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Proton (Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy) HMBC Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết (Heteronuclear Multiple Bond Correlation) HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography) HTCO Hoạt tính chống oxy hóa vii Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ HSQC Phổ tương tác dị hạt nhân qua một liên kết (Heteronuclear Single Quantum Coherence) IC 50 Nồng độ ức chế 50% (Imhibitory Concentration 50%) IR Phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy) KB Tế bào ung thư biểu mô (Human Epidemoid Carcinoma) LU-1 Tế bào ung thư phổi (Human Lung Carcinoma) MCF-7 Dòng tế bào ung thư vú người (MCF-7 Human breast adenocarcinoma cell line) MTT 3-(4,5-dimetylthiazol-2-yl)2,5-diphenyltetrazoli bromua MCPBA m-Chloroperbenzoic acid MDA Malonyl dialdehyd MS Phổ khối lượng (Mass spectrometry) Me Nhóm metyl n-hx n-hexan NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân(Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy) OD Mật độ quang (Optical Density) PTLC Sắc ký lớp mỏng điều chế (Preparative thin layer chromatography) Ph Nhóm phenyl SRB Sulforhodamine B TBA Thiobarbituric acid TLC Sắc ký lớp mỏng (thin layer chromatography) TPL Thổ phục linh TPL-As40 Mẫu astilbin thô TPL-EtOH Mẫu cặn chiết cồn UV-VIS Phổ tử ngoại viii Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ s Singlet br Broad d Doublet dd Doublet of doublets t Triplet dm Doublet of multiplets q Quartet ppm Parts per million m Multiplet ix Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH VẼ Danh mục bảng Bảng 3.1: Hệ dung môi phân tích mẫu theo thời gian 41 Bảng 4.1: Cấu trúc phân tử của 3 hợp chất tách được rễ thổ phục linh 50 Bảng 4.2: Kết quả khảo sát hàm lượng astilbin trong rễ TPL tại 8 tỉnh miền Bắc 58 Bảng 4.3: Đường chuẩn, r 2 , LOD, LOQ của các chất astilbin 61 Bảng 4.4: Kết quả định lượng hàm lượng của astilbin trong các mẫu 62 Bảng 4.5: Kết quả sàng lọc tính độc tế bào trên dòng tế bào ung thư KB 63 Bảng 4.6: Kết quả sàng lọc tính độc tế bào trên dòng tế bào ung thư LU-1 64 Bảng 4.7: Kết quả sàng lọc tính độc tế bào trên dòng tế bào ung thư MCF-7 64 Bảng 4.8: Kết quả xác định hoạt tính chống oxi hóa 65 Danh mục hình vẽ Hình 1.1: Cây thổ phục linh 4 1.2: Công thức cấu tạo của astilbin 9 Hình 1.3. Dihydroflavonol được tách từ rễ thổ phục linh 10 Hình 1.4: Một số các flavonoid khác được tách ra từ RSG 11 Hình 1.5: Các phenylpropanoid glycoside được tách từ RSG 11 Hình 1.6: Lignan glycoside được tách từ RSG 12 Hình 1.7: Các polyphenol, phenolic acid và glycoside của nó được tách ra từ RSG 12 Hình 1.8: Các cấu từ phenolic mới được tách từ RSG 18 Hình 3.1: Sơ đồ tách astilbin và các hợp chất gần trên SKLM 31 Hình 3.2: Hình ảnh các mẫu Thổ phục linh ở các vùng 35 Hình 3.3: Sơ đồ phân lập astilbin từ rễ Thổ phục linh khô 36 Hình 3.4: Mẫu Thổ phục linh thân lá và củ tươi 37 x Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Hình 3.5: Hình ảnh mẫu Thổ phục linh tươi tại Tuyên Quang 38 Hình 3.6: Sơ đồ tạo cao chiết TPL-EtOH, TPL-As40, TPL-Đường 39 Hình 3.7: Sơ đồ trình tự chạy các mẫu 42 Hình 3.8: Sắc ký đồ của mẫu Thổ phục linh AE trên cột Zorbax Eclipse 43 XDB C 18 (4,6 x 150nm, 5µm) 43 Hình 3.9: Sắc ký đồ của mẫu Thổ phục linh- đường trên cột Zorbax Eclipse XDB C 18 (4,6 x 150nm, 5µm) 43 Hình 3.10: Sắc ký đồ của mẫu Thổ phục linh- AS4O trên cột Zorbax Eclipse XDB C 18 (4,6 x 150nm, 5µm) 44 Hình 3.11: Sắc ký đồ của mẫu Thổ phục linh- EtOH trên cột Zorbax Eclipse XDB C 18 (4,6 x 150nm, 5µm) 44 Hình 4.1: Chất 1 (Astilbin) 50 Hình 4.2: Phổ 1 H-NMR của astilbin 52 Hình 4.3: Phổ 13 C-NMR của astilbin 52 Hình 4.4: Engeletin 53 Hình 4.5: Phổ 1 H-NMR của engeletin 54 Hình 4.6: Phổ 13 C-NMR của engeletin 54 Hình 4.7: 3-O-caffeoyl-shikimic acid 55 Hình 4.8: Phổ 1 H-NMR của chất 3 56 Hình 4.9: Phổ 13 C-NMR của chất 3 57 Hình 4.10: Phổ HMBC của chất 3 57 Hình 4.11: Sắc ký đồ của hợp chất astilbin tại bước sóng 291 nm trên cột Zobax eclipse XDB C 18 60 Hình 4.12: Đồ thị đường chuẩn astilbin 60 Hình 4.13: Sắc ký đồ của mẫu thổ phục linh-As4O và astilbin trên cột Zorbax eclipe XBD C 18 (4,6 x 150 nm, 5µm) 61 [...]... hình nghiên cứu cây Thổ phục linh trên thế giới và trong nƣớc 1.4.1 Tình hình nghiên cứu trong nước Nhóm nghiên cứu của GS Trần Văn Sung- Viện Hóa Học –Viện Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam đã nghiên cứu phân lập astilbin và Dihydrokaempferol 3-O-α-L-Rhamnopyranosit từ rễ cây Thổ phục linh rồi chuyển hóa thành các hợp chất auronol, cho các nghiên cứu về hoạt tính điều hòa miễn dịch [2] Một nghiên cứu. .. Thành phần hóa học trong rễ Thổ phục linh Trong dịch chiết nước của rễ Thổ phục linh, polysaccharide chiếm hàm lượng rất lớn đến 32% trọng lượng mẫu khô, điều này giải thích vì sao rễ Thổ phục linh đã từng được sử dụng thay lương thực khi nạn đói xuất hiện ở Trung Quốc Rất nhiều các cấu tử có hoạt tính sinh học trong rễ Thổ phục linh, chúng quyết định dược học của rễ Thổ phục linh, đã được phân lập Trong. .. thành phần, cấu trúc hóa học cũng như hoạt tính sinh học của các cây thuốc càng được đề cao Việc nghiên cứu, khảo sát về thành phần hóa học và các hoạt tính sinh học của các loài cây thuốc tại Việt Nam, nhằm mục đích sử dụng chúng một cách hợp lí, khoa học và hiệu quả đang ngày càng có tầm quan trọng hơn Các cây thuốc quí trong các bài thuốc dân gian đã và đang được quan tâm nghiên cứu đầy đủ về hoạt. .. MeOH của rễ cây Thổ phục linh có dihydrokaempferol 3-O-α-Lrhamno-pyranosit và astilbin, trong đó astilbin có hàm lượng khá cao [18] Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học đã cho thấy Thổ phục linh có nhiều hoạt tính sinh học giá trị - Viện Ung thư,bệnh viên đại học Bắc Kinh, Trung Quốc đã nghiên cứu thành công tác dụng chống ung thư của Smilax glabra Roxb: Thổ phục linh có chất làm ức chế sự phát triển của. .. Trên cơ sở này, chúng tôi đã quyết định chọn đề tài Nghiên cứu hoạt tính sinh học và thành phần hóa học trong rễ cây Thổ phục linh (Smilax glabra Roxb) của Việt Nam để tiến hành nghiên cứu - Bố cục của luận văn: Luận văn gồm 74 trang, trong đó có 8 bảng và 32 hình Phần mở đầu 2 trang; kết luận và kiến nghị 2 trang; tài liệu tham khảo 5 trang Nội dung của luận văn được chia làm bốn chương chính: - Chương... được quan tâm nghiên cứu đầy đủ về hoạt chất và hoạt tính sinh học, trong khuôn khổ các đề tài cấp Viện Hàn lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam, cây Thổ phục linh đã được lựa chọn nghiên cứu Thổ phục linh (Smilax glabra) vốn là một loại cây mọc hoang ở các vùng miền núi ở nước ta Từ rất lâu đời, trong Y học cổ truyền Việt Nam, thổ phục linh được sử dụng trong nhiều bài thuốc chữa các bệnh về gân cốt,... cao từ rễ Thổ phục linh với các mục tiêu đề ra là: - Phân lập hoạt chất chính astilbin và một số hoạt chất khác trong rễ cây Thổ phục linh - Tạo các cao chiết với hàm lượng astilbin cao - Xây dựng phương pháp định lượng hoạt chất astilbin các mẫu cao chiết - Thử hoạt tính sinh học về độc tế bào và hoạt tính chống oxy hóa của các cao chiết - Ý nghĩa khoa học của đề tài Đề tài có ý nghĩa khoa học và thực... 1.3 Hoạt tính sinh học của rễ cây Thổ phục linh Những nghiên cứu dược lý về Thổ phục linh đã bộc lộ dịch chiết methanol hay dịch chiết nước của nó có nhiều hoạt tính như: chống ung thư; hạ đường huyết; bảo vệ gan; điều hòa miễn dịch; chống viêm nhiễm, thấp khớp; kháng vi khuẩn và diệt côn trùng; chống men HIV-1 và tổ hợp HIV-1 Hoạt tính chống ung thư: Năm 2005, Thabrew và cộng sự [23] cũng đã nghiên cứu. .. thực tiễn cao Các kết quả của đề tài là cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo trong việc điều chế chế phẩm chống oxy hóa có giá trị cao từ rễ Thổ phục linh, nguồn nguyên liệu quí và phong phú ở nước ta Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 4 CHƢƠNG 1 : TỔNG QUAN 1.1 Thực vật học và tác dụng chữa bệnh của Thổ phục linh (Smilax glabra Roxb.) 1.1.1 Thực vật Thổ phục linh thuộc: - Họ Khúc khắc... gan.[25] Hoạt tính điều hòa miễn dịch: Một loạt các nghiên cứu về hoạt tính điều hòa miễn dịch của các loại dịch chiết rễ thổ phục linh và astilbin đã được công bố Năm 1993 [33], Xu và cộng sự đã công bố dịch chiết nước của thổ phục linh ức chế đáng kể phản ứng quá mẫn do tiếp xúc với picryl chloride Sau đó là các nghiên cứu sâu hơn về sự chuyển hóa, về cơ chế tác dụng hoạt tính điều hòa miễn dịch của astilbin . Astilbin 8 1.2.2. Thành phần hóa học trong rễ Thổ phục linh 9 1.3. Hoạt tính sinh học của rễ cây Thổ phục linh 13 1.4. Tình hình nghiên cứu cây Thổ phục linh trên thế giới và trong nước 16 1.4.1 tính sinh học và thành phần hóa học trong rễ cây Thổ phục linh (Smilax glabra Roxb) của Việt Nam để tiến hành nghiên cứu. - Bố cục của luận văn: Luận văn gồm 74 trang, trong đó có 8 bảng và. Thực vật học và tác dụng chữa bệnh của Thổ phục linh (Smilax glabra Roxb. ) 4 1.1.1. Thực vật 4 1.1.2. Tác dụng chữa bệnh 6 1.2. Astilbin và thành phần hóa học trong rễ cây Thổ phục linh 8 1.2.1.