BẢN TIN KHOA HỌC VÀ GIÁO DỤC 2014 16 NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM VI SINH HỮU ÍCH DÙNG TRONG SẢN XUẤT RAU SẠCH CN. Nguyễn Thị Huyền, TS. Lê Thị Loan Trường Đại học Yersin Đà lạt Tóm tắt Các chủng Trichoderma, B. subtilis, B. megaterium đều có khả năng phân giải tốt cellulose và đối kháng mạnh với nấm Fusarium. Số lượng tế bào có trong sinh khối thu được từ quy trình nuôi cấy đạt cao nhất là vi khuẩn B. pumillus (4.3.10 11 CFU/gam). Đánh giá qua thực nghiệm trên một số loại rau cho thấy sinh khối cả ba chủng vi khuẩn và nấm Tricoderma đều có ảnh hưởng tốt đến sự nảy mầm và phát triển của các cây rau cải ngọt, rau roman, cải bẹ xanh và rút ngắn thời gian thu hoạch cây rau roman xuống còn 21 ngày. Tỉ lệ bổ sung sinh khối 0.33% là tốt nhất ở các chủng nghiên cứu lên sự nảy mầm và phát triển của các cây rau và tốt nhất là sinh khối vi khuẩn B. pumillus. Abstract Culturing useful biologicals products in producing fresh vegetable Trichodema, B. subtilis, B. megaterium can resolve cellulose and strongly resist Fusarium fungi. The number of cells in the biomass obtained by the culture process bacteria reach the highest of B. pumillus (4.3.10 11 CFU/gram).Experimentally evaluating a number of vegetables showed all biomass of three strains of bacteria and fungi Tricoderma have a good impact on the germination and growth of the fresh vegetables, roman vegetables, mustard and shorten time to harvest roman vegetables to 21 days. Additional biomass ratio 0.33% is the best in the race researched on seed germination and growth of plants ,vegetables and the best is microbial biomass B. pumillus. Mở đầu Trước đ}y, để tăng năng suất v{ sản lượng trong trồng trọt, người d}n thường sử dụng ph}n bón hóa học v{ thuốc trừ s}u bệnh có nguồn gốc hóa học. Tuy nhiên, việc sử dụng n{y chỉ đem lại lợi ích trước mắt m{ không bảo đảm th}m canh c}y trồng bền vững, vì c|c sản phẩm có nguồn gốc từ chất hóa học l{m cho đất đai ng{y c{ng tho|i hóa, dinh dưỡng bị mất c}n đối, mất c}n bằng hệ sinh th|i trong đất, hệ vi sinh vật trong đất bị ph| hủy, tồn dư c|c chất độc hại trong đất c{ng nhiều dẫn đến ph|t sinh một số dịch hại không dự b|o trước, từ đó ảnh hưởng rất lớn đến sức khỏe con người v{ g}y ô nhiễm môi trường. Việc sử dụng chế phẩm sinh học nhất l{ ph}n bón hữu cơ vi sinh trong canh t|c c}y trồng đang l{ xu hướng của Việt Nam nói riêng v{ thế giới nói chung nhằm bảo đảm an to{n sinh học, an to{n thực phẩm v{ an to{n môi trường m{ vẫn đảm bảo năng suất, chất lượng cho trồng trọt, hướng đến một nền nông nghiệp sạch, ph|t triển bền vững. Nhận thấy tầm quan trọng v{ lợi ích của ph}n bón vi sinh mang lại, chúng tôi thực hiện đề t{i: “Nghiên cứu tạo chế phẩm vi sinh hữu ích dùng trong sản xuất rau sạch” nhằm hướng tới x}y dựng quy trình sản xuất chế phẩm vi sinh ở quy mô công nghiệp dùng cho sản xuất c}y rau sạch, an to{n. 1. Nội dung và phương pháp nghiên cứu 1.1. Nội dung nghiên cứu - Khảo s|t một số đặc điểm sinh học của c|c chủng vi sinh vật: Trichoderma, B. subtilis, B. megaterium và B. pumillus. - Nuôi cấy thu sinh khối c|c chủng vi sinh vật nghiên cứu. - Bước đầu thử nghiệm trên một số đối tượng c}y rau ở quy mô thí nghiệm. 1.2. Phương pháp nghiên cứu 1.2.1. Phương ph|p quan s|t hình th|i tế b{o nấm: Dùng phương ph|p nuôi cấy phòng ẩm. 1.2.2. Phương ph|p quan s|t hình th|i tế b{o vi khuẩn  Tiến hành làm tiêu bản trên một phiến kính sạch và nhuộm Gram. Những tế bào bắt màu tím thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương (+); Những tế bào bắt màu hồng thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm (-) 1.2.3. Kiểm tra khả năng ph}n giải cellulose của c|c chủng vi sinh vật bằng c|ch đo đường kính vòng thủy ph}n. 1.2.4. Kiểm tra khả năng kh|ng nấm bệnh Fusarium của các chủng nghiên cứu 1.2.5. Phương ph|p nuôi cấy thu sinh khối các chủng nghiên cứu; Theo sơ đồ sau: Hoàn nguyên Nhân giống cấp I Nhân giống cấp II Thu hồi sản phẩm Kiểm tra độ sống Thử nghiệm. 1.2.6. Phương ph|p kiểm tra độ sống theo phương ph|p Koch. BẢN TIN KHOA HỌC VÀ GIÁO DỤC 2014 17 1.2.7. Đ|nh gi| ảnh hưởng của Trichoderma, B. subtilis, B. megaterium và B. pumilus lên sự sinh trưởng v{ ph|t triển của một số loại rau: rau roman, rau cải ngọt, hạt cải bẹ xanh C|ch bố trí thí nghiệm: - C|c loại c}y được trồng trên c|c khay có kích thước như nhau v{ chứa cùng một loại đất với trọng lượng như nhau l{ 3kg đất v{ được chia th{nh c|c lô như sau:  Lô đối chứng: Là lô trồng không có chế phẩm vi sinh chỉ có đất.  Lô thử nghiệm 1: Trong đất trồng có chứa sinh khối c|c chủng vi sinh vật nghiên cứu được trộn đều theo tỉ lệ: 0,33%; 1% v{ 1,66%. Mỗi lô trồng 5 c}y rau v{ lặp lại trên 3 khay. - Theo dõi sự sinh trưởng v{ ph|t triển của c}y bằng c|ch đo chiều d{i của th}n, l|, số l| v{ mô tả hình d|ng c}y theo thời gian ph|t triển. - Quan s|t sự ph|t triển của bộ rễ c}y rau. 1.2.8. Phương ph|p xử lý số liệu Xử lý số liệu theo phương ph|p thống kê sinh học, so sánh và phân tích kết quả. Các số liệu được biểu thị dưới dạng trung bình, biểu đồ v{ được xử lý theo phần mềm SPSS và phần mềm Microsoft Excel. 2. Kết quả và bàn luận Bảng 2.1. Đường kính vòng phân giải cellulose của Trichoderma, B. subtilis, B. megaterium và B. pumilus Tên chủng Đường kính vòng phân giải (cm) Trichoderma 2 B. subtilis 5,7 B. megaterium 2 B. pumilus 0 Celulose l{ một cơ chất không ho{ tan, khó phân giải, là thành phần cấu tạo cơ bản của thành tế bào thực vật. Việc tổng hợp cellulose có quy mô phức tạp hơn hẳn việc tổng hợp những hợp chất kh|c. Do đó, vi sinh vật phân giải cellulose có vai trò đặc biệt quan trọng trong chu trình tuần hoàn Cacbon, cải tạo cấu trúc đất, tăng độ tho|ng khí, độ phì nhiêu, m{u mỡ cho đất. Trong qu| trình đó chúng tạo ra c|c chất dinh dưỡng dễ tiêu trong đất cung cấp cho c}y, một v{i chất có khả năng kích thích sinh trưởng của c}y trồng. a b c d e f g h i j Hình 2.1. Hình dạng khuẩn lạc và hình thái tế bào của các chủng vi sinh vật a. Khuẩn lạc Tricoderma; b: Bào tử Tricoderma; c. Khuẩn lạc B. subtilis; d. Bào tử B. subtilis; e. Khuẩn lạc B. megaterium; f. Bào tử B.megaterium; g. Khuẩn lạc B .pumilus; h. Bào tử B.pumilus; i. Khuẩn lạc nấm Fusarium; j. Bào tử Fusarium. BẢN TIN KHOA HỌC VÀ GIÁO DỤC 2014 18 Kết quả bảng 2.1 cho thấy c|c chủng Trichoderma, B. subtilis, B. megaterium đều có khả năng thủy ph}n CMC, trong đó chủng B. subtilis có khả năng thủy ph}n tốt nhất với đường kính vòng ph}n giải l{ 5,7 cm, riêng vi khuẩn B. pumilus không có hoạt tính cellulase nên không tạo th{nh vòng ph}n giải CMC. Hình 2.2. Vòng thủy phân CMC của các chủng vi sinh vật a. Trichoderma; b. B. subtilis; c. B. megaterium; d: B. pumilus Bảng 2.2. Khả năng đối kháng của Trichoderma với nấm Fusarium Tên chủng Tricho- derma Fusa rium Trichoderma + Fusarium Trichoderm a + + - Trichoderma: + - Fusarium: - B. subtilis + + - B. subtilis: + - Fusarium: - B. megaterium + + - B. megaterium: - - Fusarium: + B. pumilus + + - B. pumilus : + - Fusarium: - Ghi chú: (+) : Phát triển tốt; (-) : Không phát triển Kết quả bảng 2.3 cho thấy, khi cấy kiểm tra riêng rẽ từng chủng Tricoderma, B. subtilis, B. pumilus, B. megaterium và Fusarium trên môi trường thạch đặc trưng quan s|t thấy mỗi chủng đều ph|t triển tốt trên môi trường thạch.Tuy nhiên khi nuôi cấy chung từng chủng nghiên cứu với nấm gây bệnh Fusarium, nhận thấy: - Chỉ có nấm Tricoderma, B. subtilis, B. pumilus ph|t triển, không thấy khuẩn lạc của Fusarium trong môi trường thạch PGA v{ môi trường thạch YE. Điều đó chứng tỏ trong nấm Tricoderma đ~ tiết ra một loại enzym có khả năng l{m tan v|ch tế b{o của nấm g}y bệnh Fusarium, sau đó chúng có thể tấn công v{o bên trong lo{i nấm n{y v{ tiêu thụ chúng nên Fusarium không ph|t triển được [13]. - Tương tự, vi khuẩn B. subtilis vẫn ph|t triển được vì vi khuẩn n{y có nhiều đặc điểm ưu việt về khả năng tiết c|c hệ enzym ngoại b{o v{ những chất kh|ng khuẩn, nhất l{ chúng còn có khả năng tổng hợp hơn 20 loại kh|ng sinh kh|c nhau trong đó đặc biệt kh|ng sinh Bacilysocin l{ loại kh|ng sinh có bản chất phospholipid có tính kh|ng khuẩn mạnh với nấm [3],[4], do đó đ~ ức chế hoặc tiêu diệt được nấm Fusarium nên không tìm thấy sự có mặt của loại nấm n{y trên môi trường khi nuôi cấy chung với nhau. - Đối với vi khuẩn B .pumilus cũng có khả năng lấn |t được sự ph|t triển của nấm Fusarium vì ngoài chức năng thúc đẩy Rhizobacteria l{m tăng trưởng thực vật trong vùng rễ của c}y, B. pumilus cũng cảm ứng tính kh|ng của c}y để chống lại bệnh nấm có thể g}y thiệt hại cho c}y [2] vì vậy không tìm thấy nấm Fusarium trong môi trường. Trong bốn chủng khảo s|t, chỉ có vi khuẩn B. megaterium không có khả năng lấn |t nấm Fusarium nên chúng vẫn ph|t triển trong môi trường. Điều n{y có thể l{ do những hoạt chất sinh học do vi khuẩn B. megaterium tiết ra không phù hợp hoặc chưa đủ mạnh để ức chế sự ph|t triển của nấm Fusarium. a b c d a b c Hình 2.3. a. Nấm Tricoderma; b. Nấm Fusarium; c. Nấm Tricoderma ph|t triển trên môi trường PGA từ dung dịch nuôi cấy chung 2 chủng trên. Hình 2.4. a. Vi khuẩn B. subtilis; b.Nấm Fusarium; c.Vi khuẩn B. subtilis phát triển từ dung dịch nuôi cấy chung 2 chủng trên b c a a c b Hình 2.5. a. Vi khuẩn B. megaterium; b. Nấm Fusarium; c. Nấm Fusarium ph|t triển trong môi trường thạch dinh dưỡng từ dung dịch nuôi cấy chung 2 chủng trên BẢN TIN KHOA HỌC VÀ GIÁO DỤC 2014 19 2.3. Sơ đồ nuôi cấy thu sinh khối nấm Trichoderma 2.4. Sơ đồ nuôi cấy thu sinh khối vi khuẩn B. subtilis, B. megaterium và B. pumilus c a b Hình 2.6. a. Vi khuẩn B. pumilus; b.Nấm Fusarium; c. Vi khuẩn B. pumilus ph|t triển trong môi trường PGA thạch từ môi trường nuôi cấy chung 2 chủng trên Chủng giống Trichoderma Ho{n nguyên ở 30 o C/24 giờ Kiểm tra độ sống Nh}n giống cấp I ở 30 o C/ 5-7 ngày Nh}n giống cấp II ở 30 o C/ 5-7 ngày Nh}n giống thu sinh khối ở 30 o C/5-7 ngày Thu sinh khối Thử nghiệm 2.5. Kết quả kiểm tra độ sống Sau khi nuôi cấy thu được sinh khối c|c chủng nghiên cứu, tiến h{nh kiểm tra số lượng tế b{o có trong 1gam sinh khối, kết quả được trình bày qua bảng 2.3: Bảng 2.3. Kết quả kiểm tra độ sống nấm Trichoderma, B. subtilis, B. megaterium và B. pumilus Tên chủng Số lượng tế bào (CFU/gam) GTTB (CFU/gam) L1 L2 L3 Trichoderma 9 . 10 8 16 . 10 8 11 . 10 8 12 . 10 8 B. subtilis 3. 10 11 2.10 11 4 . 10 11 3 . 10 11 B. Megaterium 5 10 10 5 . 10 10 6 . 10 10 5.3 . 10 10 B. pumilus 4 . 10 11 5 . 10 11 4 . 10 11 4.3 . 10 11 Kết quả bảng 2.3 cho thấy sinh khối thu được từ 3 loạt theo sơ đồ sản xuất trên có số lượng tế b{o trong 1gam sinh khối thu được đạt chỉ tiêu kỹ thuật (>10 6 CFU/gam) (Theo một số tiêu chuẩn Việt Nam v{ tiêu chuẩn ng{nh về ph}n bón)[1]. Trong đó đạt cao nhất l{ vi khuẩn B. pumilus và B. subtilis (10 11 CFU/gam) v{ thấp nhất là Trichoderma chỉ đạt 10 8 CFU/gam. Điều đó cho thấy việc chọn môi trường v{ c|c điều kiện nuôi cấy phù hợp sẽ giúp đạt hiệu quả cao khi thu sinh khối, nhưng đối với nấm Trichoderma tỏ ra chưa phù hợp nên độ sống sinh khối vẫn chưa cao. (Phần còn lại đăng tiếp trong số 06 (7/2014) . nghiệp sạch, ph|t triển bền vững. Nhận thấy tầm quan trọng v{ lợi ích của ph}n bón vi sinh mang lại, chúng tôi thực hiện đề t{i: Nghiên cứu tạo chế phẩm vi sinh hữu ích dùng trong sản xuất rau. BẢN TIN KHOA HỌC VÀ GIÁO DỤC 2014 16 NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM VI SINH HỮU ÍCH DÙNG TRONG SẢN XUẤT RAU SẠCH CN. Nguyễn Thị Huyền, TS. Lê Thị Loan Trường Đại học Yersin. rau sạch nhằm hướng tới x}y dựng quy trình sản xuất chế phẩm vi sinh ở quy mô công nghiệp dùng cho sản xuất c}y rau sạch, an to{n. 1. Nội dung và phương pháp nghiên cứu 1.1. Nội dung nghiên