I. Các vector 1. Khái niệm Phân tử DNA có kích thước nhỏ, thường có dạng vòng, dùng để mang gene. 2. Đặc điểm: - Có khả năng sao chép độc lập. - Có thể thu nhận lượng lớn từ tế bào. - Mang gene chỉ thị cho quá trình sàng lọc (gene kháng kháng sinh, gene mã hóa cho enzyme chuyển hóa cơ chất). - Có những vị trí duy nhất của enzyme giới hạn. Chương 4 CÁC VECTOR VÀ SỰ TẠO DÒNG I. Các vector (tt) 3. Vector tạo dòng và vector biểu hiện - Vector tạo dòng: chuyển và lưu trữ gene tái tổ hợp trong tế bào chủ. - Vector biểu hiện: tạo ra sản phẩm của gene tái tổ hợp ở mức phiên mã, dòch mã, phân tích trình tự điều hòa sự biểu hiện của gene. 4. Phân loại: - Có nhiều loại vector: plasmid, cosmid, phage… - Dựa vào kích thước DNA mục tiêu và mục đích tạo dòng  chọn loại vector phù hợp. Plasmid: DNA ngắn, dạng vòng, nằm ngoài nhiễm sắc thể, được tìm thấy đầu tiên ở vi khuẩn. Plasmid thế hệ thứ I: plasmid tìm thấy trong tự nhiên. Plasmid thế hệ thứ II: plasmid nhân tạo, điển hình là pBR322. Plasmid thế hệ thứ III: plasmid mạnh nhất, có 2 đặc tính cơ bản: - Kích thước nhỏ  sao chép nhanh chóng. - Có mang polylinker (vị trí chứa các trình tự nhận biết duy nhất của enzyme cắt giới) Phage: virus xâm nhiễm và làm tan vi khuẩn. Hiệu quả xâm nhiễm cao hơn chuyển plasmid vào vi khuẩn, nhưng thao tác phức tạp. Cosmid: vector nhân tạo, có thêm trình tự cos của phage λ. Các vector là virus của Eukaryote như: retrovirus, SV 40, vaccinia, adenovirus… Nhiễm sắc thể nhân tạo của nấm men (YAC): vector tạo dòng những đoạn DNA có kích thước lớn. II. Các tế bào chủ - Tế bào tiếp nhận vector: + Duy trì vector bền vũng trong tế bào + Cho phép sao mã (nhân bản sao) vector bên trong tế bào + Cho phép biểu hiện gen được mang bởi vector - Tế bào chủ và vector phải tương thích với nhau về quá trình sao mã, phiên mã và dịch mã - Tế bào chủ thường không ở dạng tự nhiên mà là dạng đột biến chứa kiểu gen đáp ứng với vector và mục đích tạo dòng hoặc biểu hiện gen. - Tế bào chủ: tế bào vi khuẩn hoặc tế bào Eukaryote (tế bào động vật, thực vật, nấm men). III. Sự tạo dòng Mục đích: thu được lượng lớn bản sao một trình tự DNA xác định. Các bước cơ bản: 1. Chọn và xử lí vector: 2. Xử lí DNA cần tạo dòng. 3. Tạo vector tái tổ hợp. 4. Chuyển vector tái tổ hợp vào tế bào chủ 5. Phát hiện dòng cần tìm 1. Chọn và xử lí vector: Chọn vector phụ thuộc vào: kích thước DNA tạo dòng và mục đích Sử dụng enzyme cắt hạn chế thích hợp để cắt mở vòng. So sánh vector theo kích thước DNA mục tiêu - Plasmid: nhỏ hơn 8kb (trừ plasmid từ F – BAC) - Phage λ: đến 20kb - Phage P1: đến 100kb - Plasmid từ F (BAC): đến 300kb Vector mang được đoạn gen lớn cần cho việc thiết lập các ngân hàng gen 2. Xử lí DNA cần tạo dòng: Cần xác định nguồn thu nhận DNA. Sử dụng phương pháp đặc hiệu thu nhận DNA mục tiêu: tách chiết DNA bộ gene; tổng hợp hóa học… Xử lí DNA mục tiêu với enzyme cắt hạn chế thích hợp: sử dụng enzyme cắt tạo đầu so le hoặc enzyme tạo đầu bằng để tạo đầu tương thích với 2 đầu của vector đã xử lí. 3. Tạo vector tái tổ hợp Thực hiện phản ứng nối giữa DNA mục tiêu và vector (theo tỉ lệ 3:1 hoặc 2:1). 4. Chuyển vector tái tổ hợp vào tế bào chủ: Sử dụng bộ máy của tế bào chủ để sao chép vector tái tổ hợp. Phương pháp chuyển gene vào tế bào:  Biến nạp (transformation): - Biến nạp: sự tiếp nhận DNA trần bởi tế bào - Các kĩ thuật sử dụng: + Sử dụng Calcium phosphate (hoặc Calcium clorua): hình thành phức hợp DNA-calcium, chuyển vào tế bào qua cơ chế thực bào. + Điện biến nạp (electroporation): sử dụng dòng điện có điện áp cao, tạo lỗ thủng trên màng tế bào, DNA dễ xâm nhập vào bên trong tế bào. + Kĩ thuật tiêm (injection): DNA được bắn vào tế bào dưới dạng bọc quanh những viên đạn cực nhỏ, hoặc được tiêm thẳng vào tế bào. Tạo tế bào E. coli khả nạp (competent cell) và biến nạp DNA - Đa số tế bào không có khả năng biến nạp - Tế bào có thể được xử lý để trở nên có khả năng tiếp nhận DNA trần: sự tạo tế bào khả nạp (competent cell). [...]... IV Thư viện gene Dựa vào bản chất của DNA cần tạo dòng, có 2 loại thư viện gene - Thư viện bộ gene (genomic library): tập hợp tất cả các trình tự DNA cấu thành bộ gene đã được gắn vào vector Cách tiến hành: Tách chiết DNA bộ gene  cắt bộ gene thành những đoạn có kích thước xác định  dòng hóa vào vector  chuyển gene vào tế bào chủ  nuôi cấy trên môi trường và tạo thành các dòng (clone) Ứng dụng:... mã bộ gene - Tạo dòng các trình tự DNA không mã hóa -Thư viện cDNA (cDNA library): tập hợp các bản sao của cDNA từ tất cả các mRNA của tế bào - Thư viện cDNA mang tính đặc trưng của tế bào rất cao vì chỉ có 1 số gene được phiên mã thành mRNA -Kích thước của cDNA không lớn  chọn vector dòng hóa dễ dàng Cách tiến hành: tách chiết, thu nhận mRNA  cDNA  dòng hóa vào vector  chuyển gene vào tế bào chủ... dàng Cách tiến hành: tách chiết, thu nhận mRNA  cDNA  dòng hóa vào vector  chuyển gene vào tế bào chủ  nuôi cấy trên môi trường và tạo thành các dòng (clone) • Bài tập: Cho gene A (kích thước 300 bp) có trình tự như sau: Trình bày cách thu nhận và dòng hóa gene vào vector pEGFP-N1? SalI EcoRI Xho I Gene A HindIII BamHI SalI ... kháng thể đặc trưng cho protein mã hóa + Vector sử dụng là vector cho phép dịch protein mã DNA thành Phương pháp sử dụng trình tự DNA bổ sung cho gene cần tìm • Tổng hợp các trình tự DNA ngắn và đánh dấu ở đầu 5’ bằng đồng vị phóng xạ hoặc bằng hóa chất nhờ enzyme polynucleotide kinase • Tiến hành lai các trình tự DNA ngắn trên với các dòng trong thư viện gene Dòng tái tổ hợp được phát hiện bằng kĩ thuật... Tải nạp (transduction): Quá trình chuyển gene vào tế bào nhờ vector là virus Ưu điểm: hiệu quả chuyển gene cao Virus sử dụng trong quá trình tải nạp được loại bỏ một phần bộ gene, gắn thay vào đó đoạn DNA cần nghiên cứu 5 Phát hiện dòng cần tìm Tách chiết thu nhận vector tái tổ hợp và kiểm tra bằng enzyme cắt Vector tái tổ hợp sẽ có kích thước lớn hơn vector ban đầu Sử dụng mẫu dò: - Kháng thể đặc...Chuyển gen vào tế bào khác vi khuẩn - Nấm men: tạo competent cell bằng xử lý với lithium chloride hoặc lithium acetate; sử dụng xung điện (electroporation); - Nấm mốc: electroporation, protoplast -Tế bào thực vật: biến nạp bằng Agrobacterium tumefaciens electroporation, súng bắn gene - Tế bào động vật: biến nạp, vi tiêm a) Electroporation Phương pháp chuyển gene vào tế bào (tt)  Tải nạp . hạn. Chương 4 CÁC VECTOR VÀ SỰ TẠO DÒNG I. Các vector (tt) 3. Vector tạo dòng và vector biểu hiện - Vector tạo dòng: chuyển và lưu trữ gene tái tổ hợp trong tế bào chủ. - Vector biểu hiện: tạo. định. Các bước cơ bản: 1. Chọn và xử lí vector: 2. Xử lí DNA cần tạo dòng. 3. Tạo vector tái tổ hợp. 4. Chuyển vector tái tổ hợp vào tế bào chủ 5. Phát hiện dòng cần tìm 1. Chọn và xử lí vector: . kích thước xác định  dòng hóa vào vector  chuyển gene vào tế bào chủ  nuôi cấy trên môi trường và tạo thành các dòng (clone). Ứng dụng: - Giải mã bộ gene. - Tạo dòng các trình tự DNA không