10 Đại học Vinh Tạp chí khoa học, tập XXXV, số 1A-2006 Nhân nhanh giống hoa đồng tiền bằng kỹ thuật nuôi cấy mô Mai Văn Chung (a) , Phùng Văn Hào (b) Tóm tắt. Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống vô tính cây đồng tiền bằng kỹ thuật nuôi cấy mô in vitro, bớc đầu, chúng tôi thu đợc kết quả: Chồi đỉnh ngọn trớc khi đa vào nuôi cấy in vitro đợc khử trùng kép bằng cồn 70 0 trong 1 phút và HgCl 2 0,1% trong 10 phút; Môi trờng nhân nhanh chồi đồng tiền: MS + 50g/l saccaroza + 6,5 g/l agar + 1,5mg/l BAP + 15% nớc dừa; Môi trờng ra rễ cho chồi đồng tiền: MS + 50g/l saccaroza + 6,5 g/l agar + 1,0 mg/l -NAA. I. Đặt vấn đề Cây đồng tiền (Gerbera jamesonii B.) là một loài thuộc họ Cúc (Asteraceae) cho hoa quanh năm. Hoa đồng tiền đợc coi là một trong 10 loại hoa đẹp nhất trên thế giới (chỉ xếp sau hoa hồng, cúc, cẩm chớng, lay ơn) [2, 4]. ở Việt Nam, hiện có rất nhiều giống hoa đồng tiền đang đợc trồng với những u điểm: hoa to, cánh dày, xếp nhiều tầng, màu sắc phong phú, dáng hoa đẹp, cho năng suất cao. Tuy nhiên, khó khăn trong sản xuất hoa đồng tiền là nguồn giống cung cấp cho quá trình trồng trọt chủ yếu là cây tách thân, mặc dù sinh trởng mạnh trong giai đoạn đầu nhng đến giai đoạn trởng thành và ra hoa, cây sinh trởng chậm, nhanh già cỗi, chất lợng hoa kém. Bên cạnh đó, phơng pháp tách thân tạo ra số lợng cây không nhiều trong mỗi lần nhân giống [2, 4]. Kỹ thuật nhân giống vô tính in vitro khắc phục đợc những hạn chế trên, cho phép chủ động sản xuất ra một lợng lớn cây giống, có độ đồng đều cao và chất lợng tốt [1]. Hiện nay, đã có nhiều nghiên cứu về quy trình nhân giống vô tính hoa đồng tiền đợc công bố [2, 3, 4]. Tuy nhiên, việc tiếp tục hoàn thiện cũng nh đề xuất quy trình kỹ thuật mới cho các giống vẫn thực sự cần thiết. II. vật liệu và phơng pháp nghiên cứu 1. Vật liệu Đối tợng nghiên cứu của đề tài là giống đồng tiền kép, hoa đỏ có nguồn gốc nhập nội. Cây giống đợc trồng trong nhà lới, sạch bệnh. 2. Xử lý mẫu Chồi đỉnh ngọn đợc rửa trên nớc chảy và khử trùng sơ bộ bằng cồn 70 0 trong 1 phút trớc khi xử lý bằng H 2 O 2 hoặc HgCl 2 . Sau khi khử trùng, chồi đợc rửa sạch bằng nớc cất vô trùng 4 - 5 lần, cắt lấy mẫu có kích thớc 3 ì 3 ì 3mm rồi Nhận bài ngày 22/8/2005. Sửa chữa xong 17/11/2005 11 Đại học Vinh Tạp chí khoa học, tập XXXV, số 1A-2006 đa vào môi trờng dinh dỡng nuôi cấy trong 2 tuần. Các mẫu sống, bật chồi đợc chuyển sang môi trờng nhân nhanh và nuôi. Sau 4 tuần, chồi in vitro đợc nuôi trong môi trờng tạo rễ 1 tháng trớc khi đa ra vờn ơm. Mẫu in vitro đợc nuôi trong điều kiện nhiệt độ 25 0 2 0 C, cờng độ ánh sáng 2000lux, thời gian chiếu sáng 12h/ngày [5, 6]. 3. Nội dung và phơng pháp nghiên cứu Để xây dựng quy trình nhân giống in vitro, chúng tôi đã tiến hành những nội dung nghiên cứu sau: + Nghiên cứu ảnh hởng của loại hoá chất, nồng độ và thời gian khử trùng đến tỷ lệ sống của mẫu với các thí nghiệm đợc bố trí: Khử trùng mẫu bằng H 2 O 2 nồng độ 10, 15 và 20% trong 10 - 15 phút; bằng HgCl 2 0,1% trong 5 - 15 phút. + Nghiên cứu ảnh hởng của chất điều tiết sinh trởng BAP (6-benzylamino purin) tới khả năng nhân chồi đồng tiền in vitro. Môi trờng nuôi cấy chồi đợc sử dụng là [MS (Murashige and Skoog, 1962) + 50g/l saccaroza + 6,5g/l agar] bổ sung BAP với các nồng độ từ 0,1 - 2,0mg/l. Hệ số nhân chồi trong các thí nghiệm đợc tính theo công thức Hệ số nhân chồi = số chồi sau thời gian nuôi cấy / số chồi ban đầu. + Nghiên cứu ảnh hởng của chất phụ gia là nớc dừa bổ sung cho môi trờng nuôi cấy với các nồng độ từ 0 - 20% đến sinh trởng, phát triển và hệ số nhân chồi in vitro. + Nghiên cứu ảnh hởng của -NAA (-naphtyl acetic acid) đến khả năng ra rễ của chồi in vitro. Môi trờng ra rễ đợc sử dụng là (MS + 50g/l saccaroza + 6,5g/l agar) có bổ sung -NAA với các nồng độ từ 0,1 - 1,5mg/l. Các nghiên cứu đợc thực hiện từ tháng 01 đến tháng 7 năm 2005 tại Phòng Nuôi cấy mô - tế bào thực vật, khoa Sinh học, trờng Đại học Vinh. III. Kết quả nghiên cứu và bàn luận 1. ảnh hởng của loại hoá chất, nồng độ và thời gian khử trùng Bảng 1. Hiệu quả khử trùng đỉnh ngọn cây đồng tiền. Hoá chất Nồng độ (%) Thời gian (phút) Số mẫu đa vào Số mẫu nhiễm và chết (%) Số mẫu sống (%) 10 10 20 15 (75) 5( 25) 15 10 20 12 (60) 8 (40) 15 15 20 12 (60) 8 (40) H 2 O 2 20 15 20 14 (70) 6 (30) 0,1 5 20 13 (65) 7 (35) 0,1 10 20 4 (20) 16 (80) HgCl 2 0,1 15 20 9 (45) 11 (55) 12 Mai Văn Chung - Phùng Văn Hào, Nhân nhanh giống hoa , tr. 10-15 Kết quả bảng 1 cho thấy: sử dụng H 2 O 2 ở các nồng độ 10% và 15% để xử lý mẫu đồng tiền trong thời gian 10 phút cho tỷ lệ nhiễm khá cao (từ 60 - 75%), chứng tỏ hiệu quả khử trùng mẫu của các thí nghiệm này thấp. Khi H 2 O 2 đợc sử dụng với nồng độ cao hơn (20%) và kéo dài thời gian xử lý (15 phút) thì số lợng mẫu bị nhiễm có giảm nhng tỷ lệ chết lại cao. Có thể nói, H 2 O 2 không phù hợp cho việc sử dụng để khử trùng đỉnh ngọn đồng tiền. Đối với HgCl 2 0,1%, thời gian khử trùng 5 phút cho số mẫu bị nhiễm nhiều (13 mẫu). Khi tăng thời gian khử trùng, tỷ lệ mẫu bị nhiễm và chết giảm nhiều, hiệu quả cao nhất đạt đợc ở công thức xử lý 10 phút (tỷ lệ sống và bật chồi đạt 80%). Thời gian xử lý 15 phút cho số mẫu bị nhiễm giảm nhiều (3 mẫu) nhng lại có tới 6 mẫu bị chết (do thời gian xử lý dài). Nh vậy, sử dụng HgCl 2 0,1% với thời gian xử lý 10 phút là phù hợp đối với đỉnh ngọn cây hoa đồng tiền. Hình 1. Chồi đồng tiền in vitro sau 1 tuần nuôi cấy từ đỉnh ngọn. 2. ảnh hởng của BAP đến khả năng nhân chồi in vitro Sau khi lựa chọn đợc loại hoá chất, nồng độ và thời gian khử trùng thích hợp, chúng tôi đã tiến hành xử lý mẫu với số lợng lớn để nhân nhanh và tìm hiểu ảnh hởng của BAP - một loại chất kích thích sinh trởng thực vật - đến khả năng nhân chồi đồng tiền in vitro. Bảng 2. ảnh hởng của BAP đến khả năng nhân chồi đồng tiền in vitro. Sau 2 tuần nuôi cấy Sau 4 tuần nuôi cấy Nồng độ BAP (mg/l) Số mẫu Số chồi Hệ số nhân Số chồi Hệ số nhân 0,0 50 50 1,00 58 1,16 0,1 50 55 1,10 102 2,04 0,5 50 102 2,04 110 2,20 1,0 50 148 2,96 215 4,30 1,5 50 155 3,10 307 6,14 2,0 50 145 2,90 246 4,92 Qua bảng 2, chúng tôi nhận thấy: không có BAP, sinh trởng và phát triển của chồi đồng tiền in vitro kém, hệ số nhân chồi chỉ đạt 1,16 sau 1 tháng nuôi cấy. Khi bổ sung BAP vào môi trờng dinh dỡng (MS + 50g/l saccaroza + 6,5g/l agar), sinh trởng của chồi tăng tỷ lệ thuận với thang nồng độ BAP từ 0,1 - 1,5mg/l, 13 Đại học Vinh Tạp chí khoa học, tập XXXV, số 1A-2006 hệ số nhân chồi cao nhất đạt đợc ở nồng độ BAP 1,5mg/l (sau 2 tuần nuôi cấy là 3,10, sau 4 tuần là 6,14). Tiếp tục tăng nồng độ BAP lên 2,0 mg/l thì hiệu quả xử lý đã giảm xuống. Hình 2. Chồi đồng tiền in vitro sau 1 tuần cấy chuyển. 3. ảnh hởng của nớc dừa đến khả năng sinh trởng và nhân chồi in vitro Bảng 3. ảnh hởng của nớc dừa đến khả năng nhân chồi đồng tiền in vitro. Sau 2 tuần nuôi cấy Sau 4 tuần nuôi cấy Nồng độ nớc dừa (%) Số mẫu Số chồi Hệ số nhân Số chồi Hệ số nhân 0 50 94 1,88 262 5,24 5 50 110 2,20 289 5,78 10 50 152 3,04 314 6,28 15 50 193 3,86 336 6,72 20 50 141 2,82 295 5,90 Nớc dừa là một loại hỗn hợp dinh dỡng tự nhiên, trong thành phần chứa nhiều hợp chất quan trọng đối với mô, tế bào in vitro: axit amin, axit hữu cơ, gluxit, các hợp chất có hoạt tính auxin, các xytokinin dạng glycosit và myo insitol. Bổ sung vào môi trờng nhân chồi đồng tiền (MS + 50g/l saccaroza + 6,5g/l agar + 1,5mg/l BAP) nớc dừa với nồng độ 15% cho kết quả tốt nhất, chồi in vitro phát triển mạnh, cây khoẻ, hệ số nhân chồi đạt đợc sau 2 và 4 tuần nuôi cấy tơng ứng 3,86 và 6,72. Các nồng độ cao hoặc thấp hơn 15% đều cho hiệu quả kém hơn (bảng 3). Do đó, môi trờng sử dụng để nhân nhanh chồi đồng tiền cần bổ sung nớc dừa với nồng độ 15%. 4. ảnh hởng của -NAA đến khả năng phát triển rễ và lá của chồi in vitro Các chồi đồng tiền có khả năng tạo rễ và phát triển lá khác nhau trong môi trờng có nồng độ -NAA khác nhau sau 4 tuần nuôi cấy (bảng 4). 14 Mai Văn Chung - Phùng Văn Hào, Nhân nhanh giống hoa , tr. 10-15 Bảng 4. ảnh hởng của NAA đến khả năng phát triển rễ và lá của chồi đồngtiền in vitro. Nồng độ - NAA (mg/l) Số chồi % số chồi ra rễ Số rễ/ cây Dài rễ (mm) Số lá /cây 0,0 50 40 2,3 12,4 4,6 0,1 50 32 2,6 19,3 4,3 0,5 50 84 3,0 26,1 3,9 1,0 50 90 3,1 30,8 4,6 1,5 50 80 3,4 24,6 3,6 Kết quả thu đợc cho thấy, các nồng độ -NAA từ 0,5 - 1,5 mg/l có ảnh hởng tốt đến tỷ lệ ra rễ của chồi đồng tiền in vitro (80 - 90%), số lợng nhiều (3,0 - 3,4 rễ/cây), chiều dài rễ lớn (24,6 - 30,8mm), trong đó, nồng độ 1,0mg/l -NAA cho hiệu quả tốt nhất. ở nồng độ này, mặc dù số rễ/cây cha phải là nhiều nhất nhng tỷ lệ cây ra rễ, chiều dài rễ và số lá/cây là cao hơn cả. Vì vậy, theo chúng tôi, nồng độ -NAA bổ sung vào môi trờng (MS + 50g/l saccaroza + 6,5g/l agar) cho chồi đồng tiền in vitro ra rễ thích hợp nhất là 1,0mg/l. Hình 3. Cây đồng tiền sau 4 tuần nuôi trong môi trờng ra rễ. IV. kết luận Từ những kết quả thu đợc, bớc đầu, chúng tôi đề xuất phơng pháp nhân giống vô tính in vitro giống đồng tiền kép, hoa đỏ nh sau: + Chồi đỉnh ngọn trớc khi đa vào nuôi cấy in vitro đợc khử trùng kép: xử lý mẫu bằng cồn 70 0 (1 phút), sau đó sử dụng HgCl 2 0,1% trong 10 phút. + Môi trờng nhân nhanh chồi đồng tiền in vitro MS + 50g/l saccaroza + 6,5 g/l agar + 1,5mg/l BAP + 15% nớc dừa. + Môi trờng tạo rễ cho chồi đồng tiền in vitro: MS + 50g/l saccaroza + 6,5 g/l agar + 1,0 mg/l -NAA. 15 Đại học Vinh Tạp chí khoa học, tập XXXV, số 1A-2006 Tài liệu tham khảo [1] Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội, Công nghệ sinh học thực vật trong cải tiến giống cây trồng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội, 1997. [2] Đặng Văn Đông, Đinh Thế Lộc, Hoa đồng tiền, NXB Lao động - Xã hội, Hà Nội, 2004. [3] Trần Thị Lệ, Lê Dung, Hoàn thiện quy trình nhân giống cây hoa đồng tiền bằng công nghệ in vitro, Tạp chí Nông nghiệp và phát triển nông thôn, Số 10 (2005), 80 - 82. [4] Nguyễn Xuân Linh, Hoa và kỹ thuật trồng hoa, NXB Nông nghiệp, Hà Nội, 1998. [5] Đỗ Năng Vịnh, Công nghệ sinh học cây trồng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội, 2002. [6] M. R. Fowler, Plant cell culture, laboratory techniques, In Encyclopedia of cell, Wiley, New York, 2002. SUMMARY Rapid multiplication of Gerbera (Gerbera jamesonii B.) by tissue culture technique We have studied to apply the technique of in vitro propagation in order to produce a large number of disease-free plantlet of Gerbera. The first results of our research show that: The in vitro shoot tip explants of Gerbera were sterilized by etanol 70 0 in 1 minute and HgCl 2 0.1% in 10 minutes; The best medium using for shoot multiplication is [MS (Murashige and Skoog, 1962) + 50g/l saccharose + 6.5 g/l agar + 1.5mg/l BAP (6-benzylaminopurine) + 15% coconut water]; The best medium using for roots formation was (MS + 50g/l saccharose + 6.5 g/l agar + 1.0 mg/l -NAA (-naphtyl acetic acid)). (a) (b) Khoa sinh học, Trờng Đại học Vinh 16 §¹i häc Vinh T¹p chÝ khoa häc, tËp XXXV, sè 1A-2006 17 §¹i häc Vinh T¹p chÝ khoa häc, tËp XXXV, sè 1A-2006 18 NguyÔn V¨n Dòng, Vµi nhËn xÐt vÒ kh«ng gian , tr. 16-22 19 §¹i häc Vinh T¹p chÝ khoa häc, tËp XXXV, sè 1A-2006 [...]...NguyÔn V¨n Dòng, 20 V i nhËn xÐt vÒ kh«ng gian , tr 16-22 §¹i häc Vinh T¹p chÝ khoa häc, tËp XXXV, sè 1A-2006 21 NguyÔn V¨n Dòng, 22 V i nhËn xÐt vÒ kh«ng gian , tr 16-22 . 10 Đại học Vinh Tạp chí khoa học, tập XXXV, số 1A-2006 Nhân nhanh giống hoa đồng tiền bằng kỹ thuật nuôi cấy mô Mai Văn Chung (a) , Phùng Văn Hào (b) Tóm tắt. Nghiên cứu xây dựng. trình nhân giống vô tính cây đồng tiền bằng kỹ thuật nuôi cấy mô in vitro, bớc đầu, chúng tôi thu đợc kết quả: Chồi đỉnh ngọn trớc khi đa vào nuôi cấy in vitro đợc khử trùng kép bằng cồn 70 0 . đề xuất quy trình kỹ thuật mới cho các giống vẫn thực sự cần thiết. II. vật liệu và phơng pháp nghiên cứu 1. Vật liệu Đối tợng nghiên cứu của đề tài là giống đồng tiền kép, hoa đỏ có nguồn gốc