i LỜI CẢM ƠN Đề tài được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử, Bộ môn Công nghệ sinh học, Trường Đại học Nha Trang. Để hoàn thành đồ án tốt nghiệp này tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Đặng Thúy Bình và Ths. Nguyễn Thị Hải Thanh, Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nha Trang, TP. Nha Trang - Khánh Hòa đã tận tình chỉ bảo và hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện để hoàn thành đồ án. Tôi xin chân thành cảm ơn: Ban giám đốc và các thầy cô giáo Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nha Trang đã tạo điều kiện cho tôi được sử dụng trang thiết bị, hóa chất và các dụng cụ thí nghiệm. ThS. Trương Thị Thu Thủy, cán bộ tổ nghiên cứu Bộ môn Công nghệ sinh học đã giúp đỡ tôi về kỹ thuật và thao tác. Các thầy cô giáo trong Bộ môn Công nghệ sinh học, Trường Đại học Nha Trang đã cung cấp cho tôi những kiến thức nền tảng để hoàn thành đồ án tốt nghiệp này. Tập thể lớp 49CNSH và nhóm sinh viên Trường Đại học Nha Trang đã cùng tôi thực hiện đề tài này. Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn sự quan tâm, giúp đỡ động viên của gia đình, bạn bè, người thân, cảm ơn những ý kiến đóng góp và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Xin kính chúc mọi người sức khoẻ, hạnh phúc và thành công. Nha Trang, tháng 7 năm 2011 Sinh viên thực hiện Hoàng Thị Lý ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH vi LỜI MỞ ĐẦU 1 I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2 I.1. TỔNG QUAN VỀ ỐC CỐI (CONUS.SPP) 3 I.1.1. Phân loại 3 I.1.2. Hình thái 3 I.1.3. Phân bố 5 I.1.4. Đặc điểm sinh học, sinh sản 6 I.1.5. Chế độ dinh dưỡng và phương thức săn mồi 8 I.1.6. Độc tố ốc cối 10 I.1.7. Phân loại độc tố ốc cối conotoxin 14 I.2. TỔNG QUAN VỀ VÙNG NGHIÊN CỨU 16 I.2.1. Đặc điểm điều kiện tự nhiên và sinh thái môi trường đảo Cù Lao Chàm và ven bờ Quảng Nam. 16 I.2.3. Đặc điểm điều kiện tự nhiên và sinh thái môi trường đảo Lý Sơn, Quảng Ngãi 19 I.2.4. Đặc điểm điều kiện tự nhiên và sinh thái môi trường vùng ven biển Sông Cầu, Phú Yên. 20 I.3. CÁC NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN. 23 I.3.1. Giới thiệu về ti thể 23 I.3.1.1. Cấu trúc ti thể 23 I.3.1.2. Chức năng ti thể 24 I.3.1.3. Giới thiệu về hệ gen ti thể 25 I.3.2. Ứng dụng chỉ thị ty thể trong phân loại và xây dựng hệ thống phát sinh loài của ốc cối 27 I.3.3. Nghiên cứu di truyền ốc cối 28 I.3.3.1. Nghiên cứu mối quan hệ tiến hóa: 28 iii I.3.3.2. Mối liên hệ giữa phát sinh loài và chế độ dinh dưỡng (Conus spp.) 30 I.3.3.3. Nghiên cứu cấu trúc hệ gen. 31 I.3.3.4. Nghiên cứu di truyền ốc cối ở Việt Nam 32 I.3.3.5. Nghiên cứu di truyền độc tố. 33 I.3.3.6. Nghiên cứu di truyền quần thể ốc cối và động vật thân mềm. 34 II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. 36 II.1. Đối tượng và địa điểm thu mẫu: 37 II.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm: 38 II.4. Tách chiết DNA 39 II.4.1. Tách chiết DNA với bộ kít Wizard® SV Genomic DNA Purification System 39 II.4.2. Chuẩn bị gel agarose 40 II.4.3. Điện di và đọc kết quả 41 II.5. Phản ứng PCR 41 II.5.1. Cơ sở lý thuyết: 41 II.5.2: Tiến hành thực nghiệm: 42 II.6. Giải trình tự gen 16S mtDNA thu được 43 II.6.1: Cơ sở lý thuyết. 43 II.6.2. Phương pháp tiến hành: 44 II.7. Phân tích đa dạng loài ốc cối. 44 III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN. 48 III.1. KẾT QUẢ 49 III.1.1. Đặc điểm hình thái 49 III.1.2. Tách chiết DNA tổng số 51 III.1.2.1. Lựa chọn vị trí lấy mẫu mô tách chiết 51 III.1.2.2. Tách chiết DNA tổng số 52 III.1.3. Khuếch đại gen 16S mtDNA 53 III.1.4. So sánh trình tự gen 16S mtDNA. 53 III.1.5. Xây dựng cây phát sinh loài 57 III.2. THẢO LUẬN 61 III.2.1. Sự khác biệt về trình tự gen của các nhóm loài ốc cối trên cây phân loại. 61 III.2.2. Mối quan hệ loài ốc cối dựa trên chỉ thị phân tử 16S mtDNA 62 III.2.2. Mối quan hệ giữa loài và chế độ dinh dưỡng. 65 iv IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 68 IV.1. KẾT LUẬN. 69 IV.2. KIẾN NGHỊ. 71 TÀI LIỆU THAM KHẢO 72 A. CÁC TÀI LIỆU TRÍCH DẪN TRONG BÁO CÁO 72 B. TÀI LIỆU THAM KHẢO KHÔNG TRÍCH DẪN 76 v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Các genome ty thể có các gen mã hóa cho các protein, rRNA và tRNA 26 Bảng 2.1: Trình từ các đoạn mồi được sử dụng trong phản ứng PCR 43 Bảng 2.2: Các thông số của quá trình phân tích các trình tự và mô hình tiến hóa (best-fit models) được lựa chọn bởi phần mềm Modeltest 3.7, sử dụng tính năng Akaike Information Criterion. 45 Bảng 2.3: Mã số các trình tự gen 16S và chế độ ăn của các loài ốc cối trong nghiên cứu hiện tại và từ Genbank. (P: ăn cá; P+V: ăn cá và nhuyễn thể; P+V: ăn cá và giun biển; V: ăn giun biển; M: ăn nhuyễn thể; U: chưa nghiên cứu (unknow)). 46 Bảng 3.1: So sánh tỷ lệ các trình tự giống nhau giữa các loài ốc cối thu thập được ở vùng biển Nam Trung Bộ Việt Nam 56 Bảng 3.2: Các nhóm loài ốc cối trên cây phân loại từ các phương pháp MP, ML, BI. Nhóm được phân loại dựa theo chế độ ăn (P: ăn cá, V: ăn giun; M: ăn nhuyễn thể; U: chưa biết). 59 vi DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Hình thái ngoài của một số loài ốc cối 10 Hình 1.2. Cấu tạo bên ngoài của ốc cối 4 Hình 1.3: Khu vực phân bố của Conus.textile trên thế giới 6 Hình 1.4: Vòng đời của ốc cối 8 Hình 1.5: Phương thức săn mồi dạng móc câu 9 Hình 1.6: Conus purpurascens và phương thức săn mồi dạng móc câu 9 Hình 1.7: Phương thức săn mồi dạng lưới 10 Hình 1.8: Cấu tạo tuyến nọc độc của ốc cối 11 Hình 1.9: Cấu trúc răng kitin điển hình của ốc cối (Flankin và cs, 2007). 14 Hình 1.10: Bản đồ địa lý về sự phân bố các vùng biển Việt Nam 21 Hình 1.11: Cấu trúc ti thể 30 Hình 1.12. DNA ty thể người, bao gồm 22 gen tRNA, 2 gen rRNA, và 13 vùng mã hóa protein 27 Hình 1.13: Cấu trúc hệ gen ty thể của Conus textile 32 Hình 2.1: Các địa điểm thu mẫu ốc cối Conus spp. (chữ đỏ). 37 Hình 2.2: Quy trình bố trí thí nghiệm. 38 Hình 2.3: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR. 42 Hình 3.1. Hình thái vỏ của các loài ốc cối phân bố ở biển Việt Nam 49 Hình 3.2: Ảnh minh họa vị trí lấy mẫu mô tách chiết DNA 51 Hình 3.3. Kết quả điện di DNA tổng số của các mẫu ốc cối 52 Hình 3.4. Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen 16S mtDNA. 53 vii Hình 3.5: Cây phát sính loài dựa trên gen 16S mtDNA của ốc cối thu tại vùng biển Nam Trung Bộ, Việt Nam 60 1 LỜI MỞ ĐẦU Ốc cối là một trong những họ động vật thân mềm lớn (gồm khoảng 700 loài) thuộc loài ăn thịt, có nọc độc, phân bố rộng rãi trên thế giới đặc biệt là ở vùng biển nhiệt đới. Vỏ của các loài ốc cối có màu sắc và hoa văn đẹp nên thường được khai thác để làm đồ trang sức, mỹ nghệ và các vật phẩm lưu niệm. Ngoài ra, ốc cối còn là nguồn nguyên liệu sản xuất các loại thuốc chữa các cơn đau mạn tính, ung thư và nhiều bệnh khác. Các nghiên cứu lâm sàng và cận lâm sàng cho thấy độc tố ốc cối (conotoxin) có hiệu quả giảm đau cao gấp 10.000 lần so với morphine mà không gây nghiện hoặc các phản ứng phụ - điều khó tránh khỏi với tất cả các loại thuốc giảm đau hiện nay (Olivera, 1990). Vì những lợi ích về kinh tế và y học đó mà tình trạng khai thác bừa bãi các loài ốc cối ngày càng gia tăng. Bởi vậy, đòi hỏi các nhà khoa học phải có các nghiên cứu để bảo tồn một cách hợp lý và đúng đắn nguồn tài nguyên này. Hiện nay, trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về sự đa dạng loài của ốc cối. Tuy nhiên, ở Việt Nam, các nghiên cứu về ốc cối mới chỉ dừng lại ở mức độ thống kê và mô tả các đặc điểm hình thái giải phẫu. Hiện việc nghiên cứu về ốc cối ở mức độ phân tử vẫn còn hạn chế. Vì vậy, nghiên cứu và xây dựng phát sinh chủng loại các loài ốc cối Việt Nam bằng các phương pháp sinh học phân tử là điều rất cần thiết. Vì những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài “nghiên cứu mối quan hệ loài của ốc cối (Conus spp.) ở vùng biển Nam Trung Bộ, Việt Nam dựa trên chỉ thị phân tử gen 16S của DNA ty thể (16S mt DNA)”. Mục tiêu của đề tài: - Khảo sát và đánh giá đặc điểm di truyền của loài ốc cối (Conus spp.). - Bước đầu khảo sát mối quan hệ tiến hóa giữa các loài ốc cối thu được ở Việt Nam dựa trên phân tích giải trình tự gen 16S của DNA ti thể (Mitochondrial DNA). Trên cơ sở đó tiến hành xây dựng cây phát sinh loài. 2 I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 Hình 1.1: Hình thái ngoài c ủa một số loài ốc cối. (http://www.conidae.info) I.1. TỔNG QUAN VỀ ỐC CỐI (CONUS.SPP) I.1.1. Phân loại Họ ốc cối Conidae thuộc liên họ Conoidea, bộ Sorbeoconcha, là một trong những họ có số lượng loài lớn trong ngành động vật thân mềm. Cho đến nay, trên thế giới người ta đã xác định được khoảng 700 loài, trong đó chủ yếu thuộc giống Conus. Hệ thống phân loại của ốc cối như sau: Giới: Animalia Ngành: Mollusca Lớp: Gastropoda Liên họ: Conoidea Họ: Conidae Phân họ: Coninae Giống: Conus (http://vi.wikipedia.org/wiki/Coninae) I.1.2. Hình thái Hiện nay, các nhà khoa học đã xác định được khoảng 500-700 loài ốc cối (Conus spp). Những loài này đều có đặc điểm chung là có màu sắc sặc sỡ với những hoa văn rất đẹp. Vỏ thuôn dài, dày, bằng đá vôi, chắc, nặng, xoắn theo chiều kim đồng hồ (hình thái ngoài của các loài ốc cối được minh họa ở hình 1.1). Đầu có 1 xúc tu (râu), toàn thân liền trong vỏ bao bọc bởi một lớp nhầy. Thức ăn của chúng là các loài giun biển, động vật thân mềm và các [...]... nên dựa vào tốc độ thay đổi nucleotide có thể xác định thời gian tiến hóa, xác lập đồng hồ phân tử 27 Hình 1.12 DNA ty thể người, bao gồm 22 gen tRNA, 2 gen rRNA, và 13 vùng mã hóa protein Mũi tên chỉ vùng gen (16S mtDNA) được sử dụng trong nghiên cứu hiện tại I.3.2 Ứng dụng chỉ thị ty thể trong phân loại và xây dựng hệ thống phát sinh loài của ốc cối Việc phân tích mối quan hệ phát sinh chủng loại của. .. bản, có mặt ở khắp nơi và có đặc tính tiến hóa, bởi vậy nó trở thành marker phổ biến nhất trong sinh học phân tử I.3.3 Nghiên cứu di truyền ốc cối I.3.3.1 Nghiên cứu mối quan hệ tiến hóa: Từ các nghiên cứu độc tố của các loài ốc ăn cá cho thấy những loài có quan hệ gần gũi thường chứa các peptide độc tố tương đồng về mặt chức năng hơn so với các loài có quan hệ xa Vì vậy, nghiên cứu mối quan hệ tiến hóa... mtDNA thì CO1 mtDNA và chỉ thị nhân ITS2 cũng được sử dụng rộng rãi để nghiên cứu mối quan hệ tiến hóa trong di truyền ốc cối Duda và Rolan (2005) sử dụng gen CO1 mtDNA của 90 loài ốc cối trong đó có 30 loài đặc hữu ở quần đảo Cape Verde để khảo sát mối quan hệ tiến hóa và xác định nguồn gốc các loài ốc cối ở Cape Verde Kết quả cho thấy các loài này được chia thành 2 nhóm riêng biệt và thể hiện quần... Giống ốc cối thường phân bố ở vùng vĩ độ giữa 400 Bắc và 400 Nam, chủ yếu ở các vùng biển: Ấn Độ - Thái Bình Dương, Panamic, Caribbean, Peru, Patagonic, Tây và Nam Phi và Địa Trung Hải (hình 1.3) Một số loài có thể phân bố ở vĩ độ trên 400 như ở Nam Phi, Nam Australia, Nam Nhật Bản và biển Địa Trung Hải Nhìn chung, ốc cối xuất hiện ở hầu hết các vùng biển nhiệt đới và cận nhiệt đới, nhưng đa dạng loài. .. protein ty thể hoặc nhân thường được sử dụng Để tăng độ tin cậy, các nghiên cứu hiện nay thường sử dụng kết hợp cả hai (vùng DNA có độ bảo thủ với vùng DNA có độ biến thiên cao) Hơn thế nữa, các chỉ thị ty thể cũng thường được sử dụng kết hợp với các chỉ thị nhân.Đối với các động vật thân mềm, DNA ty thể đã được chứng minh là công cụ hữu hiệu trong phân tích mối quan hệ loài Các chỉ thị (marker) của DNA ty. .. chuyển hóa protein Một sự đột biến các gene điều hòa bất cứ các chức năng này đều có thể gây ra nhiều bệnh ty thể khác nhau (http://vi.wikipedia.org/wiki/Ti_th%E1%BB%83) 25 I.3.1.3 Giới thiệu về hệ gen ti thể:  Hệ gen ti thể (Mitochondrial DNA – mtDNA): DNA ty thể (mitochondrial DNA- mtDNA) là một genome độc lập, thường là mạch vòng, được định vị trong ty thể Bộ gen ty thể có cấu tạo xoắn kép, trần, mạch... loại có thể dựa trên phân tích trình tự một gen hoặc một họ gen Tuy nhiên, dữ liệu phân tích cũng có thể mở rộng hơn, chẳng hạn kết hợp nhiều gen hoặc nhiều vùng DNA khác nhau Với những loài có quan hệ gần, các gen hay vùng DNA có độ linh động cao (như intron, các vùng liên gen - đoạn chèn) thường hay được sử dụng Song với các 28 loài có quan hệ xa thì các gen hay vùng DNA có độ bảo thủ cao như gen mã... đã sinh ra các phân tử tiểu genome (subgenome) mạch vòng nhỏ hơn, cùng tồn tại với genome “chủ” (master genome) hoàn chỉnh, đã giải thích cho sự phức tạp của các DNA ty thể ở thực vật Bảng 1 tóm tắt sự phân công của các gen trong một số genome ty thể Tổng số gen mã hóa protein là khá ít, và không tương quan với kích thước của genome Ty 26 thể động vật có vú sử dụng các genome 16 kb của chúng để mã... kitin của một số loài ốc cối ở các vùng ven biển Ấn Độ, kết quả cho thấy sự khác biệt trong cấu trúc răng kitin ở các loài này và họ đã phân loại các loài nghiên cứu làm ba nhóm: ăn cá, ăn nhuyễn thể, ăn giun biển Nghiên cứu còn cho thấy cấu trúc răng kitin sẽ chuyên biệt cho từng loại con mồi và rất có giá trị trong việc phân loại các loài ốc cối (Franklin và cs, 2007) Cấu trúc răng kitin của ốc cối. .. vú) (Hình 1.12: DNA ty thể người, bao gồm 22 gen tRNA, 2 gen rRNA, và 13 vùng mã hóa protein) Có khoảng một vài trăm ty thể trên một tế bào Mỗi ty thể có nhiều bản sao DNA Số lượng tổng số của DNA ty thể so với DNA nhân là rất nhỏ ( . vùng biển Nam Trung Bộ, Việt Nam dựa trên chỉ thị phân tử gen 16S của DNA ty thể (16S mt DNA) ”. Mục tiêu của đề tài: - Khảo sát và đánh giá đặc điểm di truyền của loài ốc cối (Conus spp. ). -. khác biệt về trình tự gen của các nhóm loài ốc cối trên cây phân loại. 61 III.2.2. Mối quan hệ loài ốc cối dựa trên chỉ thị phân tử 16S mtDNA 62 III.2.2. Mối quan hệ giữa loài và chế độ dinh. sát mối quan hệ tiến hóa giữa các loài ốc cối thu được ở Việt Nam dựa trên phân tích giải trình tự gen 16S của DNA ti thể (Mitochondrial DNA) . Trên cơ sở đó tiến hành xây dựng cây phát sinh loài.