LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đồ án này Trước hết tôi xin gởi tới Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Nha Trang, Ban Giấm Đốc Viện Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường niềm kính trọng, sự tự hào được học tập tại trường trong những năm qua. Sự biết ơn sâu sắc tới thầy: Th.s Lê Phương Chung – Viện Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường – Trường Đại học Nha Trang và Th.s Nguyễn Trọng Lực – Trưởng phòng Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật – Trung Tâm Ứng Dụng Và Chuyển Giao Công Nghệ - Sở Khoa Học Và Công Nghệ tỉnh Phú yên đã tận tình hướng dẫn và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp này. Đặc biệt xin ghi nhớ tình cảm, sự giúp đỡ của: các thầy cô giáo trong Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường – Trường Đại học Nha Trang và các anh chị trong Trung Tâm Ứng Dụng và Chuyển Giao Công Nghệ – Sở Khoa Học Và Công Nghệ tỉnh Phú yên đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện đồ án này. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, người thân và các bạn bè đã tạo điều kiên, động viên, khích lệ để tôi vượt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập vừa qua Nha trang, ngày tháng 7 năm 2012 Sinh viên thực hiện Nguyễn Thị Huỳnh Uyên i MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH v KÝ HIỆU CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT vi LỜI MỞ ĐẦU 1 Chƣơng I :TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Tổng quan về phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 3 1.1.1. Khái niệm về phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 3 1.1.2. Đặc điểm của nuôi cấy mô tế bào thực vât (TBTV) 3 1.1.2.1. Tính toàn năng của tế bào 3 1.1.2.2. Khả năng biệt hóa và phản biệt hóa của tế bào 4 1.1.2.3. Sự trẻ hoá 4 1.1.3. Ưu điểm của phương pháp nuôi cấy mô TBTV 5 1.1.4. Nhược điểm của phương pháp nuôi cấy mô TBTV 6 1.1.5. Các phương pháp nuôi cấy mô TBTV 6 1.1.5.1. Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng 7 1.1.5.2. Nuôi cấy mô sẹo. 7 1.1.5.3. Nuôi cấy bao phấn và túi phấn. 8 1.1.5.4. Nuôi cấy protoplast 9 1.1.5.5. Nuôi cấy mô cơ quan tách rời 9 1.1.5.6. Nuôi cấy tế bào đơn 10 1.1.6. Môi trường nuôi cấy mô TBTV 10 1.1.6.1. Khoáng đa lượng 11 1.1.6.2. Khoáng vi lượng 12 1.1.6.3. Nguồn cacbon 12 1.1.6.4. Các vitamin 13 1.1.6.5. Amino acid và các nguồn cung cấp nitrogen khác 13 ii 1.1.6.6. Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật 14 1.1.7. Các giai đoạn nuôi cấy mô tế bào thực vật 18 1.1.7.1. Giai đoạn chuẩn bị 18 1.1.7.2. Giai đoạn tái sinh mẫu nuôi cấy 18 1.1.7.3. Giai đoạn nhân nhanh 19 1.1.7.4. Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh 19 1.1.7.5. Giai đoạn đưa cây mô ra ngoài vườn ươm 20 1.1.8. Các yếu tố khác ảnh hưởng đến nhân giống nuôi cấy mô TBTV 20 1.1.8.1. Điều kiện vô trùng 20 1.1.8.2. Ánh sáng và nhiệt độ 22 1.1.8.3. pH môi trường 23 1.2. Giới thiệu về cây lan gấm 23 1.2.1. Phân loại thực vật 23 1.2.2. Đăc điểm thực vật 24 1.2.3. Sự phân bố 26 1.2.4. Tính dược liệu và công dụng 26 1.2.5. Tình hình nghiên cứu cây lan gấm 27 CHƢƠNG 2 VẬT LIỆU - PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 28 2.1.3. Điều kiện nuôi cấy 28 2.2. Nội dung nghiên cứu. 29 2.3. Địa điểm thực hiện các thí nghiệm nghiên cứu. 30 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu. 30 2.4.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm. 30 2.4.1.1. Thí nghiệm 1: Nghiên cứu kỹ thuật vô mẫu cây lan Gấm 30 2.4.1.2. Thí nghiệm 2: Nghiên cứu khả năng tái sinh chồi. 32 2.4.1.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường khoáng đến khả năng nhân nhanh chồi 33 iii 2.4.1.4. Thí nghiệm 4 : Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh chồi 33 2.4.1.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát khả năng nhân nhanh 35 2.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu. 36 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37 3.1. Nghiên cứu kỹ thuật khử trùng mẫu lan gấm 37 3.1.1. Khử trùng bằng Javen 37 3.1.2. Khử trùng bằng chlorine 39 3.1.3. Khử trùng kết hợp Javen và Chlorin 40 3.2. Tái sinh chồi 42 3.3. Nghiên cứu ảnh hƣởng môi trƣờng khoáng thích hợp để nhân nhanh chồi lan gấm 45 3.4. Nghiên cứu ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng đến khả năng nhân nhanh thể chồi 46 3.4.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh chồi. 47 3.4.2. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi. 49 3.4.3. Khảo sát ảnh hưởng của TDZ đến khả năng nhân nhanh chồi 50 3.5. Khảo sát quá trình nhân nhanh 53 3.6. Đề xuất quy trình nhân nhanh lan gấm 55 CHƢƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57 4.1. Kết luận 57 4.2. Kiến nghị 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO 58 PHỤ LỤC iv DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Công thức khử trùng mẫu 31 Bảng 2.2. Ảnh hưởng của môi trường khoáng đến khả năng nhân nhanh chồi của vật liệu nuôi cấy 33 Bảng 2.3. Ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh chồi. 34 Bảng 2.4. Ảnh hưởng của các nồng độ Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi. 34 Bảng 2.5. Ảnh hưởng của các nồng độ TDZ đến khả năng nhân nhanh chồi. 35 Bảng 2.6: Khảo sát quá trình nhân nhanh 36 Bảng 3.1. Hiệu quả khử trùng với chất khử trùng là Javen 37 Bảng 3.2. Hiệu quả khử trùng với chất khử trùng là Chlorine 39 Bảng 3.3. Hiệu quả khử trùng với sự kết hợp Javen và Chlorine. 40 Bảng 3.4. So sánh hiệu quả khử trùng với các chất khử trùng khác nhau. 41 Bảng 3.5. Khả năng tái sinh chồi mẫu cấy 42 Bảng 3.6. Ảnh hưởng môi trường khoáng thích hợp nhân nhanh lan gấm. 45 Bảng 3.7. Ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh chồi 47 Bảng 3.8. Ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi 49 Bảng 3.9: Ảnh hưởng của TDZ đến khả năng nhân nhanh chồi sau 6tuần nuôi cấy51 Bảng 3.10. Khảo sát quá trình nhân nhanh 53 v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Cây lan gấm Anoectochilus setaceus Blume 25 Hình 3.1. Biểu đồ hiệu quả khử trùng với các chất khử trùng khác nhau. 41 Hình 3.2. Mẫu sau khi khử trùng 42 Hình 3.3. Sự tái sinh chồi 44 Hình 3.4. Sự phát triển hình thái chồi trên các môi trường khoáng 46 Hình 3.5. Sự phát triển hình thái chồi với các nồng độ BA khác nhau 48 Hình 3.6. Sự phát triển của chồi với các nồng độ Kinetin khác nhau 50 Hình 3.7. Sự phát triển của chồi với các nồng độ TDZ khác nhau 52 Hình 3.8. Khảo sát quá trình nhân nhanh 54 Hình 3.9. Khảo sát quá trình nhân nhanh protocorm 55 Hình 3.10. Quy trình nhân nhanh lan gấm 56 vi KÝ HIỆU CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT TBTV : Tế bào thực vật DNA : Deoxyribonucleotic acid RNA : Ribonucleotic acid MS :Murashige&Skoog VW :Vaccine và Went KC :Kundson C LS : Linsmainer và Skoog ATP : Adenosine triphosphate GA3 : Acid ascorbic ĐTD : Đơn tử diệp STD : Sông tử diệp 1 LỜI MỞ ĐẦU Thế kỉ 21 được coi là thế kỷ của sự phát triển công nghệ sinh học trong đó dược liệu là tài nguyên di truyền - tài nguyên tái tạo. Nắm được, phát huy được tài nguyên di truyền là nắm kinh tế, nắm tương lai. Dùng thế mạnh dược liệu đẩy - - tộc.Từ lâu, người phương đông đã tôn hoa Lan là “ vương giả chi hoa” và người phương tây cũng tôn hoa Lan là “ nữ hoàng của các loài hoa”. Hoa Lan đã chinh phục người phương Đông và người phươngTây không chỉ cấu trúc kì diệu và sự đa dạng về màu sắc, hình dáng và hương thơm quyến rũ mà còn bỡi giá trị làm thuốc của nó. Từ xưa, người ta đã tiến hành nhân giống các loài Lan bằng nhiều phương pháp khác nhau như gieo hạt, tách mầm nhưng những phương pháp này vẫn còn nhiều nhược điểm như mất thời gian, nguồn vật liệu ban đầu cần nhiều, hệ số nhân thấp, dễ bị thoái hoá qua nhiều thế hệ, khả năng lây truyền bệnh cao, chất lượng cây không đảm bảo, việc nhân giống mang tính thời vụ. , Hơn nữa, hạt lan lại quá nhỏ, chỉ có một phôi; nảy mầm cần sự có mặt của nấm cộng sinh nên tỷ lệ nảy mầm trong tự nhiên là rất thấp. Để khắc phục nhược điểm này, hiện nay người ta tiến hành nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực, cây con được tạo ra với số lượng lớn đồng nhất về kiểu hình, chất lượng đảm bảo, sạch bệnh, giá thành phù hợp và không phụ thuộc vào yếu tố thời tiết. Nhờ đó đáp ứng nhu cầu không ngừng tăng lên của thị trường Đây là điều mà phương pháp truyền thống không thực hiện được. Nói đến chi lan gấm Anoectochilus, thì loài lan gấm Anoectochilus setaceus Blume được biết đến nhiều hơn cả không chỉ bởi giá trị làm cảnh do lá và hoa đẹp mà còn vì giá trị làm thuốc của nó. Theo các tài liệu y học thế giới, lan gấm là loài cây thuốc đặc biệt có tác dụng tăng cường sức khoẻ, phòng bệnh, có tính kháng khuẩn, làm khí huyết lưu thông, chữa các bệnh viêm khí quản, lao phổi, chống tăng 2 huyết áp, đau nhức khớp xương…Hơn nữa mới đây người ta đã phát hiện ra khả năng phòng và chống ung thư của loại thảo dược này. Như vậy, lan Gấm Anoectochilus setaceus. Blume là loại thảo dược có giá trị và có tiềm năng rất lớn.Tuy nhiên, hiện nay ở Việt Nam số lượng loài này trong tự nhiên được phát hiện còn rất ít mà lại bị thu hái cả cây với số lượng lớn để bán làm thuốc (500,000VNĐ/ kg tươi) do vậy loài lan này đang bị đe doạ mạnh và đứng trước nguy cơ tuyệt chủng nếu không có biện pháp bảo tồn hữu hiệu. Hiện nay, lan Gấm được xếp trong nhóm IA của Nghị định 32/2006/CP; và nhóm thực vật đang nguy cấp EN A1a, c, d trong Sách Đỏ Việt Nam 2007. Xuất phát từ những vấn đề trên, được sự cho phép của Bộ môn Công nghệ sinh học- Viện công nghệ sinh học và môi trường - trường Đại học Nha Trang, tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanh chồi lan Gấm (Anoectochilus setaceus Blume) ” tìm ra điều kiện thích hợp để nhân nhanh chồi lan gấm bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật. 3 Chƣơng I :TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.1.1. Khái niệm về phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật Nuôi cấy mô tế bào thực vật là thuật ngữ được dùng một cách rộng rãi để nói về việc mô tả các phương thức nuôi cấy các bộ phận thực vật (tế bào đơn, mô, cơ quan) trong ống nghiệm có chứa môi trường xác định ở điều kiện vô trùng [3] Mục đích chung của nuôi cấy mô tế bào thực vật là sử dụng các điều kiện như: nhiệt độ, ánh sáng, thành phần dinh dưỡng, các chất điều hoà sinh trưởng thực vật… để điều khiển qúa trình sinh trưởng và phát triển của tế bào, mô nuôi cấy theo mục tiêu và yêu cầu đặt ra. Nuôi cấy mô tế bào thực vật còn là một phương pháp nghiên cứu hiệu quả nhất quá trình phát sinh hình thái ở nhiều loài thực vật. Phương pháp này giúp mở ra những hướng mới trong nghiên cứu sinh lý và di truyền thực vật như: cơ chế sinh tổng hợp các chất, sinh lý phân tử - đột biến, sinh lý dinh dưỡng ở tế bào thực vật và nhiều vấn đề sinh học khác… Tất cả dạng nuôi cấy mô đều được tiến hành qua hai bước: - Các phần của thực vật hoặc một cơ quan thực vật nào đó được tách ra khỏi phần còn lại. Đó là sự tách rời tế bào, mô hay cơ quan đang tương tác lẫn nhau trong một tổ chức thực vật nguyên vẹn. - Các phần tách ra nói trên phải đặt trong môi trường thích hợp để nó có thể biểu lộ hết bản chất hoặc khả năng đáp ứng của nó.[3] 1.1.2. Đặc điểm của nuôi cấy mô tế bào thực vât (TBTV) 1.1.2.1. Tính toàn năng của tế bào Mỗi tế bào đều mang đầy đủ lượng thông tin di truyền của cơ thể và có khả năng phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh khi gặp điều kiện thuận lợi . Gottlibeb Haberlant (1902) - nhà thực vật học người Đức đã đặt nền móng đầu tiên cho nuôi cấy mô tế bào thực vật. Ông đã đưa ra giả thuyết về tính toàn năng của tế bào trong cuốn sách "Thực nghiệm về nuôi cấy tách rời". Theo ông: “Tế bào [...]... Vườn Quốc gia Tam Đảo, tỉnh Vĩnh Phúc Năm 2010: Phùng Văn Phê, Nguyễn Thị Hồng Gấm, Nguyễn Trung Thành đã nghiên cứu về quá trình nhân nhanh chồi của lan gấm 28 CHƢƠNG 2 VẬT LIỆU - PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu đề tài là cây lan gấm (Anoectochilus setaceus Blume) được Trung tâm ứng dụng và chuyển giao công nghệ - Sở khoa học và công nghệ... khí quản, viêm gan mãn tính 1.2.5 Tình hình nghiên cứu cây lan gấm Năm 2001: các tác giả Yih-Juh Shiau và cộng sự đã nghiên cứu và nhân giống thành công loài lan gấm Anoectochilus formosanus Hayata từ hạt đem lại triển vọng sản xuất số lượng lớn loài lan này Năm 2005: các tác giả Ông Chun-nian He và cộng sự đã nghiên cứu các hợp chất có trong loài lan gấm Anoectochilus roxburghi và tìm ra đăc tính lâm... 16h/ngày 29 Độ ẩm phòng nuôi: 60% – 70% 2.2 Nội dung nghiên cứu Quy trình nghiên cứu dự kiến như sau: Chất khử trùng là Javen Thí Nghiêm 1: Nghiên cứu khử trùng mẫu Chất khử trùng là chlorine Kết hợp chất khử trùng là chlorine và Javen Thí nghiệm 2: Nghiên cứu tái sinh chồi Không có chất điều hòa sinh trưởng Thí Môi trường MS (Murashige&Skoog) nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng môi trường khoáng thích hợp Có chất... agar khó chuyển sang trạng thái gel, còn pH lớn hơn 6,0 agar có thể rất cứng 1.2 Giới thiệu về cây lan gấm 1.2.1 Phân loại thực vật Lan Gấm Anoectochilus setaceus Blume đồng danh là Anoectochilus roxburghi Wall Họ: Phong lan Orchidaceae Bộ: Phong lan Orchidales Chi Lan Gấm (Anoectochilus) còn được gọi là lan trang sức vì vẻ đẹp hấp dẫn của nó, được Carlvon Blume mô tả đầu tiên năm 1810 thuộc phân họ... khoáng thích hợp Có chất điều hòa sinh trưởng: BA, TDZ, Kinetin Môi trường VW ( Vacine & Went) Môi trường MS/2 (Murashige&Skoog) nuôi cấy lan gấm Môi trường Knudson C nhanh chồi Thí nghiệm Nghiên cứu 4: ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh chồi BA: 0,5mg/l; 1,0mg/l; 1,5mg/l; 2,0mg/l Kinetine: 0,5mg/l; 1,0mg/l; 1,5mg/l; 2,0mg/l TDZ : 0,1mg/l; 0,2mg/l; 0,6mg/l; 0,8mg/l ... cho khả năng tái sinh chồi tốt hơn Giai đoạn này cần đảm bảo các yêu cầu: tỷ lệ nhiễm bệnh thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt Giai đoạn này thường kéo dài trong 4-6 tuần 19 1.1.7.3 Giai đoạn nhân nhanh Một trong những ưu thế lớn nhất của phương pháp nhân giống in vitro so với các phương pháp nhân giống truyền thống là có hệ số nhân cao Vì vậy giai đoạn nhân nhanh được coi là giai... cấy mô TBTV Quá trình nuôi cấy mô TBTV có những ưu điểm như sau: - Nhân nhanh với hệ số nhân giống cao: Trong hầu hết các trường hợp, công nghệ vi nhân giống đáp ứng tốc độ nhân nhanh cao, từ 1 cây sau khi được nuôi cấy từ 1 đến 2 năm có thể tạo ra hàng triệu cây - Sản phẩm cây giống đồng nhất: Vi nhân giống về cơ bản là công nghệ nhân dòng Nó tạo ra quần thể có độ đều cao dù xuất phát từ cây mẹ có... ra quy trình nhân giống in vitro thành công cho loài lan Kim tuyến ( A formosanus) với vật liệu ban đầu là từ chồi đỉnh tại trường Đại học tổng hợp quốc gia Hàn Quốc Năm 2009: Phùng Văn Phê, Nguyễn Trung Thành, Vương Duy Hưng nghiên cứu về Đặc điểm hình thái, phân bố của loài lan oectochilus setaceus blume ở Vườn Quốc gia Tam Đảo, tỉnh Vĩnh Phúc Năm 2010: Phùng Văn Phê, Nguyễn Thị Hồng Gấm, Nguyễn Trung... công trình về nuôi cấy tế bào đơn được tiến hành từ những năm 50 của thế kỷ XX Tế bào đợn có thể ghi nhân bằng con đường nghiền mô, hoặc xử lý bằng enzyme Mỗi loiạ cây, mỗi loại tế bào khác nhau đòi hỏi những kỹ thuật nuôi cấy khác nhau Nuôi cấy tế bào đơn được sử dụng để nghiên cứu cấu trúc tế bào, nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện khác nhau lên quá trình sinh trưởng, phát triển và phân hóa của tế... bố Lan gấm rất khó tìm, vì cây mọc rải rác trong rừng sâu, vùng núi đá vôi, nơi ẩm, dọc theo khe suối, ở độ cao 300-1000m Ở Việt Nam, lan gấm thường phân bố ở các tỉnh: Lào Cai (Sapa), Hà Giang (Quảng Bạ), Yên Bái, Vĩnh Phúc (Tam Đảo), Hà Tây (Mỹ Đức: Chùa Hương), Quảng Trị (Đồng Chè), Kom Tum (Đắc Tô: Đăc Uy), Gia Lai (Kbang: Kon Hà Nừng), Lâm Đồng, Ninh Thuận, Bình Thuận … Trên thế giới, lan gấm . Trang, tôi tiến hành đề tài Nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanh chồi lan Gấm (Anoectochilus setaceus Blume) ” tìm ra điều kiện thích hợp để nhân nhanh chồi lan gấm bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào. 42 3.3. Nghiên cứu ảnh hƣởng môi trƣờng khoáng thích hợp để nhân nhanh chồi lan gấm 45 3.4. Nghiên cứu ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng đến khả năng nhân nhanh thể chồi 46 3.4.1 1: Nghiên cứu kỹ thuật vô mẫu cây lan Gấm 30 2.4.1.2. Thí nghiệm 2: Nghiên cứu khả năng tái sinh chồi. 32 2.4.1.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường khoáng đến khả năng nhân nhanh