i LỜI CẢM ƠN Nhằm đào tạo ra những cử nhân có trình độ chuyên môn cao và nhạy bén tiếp thu kỹ thuật, công nghệ là mục tiêu đào tạo hàng đầu của trường Đại học Nha Trang. Để giúp sinh viên hệ thống lại kiến thức đã tiếp thu được ở nhà trường và vận dụng kiến thức đã học một cách hiệu quả trong nghiên cứu cũng như trong sản xuất thì việc tổ chức cho sinh viên thực tập đồ án tốt nghiệp là khâu quan trọng trong quá trình đào tạo của trường. Được sự phân công của Bộ môn Công nghệ sinh học, Ban Giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường - Trường Đại học Nha Trang cho phép tôi thực hiện đồ án tốt nghiệp tại Phòng Vi sinh - Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường trong thời gian từ ngày 20/02/2012 đến ngày 02/06/2012. Để hoàn thành đồ án này, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cô giáo Văn Hồng Cầm - người đã tận tình hướng dẫn tôi hoàn thành đồ án này. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong Bộ môn Công nghệ Sinh học, cùng toàn thể quý thầy cô đã dạy dỗ và truyền đạt kiến thức những kiến thức thật quý giá và bổ ích cho chúng tôi, làm nền tảng để tôi bước vào thực hiện đồ án này. Cho phép tôi được gửi lời cảm ơn tới Ban Giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường và cô Trương Thị Thu Thủy - cán bộ quản lý Phòng Vi sinh đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành đồ án này. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè, những người đã động viên khích lệ rất nhiều để tôi có thể hoàn thành tốt đồ án này. Xin chân thành cảm ơn! Do bước đầu làm quen với môi trường nghiên cứu khoa học, kinh nghiệm còn hạn chế nên có thể còn nhiều điều thiếu sót. Kính mong nhận được những ý kiến đóng góp của quý thầy cô giáo và các bạn. Nha Trang, tháng 7 năm 2012 Sinh viên thực hiện Huỳnh Thị Kim Ngọc ii MỤC LỤC Trang DANH MỤC VIẾT TẮT v DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vii LỜI MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 2 1.1 Tổng quan về chim yến 2 1.1.1 Đặc điểm sinh học và phân bố của chim Yến tổ trắng 2 1.1.1.1 Đặc điểm sinh học 2 1.1.1.2 Phân bố 7 1.1.2 Giá trị kinh tế của chim yến 9 1.1.2.1 Lịch sử khai thác và sử dụng tổ yến 9 1.1.2.2 Giá trị dinh dưỡng của tổ yến 11 1.1.2.3 Giá trị kinh tế của tổ yến 12 1.1.2.4 Thiên địch 13 1.1.2.5 Hóa chất dẫn dụ 13 1.2 Hệ vi sinh vật trong nguồn phân các loài động vật 14 1.2.1 Họ vi khuẩn đường ruột (Enterobacteriaceae) 14 1.2.1.1 Escherichia coli 15 1.2.1.2 Salmonella 17 1.2.2 Vibrionaceae 19 1.2.3 Vi nấm 20 1.2.4 Phát hiện vi sinh vật mục tiêu - phân lập và định danh 21 1.3 Các nghiên cứu về vi sinh trên đối tƣợng chim yến 22 1.3.1 Các nghiên cứu về chim yến 22 1.3.1.1 Các nghiên cứu về chim yến trên thế giới 22 iii 1.3.1.2 Các nghiên cứu về chim yến ở Việt Nam 22 1.3.1.3 Các nghiên cứu về vi sinh trên đối tượng chim hoang dã 23 1.3.2 Mục tiêu và tính cấp thiết của đề tài 24 1.3.2.1 Tính cấp thiết 24 1.3.2.2 Mục tiêu 25 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 27 2.2 Vật liệu, dụng cụ và thiết bị nghiên cứu 27 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 27 2.3.1 Phương pháp thu mẫu 27 2.3.2 Phương pháp khảo sát điều kiện vận chuyển mẫu 29 2.3.3 Phương pháp phân lập vi sinh vật 31 2.3.4 Phương pháp giám định hình thái và kiểm tra đặc tính sinh hóa 33 2.3.4.1 Phương pháp giám định hình thái và tính bắt màu 33 2.3.4.2 Phương pháp kiểm tra đặc tính sinh hóa 34 2.3.5 Phương pháp định danh 37 2.3.5.1 Phương pháp định danh theo khóa phân loại Bergey 37 2.3.5.2 Phương pháp sử dụng Kit sinh hóa API 20E để định danh 37 2.3.5.3 Phương pháp sử dụng phần mềm ABIS để định danh 39 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40 3.1 Khảo sát điều kiện vận chuyển mẫu phân chim yến 40 3.2 Sự hiện diện của một số vi sinh vật có trong nguồn phân chim yến đảo Khánh Hòa 41 3.3 So sánh tỷ lệ nhiễm vi sinh vật của các mẫu phân chim yến trên các đảo yến thuộc tỉnh Khánh Hòa 50 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52 4.1 Kết luận 52 iv 4.2 Kiến nghị 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC v DANH MỤC VIẾT TẮT APW Alkaline Peptone Water Avibase The World Bird Database (Cở sở dữ liệu về động vật lông vũ) BGBL Brilliant Green Bile Lactose Broth BPW Buffer Peptone Water EMB Eosin methylen blue FDA U.S Food and Drug Administration (Cục Quản lý dược phẩm và thực phẩm Mỹ) IOC International Ornithological Committee (Hội điểu học quốc tế) KIA Kligler Iron Agar MR Methyl Red OIE World Organisation for Animal Health (Tổ chức thú y thế giới) PTN Phòng thí nghiệm RV Rappaport - Vassiliadis SCA Simmon Citrate Agar SDA Sabouraud’s Dextrose Agar SPW Saline Peptone Water TCBS Thiosulfate Citrate Bile Salf Sucrose VP Voges - Proskauer WHO World Health Organization (Tổ chức y tế hế giới) XLD Xylose Lysine Desoxycholate vi DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Địa điểm và thời gian thu mẫu 29 Bảng 2.2: Các chủng vi sinh vật sử dụng để khảo sát điều kiện vận chuyển mẫu 30 Bảng 3.1: Kết quả khảo sát điều kiện vận chuyển mẫu 40 Bảng 3.2: Kết quả định danh theo ba phương pháp 47 Bảng 3.3: Kết quả phân lập và định danh một số vi sinh vật từ nguồn phân chim yến đảo Khánh Hòa 49 Bảng 3.4: Tỷ lệ nhiễm vi sinh vật của các mẫu phân chim yến trên các đảo yến thuộc tỉnh Khánh Hòa 50 vii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Tổ của ba loài yến đã được thương mại hóa 3 Hình 1.2: Chim Yến hàng Aerodramus fuciphagus ở Việt Nam 5 Hình 1.3: Bản đồ phân bố của chim Yến hàng Aerodramus fuciphagus trên thế giới 7 Hình 1.4: Bản đồ phân bố của chim Yến hàng Aerodramus fuciphagus tại Việt Nam 8 Hình 1.5: Đảo yến A1 - Hòn Ngoại, Khánh Hòa 9 Hình 1.6: Các hang yến thuộc đảo yến A6 - Hòn Mun, Khánh Hòa 9 Hình 2.1: Vị trí các đảo đã tiến hành thu mẫu phân chim yến 28 Hình 2.2: Sơ đồ quá trình phân lập vi sinh vật 32 Hình 2.3: Bảng kết quả âm tính và dương tính của API 20E 38 Hình 3.1: Chủng E. coli phân lập trên môi trường EMB 42 Hình 3.2: Chủng Samonella enterica subsp. arizonae phân lập trên môi trường XLD 43 Hình 3.3: Chủng Vibrio parahaemolyticus phân lập trên môi trường TCBS 44 1 LỜI MỞ ĐẦU Trong các thức ăn hiếm và quý của phương Đông từ hàng trăm năm nay, tổ yến đứng hàng đầu bảng Bát trân. Chim yến cho tổ trắng phân bố hẹp trên thế giới, chủ yếu tập trung ở khu vực Đông Nam Á, trong đó có Việt Nam. Đất nước ta có bờ biển dài 3444 km, với hơn 4000 hòn đảo và nhiều dãy núi nhô ra biển hình thành các eo, vịnh, đầm, phá có lợi thế phát triển quần thể chim yến đảo. Tổ yến đảo Việt Nam có chất lượng cao hàng đầu thế giới. Theo thống kê sơ bộ của Công ty Yến sào Khánh Hòa, sản lượng tổ yến đảo Việt Nam khoảng 5000 kg/năm. Khánh Hòa là nơi có sản lượng dẫn đầu cả nước trên 3200 kg/năm. Tổ yến được ví von như “vàng trắng của biển”, đã đem lại giá trị xuất khẩu lớn. Khai thác và bảo vệ các đảo yến không chỉ có ý nghĩa lớn cho việc phát triển kinh tế ở địa phương, mà còn gắn liền với việc bảo vệ an ninh quốc phòng biển đảo. Ý thức được giá trị to lớn mà chim yến đảo mang lại, tỉnh Khánh Hòa và Công ty Yến sào Khánh Hòa luôn đề cao việc bảo vệ nguồn lợi quý này. Công tác nghiên cứu duy trì và phát triển số lượng cá thể trong quần thể chim yến trên các đảo yến đã và đang thực hiện tốt trong những năm gần đây. Tuy nhiên, hiện vẫn chưa có nghiên cứu nào về phòng và điều trị bệnh do vi sinh vật gây ra trên chim yến. Từ lý do trên, tôi nghiên cứu đồ án “Bƣớc đầu khảo sát sự hiện diện của một số vi sinh vật có trong nguồn phân chim yến (Aerodramus fuciphagus) tại các đảo yến thuộc tỉnh Khánh Hòa”. Đồ án giúp chúng ta phần nào dự đoán được một số bệnh do vi sinh vật gây ra ở chim yến. Từ đó, đề ra phương pháp xử lý thích hợp nhất để bảo vệ và bảo tồn loài chim quý này. Đồng thời bổ sung các dữ liệu khoa học làm cơ sở cho việc quy hoạch và khai thác bền vững nguồn lợi chim yến Khánh Hòa. Đề tài này nằm trong dự án “An toàn và đa dạng sinh học chim yến” do Công ty Yến sào Khánh Hòa phối hợp với Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường - Trường Đại học Nha Trang thực hiện. 2 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về chim yến 1.1.1 Đặc điểm sinh học và phân bố của chim Yến tổ trắng 1.1.1.1 Đặc điểm sinh học Chim yến là tên gọi chỉ chung cho các loài chim thuộc họ Apodinae. Các loài chim trong họ này đều có đặc điểm chung: kích thước nhỏ, ăn côn trùng, hầu hết đều hót được, làm tổ trong các hang động và có thể điều khiển hướng bay trong hang tối bằng cách sử dụng âm thanh (Griffin, 1958; Medway và Pye, 1977; Lim và Cranbrook, 2002; Phach và cs, 2002). Họ Apodinae chia làm 2 phân họ, 4 tông, 20 chi với khoảng 96 loài (Phil và Gerald, 2000). Cho đến hiện nay, việc phân loại các loài yến thuộc hai chi Collocalia và Aerodramus vẫn chưa rõ ràng. Các tài liệu về phân loại chim yến thuộc hai chi này vẫn chưa có sự thống nhất. Các loài trong chi Aerodramus đôi khi được gộp vào chi Collocalia. Với sự có mặt của một số loài đặc biệt, họ Yến Apodinae đã thu hút được sự quan tâm đặc biệt của giới khoa học: từ các nhà kinh tế học, các nhà sinh thái học, các nhà động vật học cho đến các nhà dinh dưỡng học. Các loài đặc biệt nói trên đều có chung đặc điểm quan trọng mà các loài khác trong họ Yến không có, đó là xây tổ bằng nước dãi và tổ của chúng mang lại giá trị kinh tế rất cao. Cho đến hiện nay, tổ của ba loài yến khác nhau đã được thương mại hóa gồm : Aerodramus fuciphagus - Yến hàng (Yến lông xám hay Yến tổ trắng), Aerodramus maximus - Yến xiêm và Aerodramus unicolor - Yến Ấn Độ (Ali, 1996; Wells, 1999). Theo các tài liệu cũ thì ba loài yến trên thuộc chi Collocalia. Tuy nhiên từ năm 1998 cho tới nay, ba loài yến này lại được xếp vào chi Aerodramus (theo Hội điểu học quốc tế IOC và Cở sở dữ liệu về động vật lông vũ Avibase). Do vậy, trong suốt tài liệu này chúng tôi thống nhất gọi theo phân loại hiện tại là Aerodramus spp. Hai loài Aerodramus maximus và Aerodramus unicolor sử dụng nước dãi trộn lẫn với lông và cỏ kết hợp để xây tổ. Riêng loài Aerodramus 3 fuciphagus chỉ dùng nước dãi của nó để xây tổ; nên tổ của loài Aerodramus fuciphagus được đánh giá rất cao về mặt dinh dưỡng và có giá cao nhất trên thị trường (Kang và Lee, 1991; Rodelphe, 1992; Chantler, 1999; Wells, 1999). Tuy vậy, trên thực tế một số ít tổ Yến hàng Aerodramus fuciphagus vẫn có lông bám vào. Vì trong quá trình làm tổ, chim bố mẹ làm rơi hoặc rụng lông bám vào tổ, không phải chim sử dụng lông để làm nguyên liệu xây tổ. Số lượng lông trên tổ Yến hàng ít hơn rất nhiều so với tổ Yến xiêm và tổ Yến Ấn Độ. (a) Tổ Yến hàng (Aerodramus fuciphagus) (b) Tổ Yến xiêm (c) Tổ Yến Ấn Độ (Aerodramus maximus) (Aerodramus unicolor) Hình 1.1: Tổ của ba loài yến đã đƣợc thƣơng mại hóa Theo ITIS (Integrated Taxonomic Information System - Hệ thống phân loại sinh vật quốc tế) Yến hàng được phân loại như sau : [...]... 000 đồng/kg 1.2 Hệ vi sinh vật trong nguồn phân các loài động vật Vi sinh vật đóng vai trò quan trọng đối với đời sống vật chủ Các vi sinh vật đường ruột có lợi giúp tiêu hóa chất thức ăn, ức chế vi sinh vật có hại, kích thích đáp ứng miễn dịch của cơ thể (Kyle và Kyle, 1993) Một số vi sinh vật sống trên cơ thể vật chủ nhưng không ảnh hưởng đến vật chủ Mặt khác, có một số nhóm vi sinh vật gây ảnh hưởng... bệnh, điều này có thể vô tình làm phát tán bệnh dịch Từ những lý do trên, chúng tôi nghiên cứu “Bƣớc đầu khảo sát sự hiện diện của một số vi sinh vật có trong nguồn phân chim yến (Aerodramus fuciphagus) tại các đảo yến thuộc tỉnh Khánh Hòa Đề tài giúp ta phần nào dự đoán được một số bệnh do vi sinh vật gây ra ở chim yến Từ đó, đề ra phương pháp xử lý thích hợp nhất để bảo vệ và bảo tồn loài chim quý này... còn vi sinh vật gây bệnh, nhưng điều đó không đảm bảo vi c loại hoàn toàn các độc tố do vi sinh vật sinh ra trước đó Điều này có thể làm giảm chất lượng tổ yến và ảnh hưởng đến danh tiếng của yến sào Vi t Nam Ngoài ra, Công ty Yến sào Khánh Hòa còn thu chất thải của chim yến làm chất dẫn dụ chim yến Một lượng lớn phân chim yến được sử dụng để tạo mùi cho các nhà yến mới Nếu trong phân có vi sinh vật. .. trên các test sinh hóa truyền thống Các phương pháp sinh học phân tử ứng dụng trong xác định vi sinh vật mục tiêu có thể qua hoặc không qua bước tăng sinh phân lập 22 Định danh vi sinh vật là so sánh các đặc điểm của vi sinh vật này với các đặc điểm của vi sinh vật đã biết khác vốn đã được phân loại và định danh trước đó Hiện nay có rất nhiều cơ sở dữ liệu phục vụ cho vi c định danh các loài vi sinh vật. .. sào Khánh Hòa, số lượng đảo yến toàn quốc khoảng trên 50 đảo với trên 180 hang yến Trong đó Công ty Yến sào Khánh Hòa có 29 đảo yến với 138 hang yến (Lê Hữu Hoàng, 2011) Một số đảo yến nổi tiếng ở Khánh Hòa: hòn Đôi, hòn Hố, Đun, hòn Tre, hòn Mun, hòn Ngọc, hòn Nội, hòn Ngoại, hòn Nhàn, hòn Chà Là … Hình 1.5: Đảo yến A1 - Hòn Ngoại, Khánh Hòa Hình 1.6: Các hang yến thuộc đảo yến A6 - Hòn Mun, Khánh Hòa. .. spp, Vibrio spp, vi nấm) trong nguồn phân chim yến Aerodramus fuciphagus trong khu vực các đảo yến thuộc tỉnh Khánh Hòa - Giám định hình thái và các đ ặc tính sinh hóa c ủa các chủng vi sinh vật phân lập được Định danh các chủng vi sinh vật phân lập được bằng 2 phương pháp: Khóa phân loại Bergey và sử dụng Kit API 20E 2 27 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tƣợng nghiên cứu 2.1 - Chim yến. .. sóc chim con; xây dựng phương pháp cho chim bay Đó là cơ sở khoa học cho vi c phát triển đàn chim yến tăng số lượng cá thể trong quần đàn ở tỉnh Khánh Hòa để Hiện nay, nhóm nghiên cứu của công ty Yến sào Khánh Hòa cũng đang tiến hành nghiên cứu sự khác nhau về hình thái của chim yến nhà và chim yến đảo phân bố ở Vi t Nam” 1.3.1.3 Các nghiên cứu về vi sinh trên đối tƣợng chim hoang dã Mặc dù hệ vi sinh. .. sung các dữ liệu khoa học làm cơ sở cho vi c quy hoạch và khai thác bền vững nguồn lợi chim yến Khánh Hòa Đề tài này nằm trong dự án “An toàn và đa dạng sinh học chim yến do Công ty yến sào Khánh Hòa phối hợp với Vi n Công nghệ sinh học và môi trường - Trường Đại học Nha Trang thực hiện 1.3.2.2 Mục tiêu a) Mục tiêu của đề tài: Nhằm khảo sát sự hiện diện của các vi sinh vật (tập trung chủ yếu vào các. .. coli, Salmonella spp, Vibrio spp, nấm nen, nấm mốc) phân lập từ phân chim yến đảo Khánh Hòa Aerodramus fuciphagus germani b) Nội dung nghiên cứu của dề tài: - Khảo sát điều kiện vận chuyển mẫu phân Từ đó, tiến hành so sánh và đánh giá để chọn ra điều kiện vận chuyển tối ưu cho mẫu phân chim yến 26 - Bước đầu khảo sát sự hiện diện của một số vi sinh vật (tập trung chủ yếu vào các đối tượng Escherichia... sinh vật mục tiêu - phân lập và định danh Phát hiện vi sinh vật mục tiêu là vi c kiểm tra sự có mặt của các loài (hoặc chi) vi khuẩn, vi nấm Vi sinh vật mục tiêu thường có mặt trong mẫu nghiên cứu (thực phẩm, bệnh phẩm…) với các mật độ khác nhau tùy từng đối tượng và tùy từng thời điểm Thông thường, trong một mẫu nghiên cứu sẽ có rất nhiều loại vi sinh vật khác nhau, do vậy vi sinh vật mục tiêu có thể . 3.1 Khảo sát điều kiện vận chuyển mẫu phân chim yến 40 3.2 Sự hiện diện của một số vi sinh vật có trong nguồn phân chim yến đảo Khánh Hòa 41 3.3 So sánh tỷ lệ nhiễm vi sinh vật của các mẫu phân. Kết quả phân lập và định danh một số vi sinh vật từ nguồn phân chim yến đảo Khánh Hòa 49 Bảng 3.4: Tỷ lệ nhiễm vi sinh vật của các mẫu phân chim yến trên các đảo yến thuộc tỉnh Khánh Hòa 50. khảo sát sự hiện diện của một số vi sinh vật có trong nguồn phân chim yến (Aerodramus fuciphagus) tại các đảo yến thuộc tỉnh Khánh Hòa . Đồ án giúp chúng ta phần nào dự đoán được một số bệnh