Đang tải... (xem toàn văn)
Nếu kiểm soát được sự hình thành cấu trúc dimer của caspase-9 có thể ứng dụng trong điều trị các bệnh ung thư do kích thích tế bào đi vào chu trình apoptosis.. Nhận thấy được những tiềm
Trang 1BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO íNGÔ TIẾNLÝ ĐỨC-TẠO DONG, BIEU HIỆN VÀ TINH CHẾ PROTEIN RHAU -CASPASE-9Trang 2BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH -^0^ -Trang 3 TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨAVIỆT NAM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Độc lập – Tự do – Hạnh phúc KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC GIẤY XÁC NHẬN Tôi tên là: Ngô Tiến Lý Đức Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Y Dược Mã sinh viên: 1653010063 Tôi đồng ý cung cấp toàn văn thông tin khóa luận tốt nghiệp hợp lệ về bản quyền cho Thư viện Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh Thư viện Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh sẽ kết nối toàn văn thông tin khóa luận tốt nghiệp vào hệ thống thông tin khoa học của Sở Khoa học và Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh Trang 4Ý KIẾN CHO PHÉP BẢO VỆ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỦA GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN Giảng viên hướng dẫn: TS ĐẶNG THANH DŨNG Học viên thực hiện: NGÔ TIẾN LÝ ĐỨC Lớp: DH16YD01 Tên đề tài: TẠO DÒNG, BIỂU HIỆN VÀ TINH CHẾ PROTEIN RHAU – CASPASE-9 Ý kiến của giáo viên hướng dẫn về việc cho phép sinh viên Ngô Tiến Lý Đức được bảo vệ khóa luận trước Hội đồng: Đồng ý cho sinh viên được bảo vệ khóa luận tốt nghiệp trước Hội đồng Thành phố Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2020 Người nhận xét Đặng Thanh Dũng Trang 5LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô khoa Công Nghệ Sinh Học trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh đã tận tình giảng dạy, truyền đạt những kiến thức quý giá và hỗ trợ giúp đỡ rất nhiều cho em học tập Em xin chân thành cảm ơn thầy Đặng Thanh Dũng đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất giúp em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Em xin cảm ơn tất cả anh chị tại Trung tâm Khoa học và Công nghệ Sinh học trường Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐHQG TP Hồ Chí Minh, đã tận tình giúp đỡ em trong thời gian làm thực tập tại lab Em cảm ơn chị Hạnh, chị Tươm, chị Phương, chị Phượng, chị Thư, anh Nghĩa đã hỗ trợ giúp đỡ em để hoàn thành khóa luận tót nghiệp này Đặc biệt, chị Thư – boss team, luôn tận tâm, nhiệt tình, đầy nhẫn nại hướng dẫn, giúp đỡ và truyền đạt mọi kinh nghiệm của chị cho em, thật may mắn khi được làm việc với chị Cảm ơn những người bạn cùng khóa Phương Thảo, Tuyễn, sensei kiêm senpai Deshun Lao, anh Tuấn K15, team BD đồng minh hội, đã luôn đồng hành, hỗ trợ mình trong thời gian qua ngồi trên giảng đường Cuối cùng con xin cảm ơn ba má, anh Công và chị Trinh luôn yêu thương chăm sóc, là hậu phương vững chắc của con, em TP.Hồ Chí Minh, tháng 07 năm 2020 Ngô Tiến Lý Đức Trang 61.3.3 Tương tác của protein RHAU với G-quadruplex song song 111.3.4 Các nghiên cứu về protein RHAU 11CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP 142.1.Vật liệu 14Trang 72.1.2.2.Hóa chất điện di DNA 152.1.2.3.Hóa chất dùng trong phản ứng cắt và nối 152.1.2.4.Hóa chất dùng trong tạo tế bào E coli khả nạp 152.1.2.5.Hóa chất dùng trong biểu hiện và tinh chế protein 162.1.2.6.Hóa chất dùng trong chạy SDS – PAGE 162.2.1.2.Tạo vector tái tổ hợp pTD5 232.2.1.3.Biến nạp sản phẩm nối vào E coli OmniMAX 252.2.1.4.Sàng lọc dòng tế bào E coli OmniMAX mang vector pTD5 262.2.1.5.Giải trình tự 282.2.2 Biểu hiện và tinh chế protein RHAU – Caspase-9 28Trang 8GVHD: TS Đặng Thanh Dũng Trang iii Mục lục 2.2.2.1 Tạo chủng E coli BL21(DE3) mang vector tái tổ hợp protein RHAU – Caspase- 9 28 2.2.2.2 Biểu hiện và tinh chế protein RHAU – Caspase-9 trong E coli BL21 (DE3) 29 2.2.2.3.Tinh chế protein dung hợp RHAU – Caspase-9 bằng cột HisTrap 31CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN 353.1.Tạo dòng vector pTD5 353.1.1 Thu nhận gene CASP9 353.1.2 Tạo vector tái tổ hợp pTD5 353.2. Sàng lọc các dòng tế bào E coli OmniMAX mang vector pTD5 373.2.1 Sàng lọc các dòng tế bào E coli OmniMAX mang vector pTD5 bằng PCR khuẩn lạc 373.2.2 Giải trình tự 383.3.Biểu hiện và tinh chế protein RHAU – Caspase-9 39CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ 444.1Kết luận 444.2Kiến nghị 44TÀI LIỆU THAM KHẢO 45PHỤ LỤC 47Trang 9GVHD: TS Đặng Thanh Dũng Trang iv Danh mục chữ viết tắt DNA Deoxyribose Nucleic Acid E coli Escherichia coli His Histidine OD Optical Density PCR Polymerase Chain Reaction RSM RHAU Specific motif SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis TAE Tris-Acetate-EDTA Trang 10GVHD: TS Đặng Thanh Dũng Trang v Danh mục bảng DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Thành phần gel polyacrylamide 12% 16Bảng 2.2 Các plasmid dùng trong thí nghiệm 18Bảng 2.3 Trình tự các mồi dùng trong thí nghiệm 20Trang 11GVHD: TS Đặng Thanh Dũng Trang vi Danh mục hình Hình 1.5 Các phương pháp tạo protein dimer 9Hình 1.6 Sơ đồ protein RHAU 10Hình 2.1 Sơ đồ plasmid pTD2 18Hình 2.2 Thang chuẩn 20Hình 2.3 Quy trình dòng hóa tạo plasmid pTD5 21Hình 2.4 Sơ đồ chương trình chạy PCR thu gene CASP9 23Hình 2.5 Vị trí bắt cặp của mồi cho phản ứng PCR khuẩn lạc 27Hình 2.6 Sơ đồ vị trí mồi cho giải trình tự pTD5 28Hình 2.7 Cấu trúc protein mục tiêu 31Hình 2.8 Quy trình tinh chế protein RHAU – Caspase-9 32Hình 3.1 Kết quả điện di sản phẩm PCR thu gene CASP9 35Hình 3.2 Sơ đồ cấu trúc của vector pTD5 36Hình 3.3 Kết quả biến nạp sản phẩm nối của của vector pTD2 và gene CASP9 36Hình 3.4 Kết quả sàng lọc chủng E coli OmniMAX mang vector pTD5 bằng phản ứng PCR khuẩn lạc 37Hình 3.5 Kết quả so sánh trình tự lý thuyết với trình tự dòng hóa 39Hình 3.6 Kết quả sàng lọc thể biến nạp E coli BL21 (DE3) 40Hình 3.7 Kết quả biểu hiện protein RHAU – Caspase-9 trong E coli BL21 (DE3) 41Hình 3.8 Kết quả tinh chế protein RHAU – Caspase-9 42 Trang 12 Một protein giữ vai trò quan trọng trong con đường nội sinh, đó chính là 9 Caspase-9 chịu trách nhiệm phân cắt protein tại các đuôi chứa aspartate cụ thể và kích hoạt quá trình apoptosis bằng cách làm trung gian truyền tính hiện tử vong kích hoạt protease thực thi gây chết tế bào Tuy nhiên, trong tế bào caspase-9 tồn tại chủ yếu ở dạng procaspase đơn phân không hoạt động (zymogen) hoặc có hoạt tính rất yếu, protein này chỉ được kích hoạt khi được cảm ứng bởi các yếu tố phụ trợ khác Thông qua sự tương tác protein – protein và sự dimer protein, caspase-9 dạng đơn phân sẽ được tập hợp và hình thành cấu trúc dimer, trở thành protein có hoạt tính theo hướng dimer hóa Nếu kiểm soát được sự hình thành cấu trúc dimer của caspase-9 có thể ứng dụng trong điều trị các bệnh ung thư do kích thích tế bào đi vào chu trình apoptosis caspase-Protein RHAU (RNA Helicase Associated with AU-rich Element) là protein thuộc nhóm enzyme RNA helicase có liên kết với vùng trình tự giàu Adenine và Uracil của Trang 13GVHD: TS Đặng Thanh Dũng Trang 2 Đặt vấn đề RNA (Vaughn và cs, 2005) RHAU gồm 1008 amino acid thuộc họ DEAH-box mã hóa bởi gene DHX36 Các nghiên cứu đã chứng minh rằng protein RHAU có liên kết đặc hiệu với G-quadruplex tại 13 amino acid bảo tồn gọi là RSM (RHAU specific motif) G-quadruplex là một phân tử được đánh giá là đầy tiềm năng cho sự dimer protein G-quadruplex có bản chất là những đoạn oligonucleotide (gồm 18 nucleotide giàu G có thể hình thành cấu trúc G-quadruplex) nên có thể dễ dàng đưa vào trong tế bào Đây là cấu trúc tự nhiên được tìm thấy trong tế bào eukaryote, thực hiện nhiều chức năng quan trọng trong tế bào như sao chép, phiên mã, dịch mã và duy trì telomere Ngoài ra, vùng domain ở đầu N của protein RHAU có chức năng bám đặc hiệu và làm bền cấu trúc G-quadruplex song song Điều thú vị, cấu trúc G-quadruplex song song có thể bám đặc hiệu cùng lúc 2 phân tử RHAU peptide Dựa vào những đặc điểm này, G-quadruplex được sử dụng làm chất cảm ứng sự dimer hóa của protein mục tiêu nhờ domain RHAU Nhận thấy được những tiềm năng từ việc liên kết đặc của protein RHAU với cấu trúc G-quadruplex song song ở trên, chúng tôi hướng đến việc sử dụng G-quadruplex để cảm ứng sự dimer của caspase-9 đồng thời tăng hoạt tính caspase-9 trong quá trình apoptosis của tế bào Trong nghiên cứu của chúng tôi, để caspase-9 có hoạt tính theo hướng dimer hóa, chúng tôi thiết kế một vector mang gene mã hóa cho peptide RHAU chứa 30 amino acid dung hợp với caspase-9 Sau đó, sử dụng G-quadruplex làm chất cảm ứng sự dimer hóa Tuy nhiên, vì hạn chế về mặt thời gian nên đề tài bước đầu dừng lại ở thu nhận protein RHAU – Caspase-9, với tên đề tài: “Tạo dòng, biểu hiện và tinh chế protein RHAU – Caspase-9” Đề tài thực hiện những nội dung sau: – Tạo dòng vector pTD5 mã hóa cho protein RHAU – Caspase-9 – Biểu hiện và tinh chế protein bằng phương pháp sắc kí ái lực Trang 14GVHD: TS Đặng Thanh Dũng Trang 3 Tổng quan tài liệu CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU Trang 15GVHD: TS Đặng Thanh Dũng Trang 3 Tổng quan tài liệu 1.1 Protein caspase-9 Caspase là tên viết tắt của protease caspase cysteine (enzyme protease dạng cysteine-aspartic) là một họ của cysteine proteases có tính đặc hiệu đối với các gốc acid aspartic, đóng vai trò quan trọng trong quá trình chết rụng tế bào, hoại tử và sưng viêm (Alnemri và cs, 1996) Trong cơ thể người, đã có 12 loại caspase được nhận diện và chia làm 2 nhóm chính: caspase khởi phát và caspase hành quyết Trong đó, caspase‐9 thuộc nhóm caspase khởi phát và có vai trò quan trọng trong con đường apoptosis qua trung gian ty thể (Chou và cs, 2000) 1.1.1 Khái niệm Protein caspase-9 có kích thước khoảng 46 kDa, là thành viên thuộc caspase, được mã hóa từ gene CASP9, chịu trách nhiệm phân cắt protein tại các đuôi chứa aspartate cụ thể, liên quan đến quá trình apoptosis và tín hiệu cytokine Trong tế bào, caspase-9 tồn tại ở dạng procaspase không hoạt động (zymogen) và chỉ được kích hoạt khi được cảm ứng dimer hóa bởi các yếu tố phụ trợ khác (Bratton & Salvesen, 2010), đơn cử là Apaf-1 được kích hoạt trong apoptosome (Sharon và cs, 2009) Khi được kích hoạt, caspase-9 bắt đầu phân tách caspase-3 và caspase-7 bằng cách phân giải protein Sau khi phân tách, caspase-3 và caspase-7 có hoạt tính và bắt đầu quá trình apoptosis (Chao và cs, 2005) Hình 1.1 Protein caspase-9 Trang 16GVHD: TS Đặng Thanh Dũng Trang 4 Tổng quan tài liệu Caspase-9 có chức năng quan trọng là chuyển đổi tín hiệu tử vong thành sự kiện phân giải protein đầu tiên và trực tiếp làm trung gian kích hoạt protease hành quyết gây apoptosis tế bào, nên việc điều khiển, kiểm soát caspase-9, là một mục tiêu điều trị đầy hứa hẹn cho cả tăng sinh và thoái hóa bệnh tật (Li và cs, 2017) Caspase-9 tồn tại chủ yếu ở trạng thái đơn phân không hoạt động trong tế bào và các phương pháp đơn giản để kiểm soát quá trình dimer hóa caspase-9 độc lập với apoptosome là không có Hạn chế này gây trở ngại rất lớn trong việc kiểm soát quá trình dimer hóa caspase‐9 (T D Dang, 2012) Không giống như các caspase khởi phát khác, bao gồm caspases-2, -8 và -10, vùng prodomain của caspase-9 không bị loại bỏ trong quá trình apoptosis (Bratton & Salvesen, 2010) Vùng xúc tác được chia thành hai tiểu đơn vị: một tiểu đơn vị lớn có kích thước khoảng 20 kDa và một tiểu đơn vị nhỏ có kích thước khoảng 10 kDa (Kuida, 2000) Trang 17GVHD: TS Đặng Thanh Dũng Trang 5 Tổng quan tài liệu Vùng prodomain được liên kết với miền xúc tác bao gồm tiểu đơn vị lớn và tiểu đơn vị nhỏ thông qua một liên kết loop (linker loop) Hoạt động của caspase-9 được kích thích bởi sự dimer hóa thay vì phân cắt, có thể là do liên kết loop dài giữa các tiểu đơn vị (Li và cs, 2017) Thật thú vị khi một sự khác biệt đáng chú ý khác giữa caspase-9 và caspase khởi phát khác, cũng như caspases hành quyết là độ dài của liên kết loop Trong hầu hết các caspase, liên kết này phải được phân tách để cho phép các thay đổi cấu trúc cần thiết cho việc hình thành vị trí hoạt động Tuy nhiên, trong caspase-9, liên kết này đặc biệt dài, nên khi caspase-9 được tuyển chọn và dimer hóa trong apoptosome, liên kết loop được dự đoán sẽ di chuyển và cho phép bám vào vị trí hoạt động mà không có sự phân tách (Bratton & Salvesen, 2010) Hình 1.2 Cấu trúc caspase-9 Thông qua tương tác dimer, các procaspase-9 tương tác với nhau để tạo thành caspase-9 có hoạt tính (Li và cs, 2017) Ngoài ra, không giống như các caspase khác có vùng trình tự bảo tồn là pentapeptide QACRG, Caspase-9 mang vùng trình tự QACGG (Kuida, 2000) Nghiên cứu của Keisuke Kuida cùng các cộng sự, đã chứng tỏ chức năng caspase-9 rất cần thiết cho quá trình apoptosis Cụ thể, nhóm ông tiến hành tạo đột biến gây mất caspase-9 ở chuột nhờ phương pháp nhắm gene mục tiêu Nhóm tác giả báo cáo rằng phần lớn những con chuột đột biến đồng hợp tử chết trong giai đoạn chu sinh do não bị dị tật Nguyên nhân là do giảm quá trình apoptosis ở giai đoạn phát triển não (Kuida và cs, 1998) Trang 18GVHD: TS Đặng Thanh Dũng Trang 6 Tổng quan tài liệu 1.1.3 Cơ chế hoạt động Cơ chế hoạt động của caspase-9 được thể hiện qua Hình 1.3 Hình 1.3 Cơ chế hoạt động của protein caspase-9 Trong điều kiện bình thường, các procaspase-9 tồn tại ở dạng không hoạt động Khi các tế bào nhận được kích thích apoptosis (các tác nhân stress), cytochrom c sẽ được giải phóng khỏi ty thể Một phức hợp holoenzyme đa phân tử được gọi là apoptosome hình thành, bao gồm yếu tố kích hoạt protease apoptotic 1 (Apaf-1), ATP và cytochrom c Apoptosome chịu trách nhiệm tập hợp các procaspase-9 để hình thành protein caspase-9 có hoạt tính theo hướng dimer Sự dimer hóa của caspase-9 dẫn đến sự phân cắt tự xúc tác nhanh chóng, tạo ra caspase-9 (Li và cs, 2017) Sau khi được kích hoạt, caspase-9 bắt đầu phân tách caspase-3 và caspase-7 bằng cách phân giải protein, tiếp đến caspase-3 và caspase-7 sẽ được kích hoạt và hoạt động, báo hiệu cho quá trình apoptosis (Chou và cs, 2000) 1.1.4 Các nghiên cứu về caspase-9 Từ những tiềm năng đầy hứa hẹn, cũng như muốn hiểu rõ hơn về caspase-9, nhiều nhà khoa học đã tiến hành nghiên cứu tìm hiểu về protein này Trang 19GVHD: TS Đặng Thanh Dũng Trang 7 Tổng quan tài liệu Năm 2005, Yang Chao cùng các cộng sự đã công bố nghiên cứu của nhóm về việc tạo ra protein caspase-9 có tiềm năng dimer nhờ thay thế 5 amino acid trong chuỗi β6 nghiên cứu này đã tạo ra protein caspase-9 có bề mặt hình thành được cấu trúc dimer Capase-9 được thay đổi do đột biến có khả năng hình thành homodimer trong buffer và có thể làm tăng hoạt tính caspase-9 gấp 5 lần so với caspase-9 hoang dại Kết quả này có ý nghĩa quan trọng trong nghiên cứu quá trình apoptosis của tế bào hoặc ứng dụng trong điều trị ung thư Trong một nghiên cứu khác, tiến sĩ Đặng Thanh Dũng cùng các cộng sự, sử dụng phân tử cucurbit[8]uril - một siêu phân tử nhỏ làm chất cảm ứng nhằm tăng cường hoạt tính protein caspase-9 Caspase-9 được thiết kế gắn với một motif peptide FGG Nhờ motif FGG này, caspase-9 được dimer hóa thông qua tương tác chọn lọc của cucurbit[8]uril Trong thí nghiệm này, tiến sĩ Đặng Thanh Dũng đã tiến hành dòng hóa plasmid pTWIN1 mang gene mã hóa cho protein FGG – Caspase-9, sau đó biểu hiện plasmid này trong tế bào E coli BL21 (DE3) Sau khi thu nhận và tinh sạch, protein FGG – Caspase-9 được dimer hóa nhờ chất cảm ứng cucurbit[8]uril và tiến hành kiểm tra hoạt tính Kết quả nghiên cứu cho thấy, cấu trúc dimer của caspase-9 nhờ sự cảm ứng của siêu phân tử nhỏ có hoạt tính cao gấp 50 lần so với monomer caspase ‐ 9 (T D Dang, 2012) Trang 20GVHD: TS Đặng Thanh Dũng Trang 8 Tổng quan tài liệu Hình 1.4 Sự dimer protein 1.2.2 Vai trò Tương tác giữa protein – protein và sự dimer protein đóng vai trò quan trọng trong nhiều quá trình sinh học Hầu hết các sự kiện diễn ra trong tế bào sống như hoạt hóa enzyme, điều hòa phiên mã, dịch mã, và thậm chí là khả năng kháng bệnh cũng được điều hòa thông qua sự dimer protein hoặc tương tác protein – protein (Nguyen và cs., 2010) Các nghiên cứu về cấu trúc và sinh lý gần đây cũng cho thấy sự dimer hoặc oligomer hóa protein là yếu tố then chốt trong việc điều hòa các protein như enzyme, kênh ion, thụ thể Ngoài ra, sự kết hợp đó có thể giúp giảm thiểu kích thước bộ gene (Radford và cs, 2010) Mặt khác nó còn điều hòa nhiều hoạt động của tế bào như hoạt hóa prtein caspase-9 kích hoạt apoptosis, hoạt hóa các thụ thể G-protein-coupled receptors (GPCR) trên bề mặt tế bào để dẫn truyền tín hiệu, kích hoạt quá trình sửa chữa,… (Renatus và cs, 2001) 1.2.3 Các phương pháp dimer Quá trình dimer hóa protein giữ vai trò quan trọng trong các quá trình sinh học Vì vậy, nếu kiểm soát được quá trình dimer hóa protein sẽ mang lại nhiều ứng dụng quan trọng bao gồm điều hòa các quá trình sinh học trong tế bào, định vị protein và đáng chú ý là ứng dụng trong liệu pháp tế bào Từ những tiềm năng to lớn trên, cho đến nay, người ta đã tìm ra nhiều cách để hình thành protein dimer như: hình thành cấu trúc dây kéo, gây đột biến bề mặt protein, sử dụng các phân tử từ bên ngoài (như: sử dụng ion kim loại, sử dụng các phân tử nhỏ, hệ thống khách chủ) Trang 21GVHD: TS Đặng Thanh Dũng Trang 9 Tổng quan tài liệu Hình 1.5 Các phương pháp tạo protein dimer Tuy nhiên, trong mỗi phương pháp cảm ứng sự dimer protein vẫn còn tồn tại những hạn chế nhất định Đơn cử, trong phương pháp gây đột biến bề mặt Bằng cách thay đổi một vài trình tự amino acid trong các protein mục tiêu, có thể dẫn đến tiềm năng dimer của chúng Điển hình cho phương pháp này có thể kể đến thí nghiệm hoạt hóa protein caspase-9 Yang Chao cùng các cộng sự, tạo ra protein caspase-9 có tiềm hình thành dimer Protein capase-9 được thay đổi đó có khả năng hình thành homodimer trong buffer và có thể làm tăng sự hoạt hóa enzyme in vitro, có ý nghĩa trong nghiên cứu tế bào Tuy nhiên, hạn chế của phương pháp này đó chính là chỉ thực hiện dimer hóa một chiều, không tác động ngược, tách cấu trúc ra được, gây khó khăn cho các nghiên cứu tìm hiểu cơ chế cũng như điều hòa sự dimer protein 1.3 Protein RHAU 1.3.1 Khái niệm Protein RHAU (RNA Helicase Associated with AU-rich Element) là protein thuộc nhóm enzyme RNA helicase có liên kết với vùng trình tự giàu Adenine và Uracil của RNA (Vaughn và cs, 2005) RHAU gồm 1008 amino acid thuộc họ DEAH-box mã hóa Trang 22GVHD: TS Đặng Thanh Dũng Trang 10 Tổng quan tài liệu bởi gene DHX36, là một loại RNA helicase phụ thuộc vào ATP (Dung Thanh Dang & Phan, 2016) Khi tế bào chịu áp lực căng thẳng, protein RHAU sẽ liên kết với RNA thông tin (mRNA) và tạo thành phức hợp protein và RNA có nồng độ cao để giúp bảo vệ RNA khỏi bị phân hủy từ những điều kiện không thuận lợi đối với tế bào (Chalupníková và cs, 2008) Cấu trúc protein RHAU bao gồm vùng lõi bắt đầu từ vị trí amino acid 204 đến vị trí 625 (dài 422 amino acid), vùng lõi được bao bọc bởi đầu N có độ dài 203 amino acid và đầu C có độ dài 383 amino acid Đầu N của protein RHAU chứa vùng giàu Gly dài 41 amino acid, theo sau là vùng RSM (RHAU Specific motif) dài 13 amino acid (từ amino acid thứ 54 đến 66 tính từ đầu N) và vùng trình tự này là vùng bảo tồn có vai trò domain gắn với motif đặc hiệu (Lattmann và cs, 2010) Hình 1.6 Sơ đồ protein RHAU NTR: đầu N, HCR: lõi helicase, CTR: đầu C 1.3.2 Chức năng sinh học Trong nghiên cứu của Simon Lattmann cùng cộng sự đã chứng minh, protein RHAU tương tác với RNA thông qua 105 amino acid đầu tiên ở đầu N Vùng trình tự RSM nằm trong đầu N của protein RHAU là yếu tố chính để protein RHAU gắn đặc hiệu lên cấu trúc G-quadruplex (Lattmann và cs., 2010) Ngoài ra, những nghiên cứu gần đây cho thấy protein RHAU có vai trò quan trọng trong việc nhận diện và bám vào cấu trúc DNA và RNA G-quadruplex song song để thực hiện chức năng tháo xoắn cấu trúc này nhằm điều hoà các hoạt động sinh học diễn ra trong tế bào Vì vậy, nhiều nghiên cứu đã sử dụng RSM làm domain với chức năng nhận diện, gắn lên G-quadruplex Nghiên cứu năm 2012 của Booy EP chỉ ra rằng Trang 23GVHD: TS Đặng Thanh Dũng Trang 11 Tổng quan tài liệu protein RHAU có khả năng gắn lên và tháo xoắn G-quadruplex ở đầu 5’ của RNA telomerase người trong điều kiện in vitro (Booy và cs, 2014) 1.3.3 Tương tác của protein RHAU với G-quadruplex song song G-quadruplex là cấu trúc bậc hai xuất hiện ở những vùng giàu Guanine có cấu trúc 4 sợi được hình thành bởi những G-tetrad xếp chồng lên nhau Sự hình thành cấu trúc G-quadruplex trong DNA hay RNA đóng vai trò quan trọng trong các quá trình sinh học của tế bào như: sao chép DNA, phiên mã, dịch mã và đặc biệt trong quá trình kéo dài của telomer Do đó, G-quadruplex được xem là mục tiêu quan trọng cho các quá trình điều hòa và kiểm soát các hoạt động của tế bào có liên quan gene (Dũng & Thảo, 2018) Protein RHAU nhận diện và bám vào cả DNA và RNA với ái lực cao thông qua trình tự peptide đặc hiệu ngắn (RSM, RHAU từ amino acid 54 đến amino acid 66) ở vùng đầu N của protein, nhờ đó mà RHAU có thể nhận biết và bám đặc hiệu vào cấu trúc song song của G-quadruplex DNA hoặc RNA (Lattmann và cs , 2010) Nghiên cứu về cấu trúc của phức hợp giữa đoạn RHAU peptide dài 18 amino acid ở đầu N (có chứa trình tự RSM) với G-quadruplex đã cho thấy cơ chế bám của peptide này vào G-quadruplex RHAU peptide bám bao phủ bề mặt G-tetrad và kẹp vào G-quadruplex bằng tương tác tĩnh điện giữa những nhóm phosphate của DNA và những amino acid mang điện tích dương (Heddi và cs, 2015) Ở các G-quadruplex song song thì mặt phẳng G-tetrad ở hai đầu 5’ và 3’ sẽ không bị các loop che khuất như ở G-quadruplex đối song chính vì thế mà RHAU dễ dàng nhận diện và bám lên Với các đặc tính vật lý này, RHAU peptide có thể được xem là phân tử ligand tiềm năng đặc hiệu cho cấu trúc G-quadruplex song song 1.3.4 Các nghiên cứu về protein RHAU Năm 2015 Heddi và những cộng sự công bố nghiên cứu sử dụng peptide RHAU chứa 53 amino acid (gọi tắt là RHAU53), từ vị trí amino acid 53 – 106 của protein Trang 24GVHD: TS Đặng Thanh Dũng Trang 12 Tổng quan tài liệu RHAU cho kết quả bám đặc hiệu lên cấu trúc G-quadruplex song song (Heddi và cs, 2015) Cũng trong nghiên cứu này, đã thử nghiệm gắn các peptide có trình tự acid amin ngắn hơn như: RHAU14, RHAU16, RHAU18, RHAU20, RHAU23 lên G-quadruplex Kết quả thu được peptide có ít nhất 16 amino acid mang trình tự RSM sẽ gắn được lên cấu trúc G-quadruplex, còn RHAU14 không gắn được mặc dù có chứa trình tự RSM (Heddi và cs, 2015) Hình 1.7 Tương tác giữa peptide RHAU18 với G-quadruplex song song (T95-2T) A) góc nhìn bên cạnh B) Sự tương tác phân tử giữa peptide và những guanine của DNA của đầu 5' G-tetrad, các mạch nhánh mang điện tích dương của các amino acid và khung phosphate của DNA Một số nghiên cứu khác, đoạn ngắn peptide RHAU còn được ứng dụng trong việc phát hiện cấu trúc của G-quadruplex để nghiên cứu chức năng của G-quadruplex cũng như điều hòa kiểm soát cấu trúc này Cụ thể, tiến sĩ Đặng Thanh Dũng và cộng sự đã sử dụng kỹ thuật protein tái tổ hợp để tạo ra những protein dò huỳnh quang RHAU-CFP bằng cách dung hợp giữa protein CFP (cyan fluorescent protein) và các đoạn ngắn khác nhau của peptide RHAU Kết quả, protein RHAU-CFP cho tương tác đặc hiệu với cấu trúc G-quadruplex song song với ái lực cao Ðiều thú vị là mẫu dò RHAU-CFP huỳnh quang có thể nhận biết được cấu trúc G-quadruplex song song bằng mắt thường (Dung Thanh Dang & Phan, 2016; Dũng & Thảo, 2018) Trang 25GVHD: TS Đặng Thanh Dũng Trang 13 Tổng quan tài liệu Ngoài ra, năm 2018 Tươm và các cộng sự công bố tạo thành công protein dò huỳnh quang YFP bằng cách dung hợp protein huỳnh quang màu vàng (YFP) với peptide RHAU, tạo ra RHAU-YFP Protein RHAU-YFP này được chứng minh có thể liên kết chọn lọc cấu trúc G-quadruplex song song (T95-2T) Ái lực của đầu dò RHAU-YFP với song song G-quadruplex (T95-2T) là khoảng 130 nM, tương tự như ái lực của RHAU-CFP với G-quadruplex T95-T2 (Kd ~ 124 nM) trong nghiên cứu của tiến sĩ Đặng Thanh Dũng Do đó, đầu dò YFP có thể được mã hóa di truyền trong tế bào để cung cấp một công cụ mạnh mẽ nhằm phát hiện các bộ tứ song song G cả in vitro và in vivo (Truong và cs, 2018) .Trang 26GVHD: TS Đặng Thanh Dũng Trang 14 Vật liệu – Phương pháp CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁPTrang 27GVHD: TS Đặng Thanh Dũng Trang 14 Vật liệu – Phương pháp – Máy đo quang phổ chuyên dụng Nanodrop (GE healthcare) – Máy đọc đĩa 384 giếng (CLARIOstar BMG LabTech) – Máy heat nhiệt (Benchmark) – Máy khuấy từ gia nhiệt (Benchmark) – Máy lắc (Pol-Eko) – Máy ly tâm (Eppendorf Đức) – Máy ly tâm lạnh (Hermle) – Máy PCR (Eppendorf) – Máy phá tế bào bằng sóng siêu âm (Qsonica) – Máy soi gel UV (Ultraviolet) – Máy ủ nhiệt khô (Benchmark) – Máy Vortex (Biocote, Mỹ) – Micro pipette (Eppendorf) – Nồi hấp Autoclave (SS325-TOMY) – Tủ ấm, tủ sấy (Pol-Eko, Ba Lan) Trang 28GVHD: TS Đặng Thanh Dũng Trang 15 Vật liệu – Phương pháp 2.1.2.2 Hóa chất điện di DNA – Agarose (Invitrogen) – SafeView 10,000X (ABM) – Dung dịch nạp mẫu 6X (30% Glycerol; 0,25% bromophenol blue) – Dung dịch điện di DNA TAE 1X (40 mM Tris base; 20 mM acetic acid; 1 mM EDTA pH 8,0) 2.1.2.3 Hóa chất dùng trong phản ứng cắt và nối – Tango Buffer 2X – BglII 10 U/µl (Fermentas) – XhoI 10 U/µl (Fermentas) – T4 ligase 5 U/µl (Fermentas) – T4 DNA ligase buffer 10X (Fermentas) 2.1.2.4 Hóa chất dùng trong tạo tế bào E coli khả nạp – Dung dịch glycerol 100% Trang 29GVHD: TS Đặng Thanh Dũng Trang 16 Vật liệu – Phương pháp 2.1.2.5 Hóa chất dùng trong biểu hiện và tinh chế protein – IPTG 1,0 M – PMSF 0,1 M – DTT 1,0 M – EDTA 0,5 M; pH 8,0 – Dung dịch đệm o Dung dịch Lysis buffer (25 mM Tris – HCl pH 8,0; 250 mM Sucrose) o Dung dịch Binding Buffer (30 mM Tris – HCl pH 8,0; 500 mM NaCl; 2.1.2.6 Hóa chất dùng trong chạy SDS – PAGE – Gel polyacrylamide 12%: thành phần cho gel điện di protein được trình bày Trang 30GVHD: TS Đặng Thanh Dũng Trang 17 Vật liệu – Phương pháp – Dung dịch ly giải (Lysis buffer): Tris – HCl pH 7,2; 15% Sucrose – Dung dịch nạp mẫu Sample buffer 5X: 31,2 ml 0,5 M Tris – HCl, pH 6,8; 12,5 ml g DTT; 5 g SDS; 5 ml Glycerol; 0,025 g Bromophenol blue – Dung dịch điện di 10X (Running buffer): 140 g Glycine; 30 g Tris – HCl; 10 g SDS; nồng độ cuối sử dụng là 1X – Dung dịch nhuộm gel: 2,5 g Coomassive brilliant blue; 500 ml Glacial vừa đủ 1 lít 2.1.2.7 Các hóa chất khác – Kháng sinh: Ampicillin 200 mg/ml được bổ sung vào môi trường nuôi cấy E coli với nồng độ cuối là 100 μg/ml Kháng sinh được giữ ở -20 oC Trang 31GVHD: TS Đặng Thanh Dũng Trang 18 Vật liệu – Phương pháp – Môi trường LB - agar: môi trường LB bổ sung 2% agar 2.1.4 Vật liệu sinh học 2.1.4.1 Chủng vi sinh vật – Chủng chủ dùng trong bước dòng hóa E coli OmniMAXTM (Invitrogen) – Chủng biểu hiện protein mục tiêu dưới sự cảm ứng của IPTG E coli BL21(DE3 (Promega) 2.1.4.2 Plasmid Bảng 2.2 Các plasmid dùng trong thí nghiệm Sơ đồ cấu trúc plasmid pTD2 và pTH705 được trình bày như Hình 2.1 Hình 2.1 Sơ đồ plasmid pTD2 Plasmid pTD2 có chứa T7 promoter dung hợp với gene mã hóa cho peptide RHAU có chiều dài 30 amino acid được dùng làm vector khung sườn cho dòng hóa T7 promoter là một promoter mạnh, sau vài tiếng đã cảm ứng 50% tế bào tổng hợp protein Trang 32GVHD: TS Đặng Thanh Dũng Trang 19 Vật liệu – Phương pháp mục tiêu T7 promoter chỉ nhận diện một loại RNA polymerase duy nhất là T7 RNA polymerase, vì vậy RNA polymerase khác của E coli không thể bám vào vùng T7 promoter và cảm ứng biểu hiện protein mục tiêu Ngoài ra plasmid pTD2 còn chứa vùng gene lacI, mã hóa cho lac repressor Khi chưa có chất cảm ứng IPTG, lac repressor sẽ bám vào lac operon không cho gene T7 tạo ra T7 RNA polymerase, lúc này gene mục tiêu vẫn chưa được biểu hiện IPTG là đồng phân của allolactose, có chức năng cảm ứng như lactose nhưng không bị phân cắt trong tế bào vì vậy có thể cảm ứng protein liên tục trong thời gian tế bào tăng trưởng Việc kết hợp gene lacI và chất cảm ứng tổng hợp IPTG sẽ dễ tầm soát sự biểu hiện protein Bên cạnh đó plasmid pTD2 còn chứa gene kháng kháng sinh Ampicillin để sàng lọc tế bào E coli BL21(DE3) mang gene mục tiêu Vùng gene mã hóa đuôi 6×His được dung hợp với protein RHAU là yếu tố quan trọng giúp tinh chế tốt protein mục tiêu Plasmid pHT705 mang gene CASP9 mã hóa cho protein caspase-9 được sử dụng làm DNA khuôn cho phản ứng PCR thu gene CASP9 Các plasmid pTD2, pHT705 được cung cấp từ Trung tâm Khoa học và Công nghệ Sinh học 2.1.4.3 Mồi Trình tự các mồi sử dụng trong thí nghiệm được trình bày ở Bảng 2.3 Các mồi này tự thiết kế bởi Trung tâm Khoa học và Công nghệ Sinh học chỉ bắt đặt hiệu lên các vector của Trung tâm Ngoài ra, tính đặc hiệu của các mồi sử dụng trong bài đã được kiểm tra bằng phương pháp BLAST trên cơ sở dữ liệu genbank