Đang tải... (xem toàn văn)
Chuyên Đề Khóa Luận Tốt Nghiệp Nhằm tiếp cận về hướng nghiên cứu về đặc điểm phân tử của một số bệnh lý rối loạn chuyển hóa cholesterol, lipid và bệnh lý liên quan đến tim mạch, trong ph
Trang 1KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Đề tài:
NGHIÊN CỨU TÍNH CHẤT ĐỘT BIẾN NỔI TRỘI TRÊN GEN
SỐ MẪU BỆNH PHẨM (MẪU MÁU) CỦA NGƯỜI VIỆT NAM
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Y DƯỢC
CBHD: PGS.TS Lê Huyền Ái Thúy
Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 6 năm 2019
Trang 2BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Đề tài:
NGHIÊN CỨU TÍNH CHẤT ĐỘT BIẾN NỔI TRỘI TRÊN GEN
SỐ MẪU BỆNH PHẨM (MẪU MÁU) CỦA NGƯỜI VIỆT NAM
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Y DƯỢC
CBHD: PGS.TS Lê Huyền Ái Thúy
Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 6 năm 2019
Trang 3LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn Quý Thầy Cô Khoa Công nghệ Sinh học trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh đã tận tình dạy bảo em trong những năm vừa qua Quý Thầy Cô chính là những người đã truyền đạt những kiến thức quý báu để làm hành trang cho em bước vào đời
Đặc biệt nhân dịp này, em xin tỏ lòng biết ơn chân thành nhất của mình tới PGS.TS Lê Huyền Ái Thúy và ThS Trương Kim Phượng là những người đã tận tình chỉ ra hướng nghiên cứu, hướng dẫn, quan tâm, động viên và giúp đỡ từng bước của em trong quá trình thực hiện chuyên đề khóa luận tốt nghiệp
Đồng thời em cũng xin gửi lời cảm ơn của mình đến các bạn trong phòng thí nghiệm Sinh Học Phân Tử đã hết lòng giúp đỡ em thực hiện chuyên đề khóa luận tốt nghiệp này
Sau cùng, em xin gửi lời biết ơn sâu sắc nhất của mình đến gia đình và người thân đặc biệt là bố mẹ em Mọi người đã dõi theo, ủng hộ, quan tâm và động viên em rất nhiều trong quá trình thực hiện chuyên đề khóa luận tốt nghiệp
Sinh viên
Phạm Thị Mộng Tuyền
Trang 4Chuyên Đề Khóa Luận Tốt Nghiệp
PCSK9 Proprotein Convertase Subtilisin/Kexin – 9
Trang 5DANH MỤC BẢNG
Bảng II.1 Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi PCSK9_MF3- PCSK9_MR3 12 Bảng II.2 Chu trình luân nhiệt với cặp mồi PCSK9_MF3- PCSK9_MR3 12 Bảng III.1 Kết quả phân tích sự tương quan giữa tỷ lệ xuất hiện đột biến trên gen
PCSK9 và bệnh FH từ các công bố nghiên cứu khoa học 18
Bảng III.2 Kết quả phân tích sự tương quan giữa tỷ lệ xuất hiện đột biến các exon
trên gen PCSK9 từ các công bố nghiên cứu khoa học 18
Bảng III.3 Kết quả phân tích sự tương quan giữa tỷ lệ xuất hiện đột biến trên gen
MTHFR C677T và bệnh FH từ các công bố nghiên cứu khoa học 21
Bảng III.4 Kết quả phân tích sự tương quan giữa tỷ suất chênh xuất hiện đột biến trên
gen MTHFR C677T và bệnh FH từ các công bố nghiên cứu khoa học 22 Bảng III.5 Một số bộ mồi khuếch đại vùng gen MTHFR C677T 26 Bảng III.6 Thông số vật lý của một số bộ mồi khuếch đại thuộc gen MTHFR C677T
27 Bảng III.7 Kết quả phân tích độ tương đồng của các cặp mồi với trình tự tham chiếu NC_000001.11 bằng công cụ BLAST 27 Bảng III.8 Kết quả kiểm tra độ tương đồng của các cặp mồi với trình tự tham chiếu NC_000001.11 và NM_005957.4 bằng công cụ Annhyb 28
Bảng III.9 Một số bộ mồi khuếch đại vùng gen PCSK9 30
Bảng III.10 Thông số vật lí của các cặp mồi được khảo sát bằng công cụ Oligo analyzer IDT 3.1 và Annhyb 30 Bảng III.11 Kết quả kiểm tra độ tương đồng của các cặp mồi với trình tự tham chiếu
NC_000001.11 (gen PCSK9) bằng công cụ BLAST 31
Bảng III.12 Kết quả kiểm tra độ tương đồng của các cặp mồi với trình tự tham chiếu NC_000001.11 và NG_009061.1 bằng công cụ Annhyb 31
Bảng III.13 Thông tin bộ mẫu bệnh phẩm và tính chất đột biến trên exon 2 gen PCSK9
34
Bảng III.14 Kết quả xác định vị trí các biến thể/đột biến exon 2 gen PCSK9 xuất hiện
trên ba mẫu bệnh phẩm M1, M2, M3 bằng công cụ CodonCode Aligner 35
Trang 6Chuyên Đề Khóa Luận Tốt Nghiệp
Bảng V.1 Kết quả đo quang phổ DNA bộ gen trong phân tích đột biến exon 2 trên
gen PCSK9 51 Bảng V.2 Bộ dữ liệu công trình nghiên cứu thể đột biến C677T trên gen MTHFR của
14 công bố khoa học 51
Bảng V.3 Bộ dữ liệu công trình nghiên cứu thể đột biến exon 2 trên gen PCSK9 của
17 công bố khoa học 52
Trang 7
DANH MỤC HÌNH
Hình III.1 Sơ đồ quy trình trích xuất dữ liệu trong phân tích tổng hợp tính chất đột
biến trên gen PCSK9 13
Hình III.2 Sơ đồ quy trình trích xuất dữ liệu trong phân tích tổng hợp tính chất đột biến C677T trên gen MTHFR 14
Hình III.3 Đồ thị “Funnel plot” đánh giá tính bất đồng nhất đột biến trên gen PCSK9 theo mô hình R, trên 17 công bố khoa học 16
Hình III.4 Đồ thị “Forest plot” phản ánh tỷ lệ xuất hiện đột biến trên gen PCSK9 theo mô hình R, trên 17 công bố khoa học 16
Hình III.5 Đồ thị “Funnel plot” đánh giá tính bất đồng nhất đột biến C677T trên gen MTHFR theo mô hình R, trên 14 công bố khoa học 19
Hình III.6 Đồ thị “Forest plot” phản ánh tỷ lệ xuất hiện đột biến C677T trên gen MTHFR theo mô hình R, trên 14 công bố khoa học 19
Hình III.7 Kết quả BLAST trình tự tham chiếu NC_000001.11: 11.785.730 – 11.806.103 trên gen MTHFR C677T 25
Hình III.8 Kết quả xác định vị trí hoạt động của cặp mồi M_F1-M_R1 trên trình tự tham chiếu NC_000001.11 bằng công cụ ANNHYB 28
Hình III.9 Kết quả BLAST trình tự tham chiếu NC_000001.11 trên gen PCSK9 29
Hình III.10 Mồi PCSK9-MF3 và PCSK9-MR3 trên trình tự NG_009061.1 32
Hình III.11 Kết quả điện di sản phẩm PCR 33
Hình III.12 Dạng đột biến c.218G>A trên mẫu M3 (thể dị hợp) 36
Hình III.13 Dạng đột biến c.348T>A trên mẫu M3 (thể dị hợp) 36
Hình III.14 Dạng đột biến c.359C>T trên mẫu M3 (thể dị hợp) 37
Hình III.15 Dạng đột biến c.399+47A>T trên mẫu M2 (thể dị hợp) 37
Hình III.16 Dạng đột biến c.399+7C>T trên mẫu M3 (thể dị hợp) 38
Hình III.17 Dạng đột biến c.399+25C>T trên mẫu M3 (thể dị hợp) 38
Hình III.18 Dạng đột biến c.399+44G>A trên mẫu M3 (thể dị hợp) 39
Hình III.19 Dạng đột biến c.399+70G>A trên mẫu M3 (thể dị hợp) 39
Trang 8Chuyên Đề Khóa Luận Tốt Nghiệp
2.1 Đặc điểm chính 2
2.2 Chức năng 2
2.3 Tính chất đột biến trên gen PCSK9 và bệnh cao cholesterol trong máu có tính gia đình 3
2.4 Tình hình nghiên cứu đột biến của gen PCSK9 trên thế giới 3
3 Gen Methyltetrahydrofolate reductase (MTHFR) 4
3.1 Đặc điểm chính 4
3.2 Chức năng 4
3.3 Tính chất đột biến trên gen MTHFR và bệnh cao cholesterol máu có tính gia đình 5 3.4 Tình hình nghiên cứu đột biến của gen MTHFR trên thế giới 5
4 Phương pháp nghiên cứu 6
4.1 Phương pháp phân tích tổng hợp (Meta–analysis) 6
4.2 Phương pháp PCR kết hợp giải trình tự (PCR - Sequencing) 7
PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 8
1 Vật liệu 8
1.1 Công cụ phần mềm 8
1.2 Công cụ trực tuyến 8
1.3 Bộ mẫu bệnh phẩm 8
Trang 92 Phương pháp 8
2.1 Phương pháp khai thác dữ liệu và phân tích tổng hợp 8
2.2 Khảo sát trên máy tính (In silico) 9
2.4 Khảo sát thực nghiệm 10
PHẦN III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 13
1 Kết quả thu thập dữ liệu và phân tích tổng hợp 13
1.1.Tính chất đột biến trên gen PCSK9 15
1.2 Tính chất đột biến trên gen MTHFR 18
2 Kết quả khảo sát In silico 25
Trang 10Chuyên Đề Khóa Luận Tốt Nghiệp
ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh cao cholesterol trong máu có tính gia đình (Familial Hypercholesterolemia - FH) là bệnh lý rối loạn di truyền, liên quan đến quá trình chuyển hóa lipoprotein tỷ trọng thấp (Low Density Lipoproteins - LDLs) Bệnh FH là nguyên nhân dẫn đến tăng nguy cơ mắc sớm một số bệnh lý về tim mạch: bệnh mạch vành, xơ vữa động
mạch… (Klose et al., 2014)
Nguyên nhân dẫn đến bệnh cao cholesterol trong máu có tính gia đình là do sự xuất hiện tính chất đột biến trên một số gen có vai trò trong chuyển hóa cholesterol và
lipid, điển hình là gen PCSK9 (Proprotein Convertase Subtilisin/Kexin - 9 (Soutar et
al., 2007) Hơn nữa, một số công bố khoa học ghi nhận về sự tương quan giữa tính
chất đa hình trên gen Methylenetetrahydrofolate Reductase (MTHFR) và bệnh lý thừa cân, béo phì và rối loạn mỡ máu ở bệnh nhân Trung Quốc (Zhi et al., 2016)
Tăng homocysteine (Hcy) gây ra các bệnh lý về tim mạch và não, dẫn đến tử vong
sớm do các biến chứng mạch máu (Mudd et al., 1983) McCully quan sát thấy các
tổn thương động mạch xảy ra ở những trường hợp trẻ em bị rối loạn bẩm sinh sự
chuyển hóa (McCully et al., 1969) Theo công bố của Mudd và cộng sự (1983), Hcy
có vai trò trong sự hình thành xơ vữa động mạch và có thể cải thiện tình trạng rối loạn Hcy bằng cách bổ sung vitamin B ở những bệnh nhân “Cystathionine b-synthase -CBS” Liệu pháp giảm Hcy được áp dụng có thể giúp phòng ngừa bệnh não do thiếu
Methylenetetrahydrofolate Reductase (MTHFR) (Strauss et al., 2007)
Gen PCSK9 mã hóa proprotein convertase subtilisin/kexin loại 9a (PCSK9), một
thành viên của phân họ proteinase K, giữ vai trò quan trọng trong cơ chế chuyển hóa
cholesterol và acid béo Gen PCKS9 gồm 13 exon Những đột biến trong gen PCSK9
gây ra một dạng tăng cholesterol trong máu có tính chất gia đình ở thể trội (NCBI, GeneCard)
Gen Methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) mã hóa protein xúc tác sự
chueyern hóa 5,10 - methylenetetrahydrofolate thành 5 - methyltetrahydrofolate, và sự tái gắn methyl hóa trên phân tử homocysteine để chuyển thành methionine Một
số dạng biến thể xuất hiện trên gen MTHFR (C677T ), dẫn đến nồng độ
homocysteine huyết tương cao bất thường (NCBI, GeneCards)
Trang 11PHẦN I: TỔNG QUAN
Trang 12Chuyên Đề Khóa Luận Tốt Nghiệp
Nhằm tiếp cận về hướng nghiên cứu về đặc điểm phân tử của một số bệnh lý rối loạn chuyển hóa cholesterol, lipid và bệnh lý liên quan đến tim mạch, trong pham vi
chuyên đề khóa luận tốt nghiệp, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tính chất
đột biến nổi trội trên gen MTHFR (exon 4) và gen PCSK9 (exon 2) đối với một
số mẫu bệnh phẩm (mẫu máu) của người Việt Nam”
Mục tiêu: bước đầu tìm hiểu sự tương quan giữa đặc điểm phân tử về các dạng biến
thể (đa hình/đột biến điểm) xuất hiện trên gen MTHFR, gen PCSK9 và một số bệnh
lý rối loạn chuyển hóa và bệnh cao cholesterol trong máu có tính gia đình Nội dung nghiên cứu:
− Khai thác dữ liệu và phân tích tổng hợp để xác định về sự tương quan giữa sự
xuất hiện các dạng biến thể trên gen MTHFR, gen PCSK9 và các dạng bệnh
lý rối loạn chuyển hóa, cụ thể là bệnh lý bệnh cao cholesterol trong máu có tính gia đình và các bệnh lý tim mạch,
− Tìm hiểu và kiểm tra lại thông số của bộ mồi phù hợp với quy trình PCR kết
hợp với giải trình tự để xác định các dạng biến thể trên gen MTHFR và gen
PCSK9 trên DNA bộ gen người
− Trong điều kiện thực tế, tiếp tục kế thừa kết quả cùng nhóm nghiên cứu, thực hiện quy trình tách chiết DNA bộ gen từ một số mẫu máu và phản ứng PCR
khuếch đại trình tự mục tiêu: exon 2 gen PCSK9 và gửi giải trình tự các sản
phẩm PCR có kích thước dự kiến Từ đó, hướng đến việc phân tích đặc điểm
phân tử của vùng trình tự exon 2 gen PCSK9 thuộc DNA bộ gen của người
Việt Nam
Trang 13PHẦN I: TỔNG QUAN
1 Bệnh cao cholesterol trong máu có tính gia đình (Familial Hypercholesterolaemia - FH) cũng như một số bệnh lý liên quan: mạch máu, đột quỵ
Bệnh cao cholesterol trong máu có tính gia đình (Familial Hypercholesterolaemia - FH) là bệnh lý di truyền tính trội trên nhiễm sắc thể thường, dẫn đến sự rối loạn chuyển hóa cholesterol trong máu và có biểu hiện bởi sự tăng cao bất thường lượng Low Density Lipoprotein - Cholesterol (LDL - C) trong huyết tương/máu Bệnh FH chính là nguy cơ cao dẫn đến bệnh lý xơ vữa động mạch và động mạch vành
(Cardiovascular disease - CVD) (Hartgers et al., 2015; Brown et al., 1986)
Nguyên nhân chính dẫn đến bệnh lý FH là tính chất đa hình, đột biến xuất hiện trên
gen mã hóa protein chuyển hóa lipid trong máu: Low Density Lipoprotein Receptor (LDLR), Apolipoprotein B (ApoB) hoặc Protein convertase subtilisin/kexin 9 (PCSK9), Methyltetrahydrofolate reductase (MTHFR) (Hovingh et al., 2013; Kawashiri et al., 2000)
Bệnh lý FH ở hai dạng là thể dị hợp tử (Heterozygous Familial hypercholesterolaemia - HeFH) và thể đồng hợp tử (Homozygous Familial Hypercholesterolaemia - HoFH) Tỷ lệ mắc bệnh HeFH là 1:500 và HoFH là 1:1.000.000 Ở bệnh nhân mắc bệnh lý HeFH, lượng cholesterol toàn phần và lượng LDL - C lần lượt trong khoảng 350-550 mg/dL và 200-400 mg/dL Trong khi ở bệnh nhân mắc bệnh lý HoFH, lượng cholesterol toàn phần và lượng LDL - C lần lượt trong khoảng 650-1000 mg/dL và >
600 mg/dL (Hovingh et al., 2013; Patel et al., 2015) Hơn nữa, bệnh lý FH dẫn đến
nguy cơ mắc bệnh CHD lớn hơn 50% ở tuổi 50 của nam giới và nguy cơ mắc bệnh
CHD cao hơn 30% ở tuổi 60 của phụ nữ (Patel et al., 2015) và mắc sớm bệnh lý CAD và CVD (Nordestgaard et al., 2013) Tỷ lệ bệnh nhân FH mắc các bệnh lý khác xấp xỉ trong khoảng 1:300 – 1:500 (Hopkins et al., 2011)
Tổ chức EAS (European Athetosclerosis Society) ghi nhận tỷ lệ mắc bệnh FH được chẩn đoán là 71% ở Hà Lan, 43% ở Na Uy và 6% ở Tây Ban Nha (Najam and Ray,
2015) Ở Mỹ, có khoảng 620.000 bệnh nhân mắc FH (Hopkins et al., 2011) Ở các
Trang 14Chuyên Đề Khóa Luận Tốt Nghiệp
quần thể người Canada gốc Pháp và người Phi gốc Phi, tỷ lệ mắc bệnh FH có thể lên
Artery Disease - CAD) và CHD (Nordestgaard et al., 2013)
2 Gen Proprotein convertase subtilisin/kexin 9 (PCSK9)
2.1 Đặc điểm chính
Gen PCSK9 (Proprotein convertase subtilisin/kexin 9) định vị trên nhiễm sắc thể người 1p32, gồm 13 exon (Abifadel et al., 2003; Seidah et al., 2014; NCBI) Gen
PCSK9 mã hóa protein PCSK9 – là một dạng protease serine, được sản xuất bởi tế
bào gan (Najam & Ray, 2015)
2.2 Chức năng
PCSK9 có vai trò trong cơ chế chuyển hóa cholesterol trong cơ thể người, thông qua
quá trình tái chuyển hóa/kiểm soát lượng LDLR trên bề mặt tế bào và kiểm soát lượng LDL - C (Miyake et al., 2008; Najam & Ray., 2015)
Ở trạng thái tiền chất: “ProPCSK9” là thể “Subtilisin kexin isoenzyme - 1 (SKI - 1)/ site - 1 - protease (S1P)” có trọng lượng 75 kiloDalton ProPCSK9 có vai trò quan trọng trong quá trình cân bằng nội môi cholesterol thông qua việc xử lý các protein
Trang 15liên kết nguyên tố điều hòa Sterol (Abifadel et al., 2003) “ProPCSK9” được biến đổi
trong lưới nội chất theo cơ chế tự xúc tác (Autocatalyse) để tạo thành PCSK9 trưởng thành có trọng lượng 62 kiloDalton với cấu trúc protein gồm có: vùng peptide tín hiệu (1-30 amino acid), một prodomain (31-152 amino acid), một xúc tác (153-421 amino
acid) và một miền C-terminal (422-692 amino acid) (Nozue et al., 2017) Protein
PCSK9 chủ yếu được sinh tổng hợp bởi tế bào gan và biểu hiện cao trong ruột và thận
(Nozue et al., 2017)
PCSK9 tăng cường hoạt động dẫn đến thúc đẩy hoạt động thủy giải protein thụ thể
LDLR trong thể endosome và lysosome ở gan thụ thể lipoprotein mật độ thấp (LDLR), dẫn đến tăng nồng độ LDL - C trong huyết thanh (Nozue et al., 2017) Sự rối loạn ở cấp độ phân tử: nucleic acid (gen, mRNA) và protein đối với gen PCSK9 là nguyên nhân dẫn đến rối loạn nồng độ LDL – C trong máu (Nozue et al., 2017)
2.3 Tính chất đột biến trên gen PCSK9 và bệnh cao cholesterol trong máu có
tính gia đình
Tính chất đột biến trên gen PCSK9 là một trong những nguyên nhân di truyền, dẫn
đến bệnh lý cao cholesterol trong máu có tính chất gia đình ở thể trội (NCBI; GeneCard) Theo công bố khoa học của Nordestgaard (2013) có khoảng 20 dạng đột
biến xuất hiện gen PCSK9 và tỷ lệ mắc bệnh FH do đột biến trên gen PCSK9 chiếm khoảng 1% (Nordestgaard et al., 2013)
2.4 Tình hình nghiên cứu đột biến của gen PCSK9 trên thế giới
Di Taranto và cộng sự (2017) xác định một số dạng biến thể xuất hiện trên gen PCSK9
gây nên bệnh lý FH: (1) Dạng rối loạn làm giảm chức năng protein PCSK9 (Loss Of Function - LOF) gây nên tăng lượng LDLR trên màng tế bào và thúc đẩy sự chuyển hóa và giải phóng cholesteorl vào máu; (2) Dạng rối loạn làm tăng chức năng protein PCSK9 (Gain Of Function - GOF) dẫn đến làm giảm lượng LDLR và làm tăng lượng
LDL - C (Patel et al., 2015; Di Taranto et al., 2017)
Công trình nghiên cứu của Rashid và cộng sự (2005) sử dụng mô hình chuột để chứng
minh tính chất đột biến ở gen PCSK9 làm gián đoạn chức năng bình thường của
PCSK9 và còn làm giảm lượng LDL - cholesterol và làm tăng tác dụng hạ lipid máu
của statin (Rashid et al., 2005) Năm 2005, Cohen và cộng sự nghiên cứu và phát hiện
Trang 16Chuyên Đề Khóa Luận Tốt Nghiệp
hai đột biến vô nghĩaY142X và C679X trong PCSK9 có liên quan tới việc giảm 40%
nồng độ LDL – C Những đột biến này phổ biến ở người Mỹ gốc Phi (tần số 2%)
nhưng hiếm gặp ở người Mỹ gốc Châu Âu (<0.1%) (Cohen et al., 2005)
Công bố khoa học của Di Taranto và cộng sự (2017) xác định một số dạng biến thể
trên gen PCSK9 thuộc dạng GOF: thể p (Arg357Cys) và p (Ser636Arg), là đặc điểm phân tử của bệnh FH (Di Taranto et al., 2017) Công trình nghiên cứu của Davidson và cộng sự (2018) nghiên cứu thử nghiệm dung nạp của chất ức chế PCSK9 ở bệnh nhân tự dung nạp statin Việc bổ sung liệu pháp ức chế PCSK9 được dung nạp tốt ở
bệnh nhân có tiền sử không dung nạp statin Tác giả tìm ra tỷ lệ ngưng thuốc ức chế
PCSK9 thấp và tỷ lệ thành công cao trong điều trị ức chế PCSK9 sau khi không dung
nạp (Davidson et al., 2018)
3 Gen Methyltetrahydrofolate reductase (MTHFR) 3.1 Đặc điểm chính
Gen MTHFR nằm trên nhiễm sắc thể số 1 (1p36.3), bao gồm 12 exon, mã hóa protein
MTHFR Đây là dạng protein “dimeric” có trọng lượng khoảng 77 kiloDalton
(Goyette et al., 1994) với khoảng 656 acid amin (Froese et al., 2018)
3.2 Chức năng
Protein MTHFR giữ vai trò trong quá trình chuyển hóa amino acid, hình thành các cấu trúc protein và là enzyme xúc tác phản ứng hóa học liên quan đến sự hình thành
vitamin B9, còn được gọi là folate (Real et al., 2010)
Protein MTHFR là dạng enzyme Methylenetetrahydrofolate reductase tham gia vào sự biến đổi 5,10 - methylene - tetrahydrofolate (CH2-THF) thành 5 - methyl - tetrahydrofolate (CH3-THF) Đây phản ứng tạo ra dạng đồng cơ chất (CH3-THF) cần thiết cho quá trình chuyển hóa gồm nhiều bước để chuyển hóa homocysteine huyết
tương tạo thành methionine, theo dạng methyl hóa lặp lại (remethylation) (Froese et
al., 2018)
Trong trường hợp gen MTHFR bị đột biến dẫn đến chức năng của protein MTHFR
bị hỏng, hệ quả làm cho lượng homocysteine huyết tương tăng cao, làm giảm lượng folate (vitamin B9) cũng như các amino acid khác, gây nên hiện tượng huyết khối
(Frosst et al., 1995)
Trang 173.3 Tính chất đột biến trên gen MTHFR và bệnh cao cholesterol máu có tính
gia đình
Công trình nghiên cứu của Frosst và cộng sự (1995) ghi nhận tính chất đa hình
MTFHR C677T là dạng đột biến xảy ra ở nucleotide 677 của gen MTHFR, dẫn đến
nucleotide C đổi thành T, làm cho cấu trúc protein MTHFR bị sai hỏng tại amin acid
222: Alanine (A) bị thay thế bởi Valine (V) (Frosst et al., 1995)
Công trình nghiên cứu của Kawashiri và cộng sự (2000) ghi nhận lượng homocysteine huyết tương tăng nhẹ là một yếu tố nguy cơ độc lập/đặc trưng đối với bệnh xơ vữa động mạch, bệnh động mạch vành (CAD) Bên cạnh đó, nhóm tác giả
chứng minh các dạng đột biến xuất hiện trên gen MTHFR dẫn đến tiến triển bệnh
CHD với biểu hiện tăng nồng độ Hcy huyết tương ở những bệnh nhân FH nam giới
(Kawashiri et al., 2000) Đồng thời, Kawashiri và cộng sự (2000) xác định tính chất
đa hình C677T là nguyên nhân dẫn đến sự rối loạn nồng độ homocysteine huyết tương: theo hướng tăng cao hơn, đối với các bệnh nhân có xuất hiện tính đa hình
C677T ở thể dị hợp tử và thể đồng hợp tử (Kawashiri et al., 2000)
3.4 Tình hình nghiên cứu đột biến của gen MTHFR trên thế giới
Công trình nghiên cứu của Tonstad và cộng sự (1997, 1998) ghi nhận tính chất đa
hình C677T gen MTHFR xuất hiện ở các bệnh nhân trẻ nhỏ mắc bệnh FH và có nguy cơ mắc CHD khi biểu hiện Hcy huyết tương cao (Real et al., 2010)
Tiếp đến, Westerbuck và cộng sự (2001) chứng minh trong trường hợp homocysteine cao trong máu dẫn đến tác động đến chức năng của protein SREBP (Sterol Regulatory Element Binding Proteins) có liên quan với sự biểu hiện tăng cholesterol, triglyceride sự tích tụ cholesterol trong máu Hơn nữa, Mikael và cộng sự (2006) chứng minh rằng lượng homocysteine cao trong máu (giá trị homocysteine huyết tương > 14
μmol/L dẫn đến làm giảm HDL - C trong huyết tương ở các bệnh nhân CHD (Real et
al., 2010)
Real và cộng sự (2010) phân tích sự xuất hiện đa hình C677T gen MTHFR trên các
bệnh nhân có tiền sử gia đình: giá trị huyết tương Hcy cao trong máu tăng cholesterol máu có tính gia đình ở thể dị hợp tử Pinciotta và cộng sự (2005) ghi nhận tính chất đa hình C677T (thể dị hợp CT) xuất hiện trên nhóm bệnh nhân FH ở độ tuổi trưởng
Trang 18Chuyên Đề Khóa Luận Tốt Nghiệp
thành (249 mẫu) là yếu tố nguy cơ chính dẫn đến mắc bệnh CHD và có thể có biểu
hiện lâm sàng là Hcy huyết tương tăng cao (Real et al., 2010)
Công trình nghiên cứu của Froese và cộng sự (2018) xác định tính chất đa hình (đột
biến) diễn ra trên gen MTHFR là c.677C>T là yếu tố nguy cơ dẫn đến các rối loạn
bệnh lý huyết khối mạch máu, bệnh thần kinh, tiểu đường, sảy thai và có thể dẫn đến
các bệnh lý ung thư (Froese et al., 2018)
4 Phương pháp nghiên cứu
4.1 Phương pháp phân tích tổng hợp (Meta –analysis)
Phân tích tổng hợp là công cụ đánh giá dữ liệu có tính hệ thống và là công cụ đắc lực
trong những nghiên cứu thực chứng (Zwahlen et al., 2008) Phân tích tổng hợp nhằm
giải quyết những vấn đề không đồng nhất (có sự khác nhau) về kết quả khảo sát biến số (các yếu tố/nguyên nhân dẫn đến các bệnh lý, kết quả đáp ứng điều trị bằng các loại thuốc… ), từ đó kết quả phân tích tổng hợp phản ánh rõ nét tính chất đặc trưng của biến số được khảo sát và lời câu hỏi bạn đang hỏi hay liệu có cần nghiên cứu
thêm không (Rodseth et al., 2016)
Phân tích tổng hợp theo phương pháp thống kê trên mô hình phân tích tổng hợp ảnh hưởng bất biến (Fixed effects meta-analysis - F) hoặc mô hình phân tích tổng hợp ảnh hưởng ngẫu nhiên (Random effects meta-analysis - R) cho một tiêu chí nhị phân (a dichotomous outcome) với khoảng tin cậy 95% (CI) Tiêu chí lựa chọn mô hình
phân tích tổng hợp (Ryan R et al., 2013) dựa vào chỉ số I2 phản ánh tính bất đồng nhất về biến số khảo sát trong bộ dữ liệu:
- Khi I2<50% và P≥0,1: phân tích tổng hợp hướng theo mô hình ảnh hưởng bất biến (Fixed-effects models)
- Khi I2>50% và P<0,1: phân tích tổng hợp hướng theo phân tích tổng hợp ảnh hưởng ngẫu nhiên (Random effects models)
Một số bước thực hiện phân tích tổng hợp (Basu et al., 2017):
Bước 1: Đặt câu hỏi hoặc từ khóa để tìm hiểu/thu thập dữ liệu dựa trên cơ sở lý thuyết
Bước 2: Tiến hành tìm hiểu/thu thập dữ liệu trên các cơ sở dữ liệu khoa học đáng tin cậy: Pubmed/Medline, Google Scholar, NCBI,
Trang 19Bước 3: Phân loại, chọn lọc bài báo khoa học dựa vào thông tin tiêu đề, nội dung tóm tắt và bài toàn văn
Bước 4: Chọn lọc, thu thập thông tin tổng quan khoa học
Bước 5: Xác định độ tin cậy của dữ liệu và thực hiện việc trích xuất dữ liệu phù hợp
Bước 6: Xác định tính bất đồng nhất về biến số khảo sát trong bộ dữ liệu Bước 7: Xác định mô hình phân tích để xác định các chỉ số phản ánh biến số cần khảo sát: chỉ số OR (Odds ratio), chỉ số Proportion, với độ tin cậy 95% (p<0,05) Kết quả phân tích thể hiện ở dạng đồ thị “Forest plot”
Bước 8: Xác định tính thiên vị của bộ dữ liệu đưa vào phân tích tổng hợp thông qua đồ thị “Funnel plot” Sau đó, có thể tiến hành các phân tích thống kê khác dựa trên các phân nhóm dữ liệu (Subgroup) và có thể tiến hành hồi quy phân tích tổng hợp
4.2 Phương pháp PCR kết hợp giải trình tự (PCR - Sequencing)
Phương pháp PCR kết hợp giải trình tự (PCR - Sequencing) nhằm xác định trình tự nucleotide trên gen mục tiêu nhằm phát hiện các đột biến điểm và chỉ ra bản chất của đột biến này - nguyên nhân dẫn đến một số bệnh di truyền, tiêu biểu là bệnh FH
(Jensen et al., 1996) Phương pháp này được ứng dụng ở một số nghiên cứu khoa học
liên quan đến bệnh FH như: Taranto và cộng sự (2017), Tada và cộng sự (2017), Wang và cộng sự (2018), Han và cộng sự (2010), Homer và cộng sự (2008),…
Trang 20PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Trang 21PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1 Vật liệu
1.1 Công cụ phần mềm
- Annhyb phiên bản 4.946 - Medcalc® phiên bản 18.2.1 - Chromas phiên bản 2.6.5
- CLC Main Workbenc phiên bản 8.0.1 - BioEdit phiên bản 7.0.4
- CodonCode Aligner phiên bản 8.0.2
1.2 Công cụ trực tuyến
- NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) - Oligo analyzer IDT phiên bản 3.1
(http://www.idtdna.com/analyzer/applications/oligoanalyzer/) - BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)
- Google Scholar (https://scholar.google.com.vn/) - GeneCards (http://www.genecards.org/)
1.3 Bộ mẫu bệnh phẩm
Thực hiện quy trình PCR - giải trình tự phát hiện đột biến gen PCSK9 trên 3 mẫu
bệnh phẩm có chỉ số cholesterol trong máu lấy từ bệnh viện ở thành phố Hồ Chí Minh
2 Phương pháp
2.1 Phương pháp khai thác dữ liệu và phân tích tổng hợp
Khai thác dữ liệu khoa học trên nguồn dữ liệu nguồn dữ liệu khoa học trên NCBI,
Google với một số từ khóa: MTHFR, PCSK9, hypercholesterolemia, Familial
combined hyperlipidemia
Thu thập và trích xuất một số dữ liệu trên các công bố khoa học: đặc điểm phân tử và tỷ lệ xuất hiện của các dạng biến thể (tính chất đa hình hoặc tính chất đột biến điểm)
trên gen mục tiêu: MTHFR (đột biến C677T), PCSK9 (exon 2) ở bệnh nhân mắc bệnh
cao cholesterol trong máu có tính gia đình hoặc một số bệnh lý về tim mạch, bệnh xơ vữa động mạch, bệnh mạch vành…
Trang 22Chuyên Đề Khóa Luận Tốt Nghiệp
Sau đó, chúng tôi đưa bộ dữ liệu vào phân tích tổng hợp nhằm tìm hiểu sự tương quan giữa đặc điểm phân tử và tỷ lệ xuất hiện của các dạng biến thể (tính chất đa hình hoặc
tính chất đột biến điểm) trên gen mục tiêu: MTHFR (đột biến C677T), PCSK9 (Exon
2) và bệnh cao cholesterol trong máu có tính gia đình hoặc một số bệnh lý về tim mạch, bệnh xơ vữa động mạch, bệnh mạch vành Quá trình phân tích tổng hợp dựa vào phân tích tỷ lệ đột biến (Proportion), chỉ số tỷ suất chênh (Odds ratio - OR),với khoảng tin cậy 95% (Confidence intervals - CIs) và giá trị p<0,05 trên mô hình ảnh hưởng ngẫu nhiên hoặc mô hình ảnh hưởng bất biến, bằng công cụ Medcalc (phiên bản 18.2.1)
2.2 Khảo sát trên máy tính (In silico)
Chúng tôi tiến hành khảo sát trên máy tính (In silico) nhằm xác định bộ mồi phù hợp
với phương pháp PCR kết hợp giải trình tự nhằm xác định đột biến exon 2 trên gen
PCSK9 , quy trình như sau:
(1) Dựa vào dữ liệu trên hệ thống NCBI thu thập bộ dữ liệu trình tự gen MTHFR với mã số truy cập NC_000001.11 của trình tự gen MTHFR
(2) Thu thập bộ mồi phù hợp với phương pháp PCR kết hợp giải trình tự nhằm
xác định đột biến exon 2 trên gen PCSK9 được mô tả trong một số công bố khoa học
trên thế giới
(3) Xác định các thông số vật lí của bộ mồi bằng công cụ OligoAnalyzer 3.1 (IDT) và Annhyb phiên bản 4.946, tập trung phân tích chiều dài mồi, nhiệt độ nóng chảy, % GC
(4) Kiểm tra độ đặc hiệu của bộ mồi bằng công cụ BLAST trên NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)
Dựa trên một số tiêu chí thiết kế mồi cho phương pháp PCR trong tài liệu Giáo trình Ứng dụng tin học trong Công nghệ sinh học (Lê Huyền Ái Thúy, 2016) và hướng dẫn của IDT (http://sg,idtdna,com/calc/Analyzer):
- Chiều dài mồi: thông thường chiều dài mồi nằm trong khoảng 17-28 nucleotide, tối thiểu 15 nucleotide
- Sản phẩm PCR có chiều dài khuếch đại nằm trong khoảng 100-600 bp - Tỷ lệ GC (%) nên nằm trong khoảng 40–60%
Trang 23- Nhiệt độ nóng chảy của hai mồi khác biệt không quá 5ºC, giới hạn thường gặp từ 50ºC đến 65ºC
2.4 Khảo sát thực nghiệm *Thiết bị và hoá chất
(1) Thiết bị: - Bể ổn nhiệt - Máy ly tâm lạnh - Tủ thao tác - Tủ lạnh - Máy vortex
- Máy đo quang phổ - Máy PCR
(2) Hóa chất: - Phenol - Chloroform
- Sodium dodecyl sulfate (SDS) 10% - NaCl 0,45M
- Tris HCl 10mM (pH = 8,2)
- Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 1M (pH = 8) - Ammonium acetate (NH4OAc) 5M
- Ethanol 100% - Ethanol 70%
- Proteinase K (18,5 mg/ml) - Master mix 2X
- Bộ mồi
Xác định sự tương quan giữa tính chất đột biến điểm nổi trội trên vùng exon 2 gen
PCSK9 và khả năng mắc bệnh/không mắc bệnh cao cholesterol máu có tính gia đình
trên người Việt Nam, gồm một số nội dung thực nghiệm:
(1) Tách chiết DNA bộ gen của bộ mẫu bệnh phẩm (mẫu máu) bằng phương pháp Phenol/Chloroform (Chomczynski & Sacchi, 1987)
Trang 24Chuyên Đề Khóa Luận Tốt Nghiệp
- Thu nhận 50μl mẫu bệnh phẩm vào một eppendorf (1,5 ml)
- Bổ sung 500µl dung dịch ly giải, gồm có NaCl 0,45M, Tris HCl 10mM (pH=8,2), EDTA 1M (pH=8), SDS 10%
- Bổ sung 5μl proteinase K (20 mg/ml), trộn đều Ủ ở nhiệt độ 56oC trong 1 giờ - Bổ sung một thể tích dung dịch Phenol: Chloroform (tỉ lệ 1:1), trộn đều Ly tâm ở nhiệt độ phòng, 13.000 vòng/phút trong 3 phút và thu dịch nổi
- Bổ sung một thể tích Chloroform tương đương với thể tích mẫu Ly tâm ở nhiệt độ phòng, 13.000 vòng/ phút trong 3 phút và thu dịch nổi
- Bổ sung 0,25 lần thể tích Amonium Acetate 5M và 2,5 lần thể tích Ethanol tuyệt đối (trữ lạnh) Ly tâm 13000 vòng/phút trong 20 phút ở 4oC và thu tủa
- Bổ sung một thể tích Ethanol 70%, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút ở 4oC
- Thu cặn, xử lý để làm khô mẫu DNA bộ gen và bảo quản trong 20 - 50 μl dung dịch Tris-EDTA (pH8), ở -20oC
(2) Xác định chất lượng DNA bộ gen bằng phương pháp đo quang phổ: Hàm lượng DNA có thể xác định được nhờ sự hấp thụ mạnh ánh sáng ở bước sóng 260nm - Độ tinh sạch của DNA được đánh giá qua tỷ lệ A260/A280 DNA thu nhận đã tinh sạch khi giá trị này dao động từ 1,8 – 2 (Bảng V.1)
(3) Phương pháp PCR
Chúng tôi tiến hành thực hiện phản ứng PCR khuếch đại vùng trình tự exon 2 gen
PCSK9 bằng cặp mồi PCSK9_MF3-PCSK9_MR3 được tham khảo bởi nghiên cứu
của Leren và cộng sự (2004)
Trang 25Bảng II.1 Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi PCSK9_MF3- PCSK9_MR3
Bảng II.2 Chu trình luân nhiệt với cặp mồi PCSK9_MF3- PCSK9_MR3
- Rót gel vào khuôn, chờ gel đông, rút lược
- Hòa trộn mẫu DNA (sản phẩm PCR) với dung dịch nạp mẫu và chất nhuộm Gel Red
- Nạp mẫu vào giếng
- Chạy điện di ở điện thế 70Volt, trong thời gian 30 phút
- Đọc kết quả bằng máy đọc gel (Gel Doc XR, BioRad), dựa vào thang chuẩn để xác định kích thước của sản phẩm PCR hiện diện trong bảng gel
(5) Giải trình tự
Các sản phẩm PCR có kích thước 477 bp được tiến hành gửi giải trình tự nhằm xác
định biến thể exon 2 trên gen PCSK9 thuộc DNA bộ gen của bệnh nhân Việt Nam
Trong quá trình phân tích kết quả giải trình tự, chúng tôi dùng một số trình tự tham chiếu và phần mềm CodonCode Aligner, Chromas Lite, và một số trình tự tham
chiếu: NC_000001.11 (55.039.476–55.064.853), NM_174936.3, NG_009061.1 để xác định đặc điểm phân tử trên trình tự mục tiêu của DNA bộ gen của một số mẫu bệnh phẩm (mẫu máu) của người Việt Nam.
Trang 26PHẦN III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
Trang 27PHẦN III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
1 Kết quả thu thập dữ liệu và phân tích tổng hợp
Hình III.1 Sơ đồ quy trình trích xuất dữ liệu trong phân tích tổng hợp tính chất đột biến trên gen PCSK9
Các nghiên cứu được xác định từ cơ sở dữ liệu NCBI, google Scholar, mạng khoa học, … n=80
Không bao gồm các bài trùng lặp n=15
Tổng số công trình nghiên
cứu được sàng lọc n=65
Không bao gồm các nghiên cứu không liên quan để tìm kiếm câu hỏi n=10
Tổng số công trình nghiên cứu tổng quan n=55
Không bao gồm các nghiên cứu không đáp ứng tiêu chí n=21
Tổng số công trình nghiên cứu hoàn chỉnh thích hợp n=34
Không bao gồm các nghiên cứu không đáp ứng tiêu chí n=17
Tổng số công trình nghiên cứu đưa vào Phân tích tổng hợp n=17
Trang 28Chuyên Đề Khóa Luận Tốt Nghiệp
Hình III.2 Sơ đồ quy trình trích xuất dữ liệu trong phân tích tổng hợp tính chất đột biến C677T trên gen MTHFR
Các nghiên cứu được xác định từ cơ sở dữ liệu NCBI, google Scholar, mạng khoa học, … n=76
Không bao gồm các bài trùng lặp n=13
Tổng số công trình nghiên
cứu được sàng lọc n=63
Không bao gồm các nghiên cứu không liên quan để tìm kiếm câu hỏi n=22
Tổng số công trình nghiên cứu tổng quan n=41
Không bao gồm các nghiên cứu không đáp ứng tiêu chí n=18
Tổng số công trình nghiên cứu hoàn chỉnh thích hợp n=23
Không bao gồm các nghiên cứu không đáp ứng tiêu chí n=9
Tổng số công trình nghiên cứu đưa vào Phân tích tổng hợp n=14
Trang 29Cập nhật đến tháng 4 năm 2019, dựa vào nguồn dữ liệu trên NCBI, Google và theo quá trình trích xuất dữ liệu, chúng tôi thu nhận được các bộ dữ liệu (Bảng V.2 - Bảng
V.3 - Phụ lục) như sau:
− Bộ dữ liệu gồm 17 công bố khoa học liên quan đến tính chất đột biến trên gen
PCSK9 Bộ dữ liệu này được đưa phân tích tổng hợp để khái quát đặc điểm
phân tử gen PCSK9 exon 2 liên quan đến bệnh FH, cụ thể là chỉ số
Proportion-phản ánh tỷ lệ xuất hiện đột biến trên các quần thể người bệnh cao cholesterol máu hoặc các dạng bệnh lý liên quan
− Bộ dữ liệu gồm 14 công bố khoa học liên quan đến các dạng biến thể xuất hiện
trên gen MTHFR C677T liên quan đến một số bệnh lý rối loạn chuyển hóa liên
quan đến sự thay đổi nồng độ cholesterol trong máu, sự hình thành huyết khối Quá trình phân tích tổng hợp được tiến hành với phương pháp xác định chỉ số Proportion phản ánh tỷ lệ xuất hiện đột biến trên các quần thể người bệnh cao cholesterol máu hoặc các dạng bệnh lý khác, chỉ số Odds Ratio (OR) phản ánh chỉ số tỷ suất chênh về sự xuất hiện thể hoang dại (CC), thể đột biến dị hợp (CT) và thể đột biến đồng hợp (TT) trên bộ mẫu bệnh phẩm của các bệnh nhân cao cholesterol máu hoặc các dạng bệnh lý rối loạn chuyển hóa khác và bộ mẫu lành
1.1 Tính chất đột biến trên gen PCSK9
Do tính chất đặc trưng của 17 công trình nghiên cứu dạng đoàn hệ, chúng tôi tập trung
phân tích chỉ số Proportion phản ánh tỷ lệ xuất hiện đột biến trên gen PCSK9 trong
tổng số 2308 mẫu bệnh phẩm: bệnh nhân cao cholesterol máu, tăng cholesterol tự phát, giảm LDL…với chỉ số I2 = 99,9% (P < 0,0001) và theo mô hình phân tích ảnh hưởng ngẫu nhiên (Random effects model - R), kết quả thể hiện ở Hình III.3 - Hình III.4, Bảng III.1 - Bảng III.2
Trang 30Chuyên Đề Khóa Luận Tốt Nghiệp
Hình III.3 Đồ thị “Funnel plot” đánh giá tính bất đồng nhất đột biến trên gen PCSK9 theo mô hình R, trên 17 công bố khoa học
Hình III.4 Đồ thị “Forest plot” phản ánh tỷ lệ xuất hiện đột biến trên gen PCSK9 theo mô hình R, trên 17 công bố khoa học
Kết quả xác định chỉ số Proportion phản ánh tỷ lệ xuất hiện đột biến trên gen PCSK9
của nhóm bệnh nhân trên thế giới xấp xỉ 15,489 (95% CI: 9,386-22,786; P < 0,0001;
mô hình R) Nhằm làm rõ về sự tương quan giữa tính chất đột biến trên gen PCSK9
và bệnh cao cholesterol máu, chúng tôi xác định chỉ số Proportion theo một số phân hạng: châu lục/chủng tộc, loại bệnh, phương pháp
Trang 31❖ Xét về phân hạng châu lục/chủng tộc
Chỉ số Proportion phản ánh tỷ lệ xuất hiện đột biến trên gen PCSK9 thuộc nhóm
bệnh nhân châu Mỹ là 41,279 (95% CI: 33,57-48,74; P = 0,0182; mô hình R) cao
hơn nhóm bệnh nhân châu Á, châu Âu, châu Phi và châu Đại Dương (Bảng III.1) ❖ Xét về phân hạng loại bệnh
Chỉ số Proportion phản ánh tỷ lệ xuất hiện đột biến trên gen PCSK9 trên nhóm bệnh
nhân bệnh FH là 17,561 (95% CI: 9,425-27,567; P < 0,0001; mô hình R) cao hơn bệnh tăng cholesterol tự phát và bệnh giảm lượng LDL lần lượt là 6,575 (95% CI: 3,606-10,859; P = 0,1880; mô hình F) và 12,222 (95% CI: 8,38-16,48; P < 0,0001; mô hình NA) Kết quả cho thấy trên bệnh nhân FH tỷ lệ xuất hiện đột biến trên gen
PCSK9 cao (Bảng III.1)
❖ Xét về phân hạng phương pháp
Chỉ số Proportion phản ánh tỷ lệ xuất hiện đột biến gen PCSK9 trên nhóm bệnh nhân
có biểu hiện nồng độ cholesterol trong máu cao bất thường được phân tích bằng phương pháp PCR - giải trình tự cao hơn các phương pháp sinh học phân tử khác lần lượt là 17,979 (95% CI: 9,492-28,449; P < 0,0001; mô hình R) và 11,406 (95% CI: 4,373-21,188; P < 0,0001; mô hình R) Kết quả cho thấy phương pháp PCR - giải trình tự là một trong các phương pháp thường được sử dụng để phân tích tính chất
đột biến trên gen PCSK9 (Bảng III.1)
Kết quả xác định chỉ số Proportion phản ánh tỷ lệ xuất hiện đột biến các exon trên
gen PCSK9 trên nhóm bệnh nhân cao nhất ở exon 7 là 42,647 (95% CI:
10,506-78,866; P < 0,0001; mô hình R) Exon chúng tôi đề cập đến trong nghiên cứu có chỉ
số Proportion phản ánh tỷ lệ xuất hiện đột biến exon 2 trên gen PCSK9 là 22,588
(95% CI: 7,410-42,968; P < 0,0001; mô hình R) (Bảng III.2)
Trang 32Chuyên Đề Khóa Luận Tốt Nghiệp
Bảng III.1 Kết quả phân tích sự tương quan giữa tỷ lệ xuất hiện đột biến trên
gen PCSK9 và bệnh FH từ các công bố nghiên cứu khoa học
Chỉ số N Chỉ số Proportion
(95% CI)
Khoảng tin cậy (95% CI)
Mô hình
Phương pháp khác
6 11,406 4,373-21,188 R <0,0001 92,83
Yếu tố phả hệ
Proband 17 15,489 9,386-22,786 R <0,0001 93,83
Family 4 36,424 12,792-64,266 R 0,0061 75,83
Bảng III.2 Kết quả phân tích sự tương quan giữa tỷ lệ xuất hiện đột biến các
exon trên gen PCSK9 từ các công bố nghiên cứu khoa học
Exon N Chỉ số Proportion
(95% CI)
Khoảng tin cậy (95% CI)
Mô hình
1.2 Tính chất đột biến trên gen MTHFR
Do tính chất đặc trưng của 14 công trình nghiên cứu đưa vào phân tích tổng hợp ở dạng ca chứng kết hợp nghiên cứu cắt ngang, chúng tôi tập trung phân tích chỉ số
Proportion phản ánh tỷ lệ/xuất hiện đột biến C677T trên gen MTHFR và chỉ số Odds
Trang 33radio (OR) phản ánh chỉ số tỷ suất chênh xuất hiện đột biến điểm C677T trên gen
MTHFR trong tổng số 4484 mẫu bệnh phẩm: bệnh nhân cao cholesterol máu, đột quỵ,
huyết khối, tiểu đường loại 2…với chỉ số I2 = 99,9% (P < 0,0001) và theo mô hình phân tích ảnh hưởng ngẫu nhiên (Random effects model - R), kết quả thể hiện ở Hình III.5 - III.6, Bảng III.3 - Bảng III.4
Hình III.5 Đồ thị “Funnel plot” đánh giá tính bất đồng nhất đột biến C677T trên gen MTHFR theo mô hình R, trên 14 công bố khoa học
Hình III.6 Đồ thị “Forest plot” phản ánh tỷ lệ xuất hiện đột biến C677T trên gen MTHFR theo mô hình R, trên 14 công bố khoa học
Kết quả xác định chỉ số Proportion phản ánh tỷ lệ xuất hiện đột biến C677T trên gen
MTHFR của bệnh nhân có biểu hiện lượng cholesterol trong máu cao, đột quỵ, tiểu