Nghiên cứu thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên người ở hai xã trọng điểm thuộc Ninh Bình, Phú Yên và chế tạo kit LAMP ứng dụng trong chẩn đoán tại cộng đồng

Nghiên cứu thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên người ở hai xã trọng điểm thuộc Ninh Bình, Phú Yên và chế tạo kit LAMP ứng dụng trong chẩn đoán tại cộng đồng.Nghiên cứu thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên người ở hai xã trọng điểm thuộc Ninh Bình, Phú Yên và chế tạo kit LAMP ứng dụng trong chẩn đoán tại cộng đồng.Nghiên cứu thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên người ở hai xã trọng điểm thuộc Ninh Bình, Phú Yên và chế tạo kit LAMP ứng dụng trong chẩn đoán tại cộng đồng.Nghiên cứu thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên người ở hai xã trọng điểm thuộc Ninh Bình, Phú Yên và chế tạo kit LAMP ứng dụng trong chẩn đoán tại cộng đồng.Nghiên cứu thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên người ở hai xã trọng điểm thuộc Ninh Bình, Phú Yên và chế tạo kit LAMP ứng dụng trong chẩn đoán tại cộng đồng.Nghiên cứu thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên người ở hai xã trọng điểm thuộc Ninh Bình, Phú Yên và chế tạo kit LAMP ứng dụng trong chẩn đoán tại cộng đồng.Nghiên cứu thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên người ở hai xã trọng điểm thuộc Ninh Bình, Phú Yên và chế tạo kit LAMP ứng dụng trong chẩn đoán tại cộng đồng.Nghiên cứu thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên người ở hai xã trọng điểm thuộc Ninh Bình, Phú Yên và chế tạo kit LAMP ứng dụng trong chẩn đoán tại cộng đồng.Nghiên cứu thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên người ở hai xã trọng điểm thuộc Ninh Bình, Phú Yên và chế tạo kit LAMP ứng dụng trong chẩn đoán tại cộng đồng.Nghiên cứu thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên người ở hai xã trọng điểm thuộc Ninh Bình, Phú Yên và chế tạo kit LAMP ứng dụng trong chẩn đoán tại cộng đồng.Nghiên cứu thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên người ở hai xã trọng điểm thuộc Ninh Bình, Phú Yên và chế tạo kit LAMP ứng dụng trong chẩn đoán tại cộng đồng.Nghiên cứu thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên người ở hai xã trọng điểm thuộc Ninh Bình, Phú Yên và chế tạo kit LAMP ứng dụng trong chẩn đoán tại cộng đồng.Nghiên cứu thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên người ở hai xã trọng điểm thuộc Ninh Bình, Phú Yên và chế tạo kit LAMP ứng dụng trong chẩn đoán tại cộng đồng.Nghiên cứu thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên người ở hai xã trọng điểm thuộc Ninh Bình, Phú Yên và chế tạo kit LAMP ứng dụng trong chẩn đoán tại cộng đồng.Nghiên cứu thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên người ở hai xã trọng điểm thuộc Ninh Bình, Phú Yên và chế tạo kit LAMP ứng dụng trong chẩn đoán tại cộng đồng.Nghiên cứu thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên người ở hai xã trọng điểm thuộc Ninh Bình, Phú Yên và chế tạo kit LAMP ứng dụng trong chẩn đoán tại cộng đồng.Nghiên cứu thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên người ở hai xã trọng điểm thuộc Ninh Bình, Phú Yên và chế tạo kit LAMP ứng dụng trong chẩn đoán tại cộng đồng.Nghiên cứu thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên người ở hai xã trọng điểm thuộc Ninh Bình, Phú Yên và chế tạo kit LAMP ứng dụng trong chẩn đoán tại cộng đồng.Nghiên cứu thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên người ở hai xã trọng điểm thuộc Ninh Bình, Phú Yên và chế tạo kit LAMP ứng dụng trong chẩn đoán tại cộng đồng.Nghiên cứu thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên người ở hai xã trọng điểm thuộc Ninh Bình, Phú Yên và chế tạo kit LAMP ứng dụng trong chẩn đoán tại cộng đồng.Nghiên cứu thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên người ở hai xã trọng điểm thuộc Ninh Bình, Phú Yên và chế tạo kit LAMP ứng dụng trong chẩn đoán tại cộng đồng.Nghiên cứu thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên người ở hai xã trọng điểm thuộc Ninh Bình, Phú Yên và chế tạo kit LAMP ứng dụng trong chẩn đoán tại cộng đồng.Nghiên cứu thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên người ở hai xã trọng điểm thuộc Ninh Bình, Phú Yên và chế tạo kit LAMP ứng dụng trong chẩn đoán tại cộng đồng.Nghiên cứu thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên người ở hai xã trọng điểm thuộc Ninh Bình, Phú Yên và chế tạo kit LAMP ứng dụng trong chẩn đoán tại cộng đồng.Nghiên cứu thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên người ở hai xã trọng điểm thuộc Ninh Bình, Phú Yên và chế tạo kit LAMP ứng dụng trong chẩn đoán tại cộng đồng.Nghiên cứu thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên người ở hai xã trọng điểm thuộc Ninh Bình, Phú Yên và chế tạo kit LAMP ứng dụng trong chẩn đoán tại cộng đồng.Nghiên cứu thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên người ở hai xã trọng điểm thuộc Ninh Bình, Phú Yên và chế tạo kit LAMP ứng dụng trong chẩn đoán tại cộng đồng.Nghiên cứu thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên người ở hai xã trọng điểm thuộc Ninh Bình, Phú Yên và chế tạo kit LAMP ứng dụng trong chẩn đoán tại cộng đồng.Nghiên cứu thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên người ở hai xã trọng điểm thuộc Ninh Bình, Phú Yên và chế tạo kit LAMP ứng dụng trong chẩn đoán tại cộng đồng.Nghiên cứu thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên người ở hai xã trọng điểm thuộc Ninh Bình, Phú Yên và chế tạo kit LAMP ứng dụng trong chẩn đoán tại cộng đồng.

BỘ GIÁO DỤC VÀĐÀOTẠOBỘ YTẾ

VIỆN SỐT RÉT - KÝ SINH TRÙNG - CÔN TRÙNG TRUNG ƯƠNG -* -

PHẠM THỊ HÀ TRANG

NGHIÊN CỨU THỰC TRẠNG NHIỄM SÁN LÁ GAN NHỎTRÊN NGƯỜI Ở HAI XÃ TRỌNG ĐIỂM THUỘC NINHBÌNH,PHÚ YÊN VÀ CHẾ TẠO KIT LAMP ỨNG DỤNG TRONG CHẨN ĐOÁN

TẠI CỘNGĐỒNG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

HÀ NỘI – 2024

BỘ GIÁO DỤC VÀĐÀOTẠO BỘ YTẾ

VIỆN SỐT RÉT - KÝ SINH TRÙNG - CÔN TRÙNG TRUNG ƯƠNG -* -

PHẠM THỊ HÀ TRANG

NGHIÊN CỨU THỰC TRẠNG NHIỄM SÁN LÁ GAN NHỎTRÊN NGƯỜI Ở HAI XÃ TRỌNG ĐIỂM THUỘC NINHBÌNH,PHÚ YÊN VÀ CHẾ TẠO KIT LAMP ỨNG DỤNG TRONG CHẨN ĐOÁN

TẠI CỘNGĐỒNG

CHUYÊN NGÀNH: DỊCH TỄ HỌCMÃ SỐ: 9720117

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌCHướng dẫn khoa học:

1 PGS TS TrầnThanhDương2 TS.Trương VănHạnh

HÀ NỘI – 2024

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu do chính tôi thực hiện dưới sựhướng dẫn trực tiếp của PGS.TS Trần Thanh Dương, TS Trương Văn Hạnh và cácthầy cô là giảng viên cán bộ của Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung ương.Trong quá trình thực hiện luận án, tôi được Chủ nhiệm đề tài và các thành viên tham

gia đề tài cho phép sử dụng mẫu và một phần số liệu của đề tài cấp nhànước:“Nghiêncứu chế tạo các bộ kít LAMPđể chẩn đoán ký sinh trùng sốt rét, sán lá gan lớn, sán lágan nhỏ, giun lươn đường ruột tại thựcđịa.”.Các số liệu và kết quả trong luận án là

hoàn toàn trung thực, chưa được công bố ở bất kỳ công trình nào khác Các bước tiếnhành của đề tài đúng như đề cương nghiên cứu, chấp hành các quy định đạo đức trongtiến hành nghiêncứu.

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những cam kết này.

Hà Nội, ngày tháng năm 2024

Tác giả

Phạm Thị Hà Trang

LỜI CẢM ƠN

Với lòng chân thành, tôi xin bàytỏlòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Trần ThanhDương, TS.Trương VănHạnh đã hướng dẫn và giúp đỡ tận tình trong suốt quá trìnhhọc tập, nghiên cứu và hoàn thành luậnán.

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Hoàng Đình Cảnh, Việntrưởngcùng BanLãnh đạo Viện Sốt rét- Kýsinh trùng-Côn trùng Trung ương,các Khoa Sinh học phântử, Ký sinh trùng đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập Xin trântrọng cảm ơn PGS TS Cao Bá Lợi cùng các cán bộ của Phòng Khoa học và Đào tạo,đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡtôinhiệt tình trong thời gian nghiên cứu, học tậpvà hoàn thành luậnán.

TôixingửilờicảmơnchânthànhđếnBanLãnhđạo,cánbộytếcủaTrungtâm Kiểm soátbệnh tật tỉnh Ninh Bình vàTrungtâm Kiểm soát bệnh tật tỉnh Phú Yên, cán bộ y tế tạiTrung tâm y tế huyện Kim Sơn, huyện Tuy An và Trạm Y tế của hai điểm nghiên cứuđã hợp tác, tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu tại thựcđịa.

Xin chân thành cảm ơn Ban Giám đốc Sở Y tế Hà Nội, phòng Quản lý hành nghềy dược tư nhân và toàn thể bạn bè, đồng nghiệp đã động viên, khuyến khích và hỗ trợtôi trong quá trình học tập, nghiên cứu.

Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bố, mẹ, chồng, con đãluôn khuyến khích, chia sẻ, động viên, giúp đỡ tôi trong những lúc khó khăn để hoànthành luận án này.

Hà Nội,ngàythángnăm2024

Tác giả

Phạm Thị Hà Trang

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TĂT

Từ viết tắt Tiếng AnhTiếng Việt

phânHNB Hydroxy naphthol blue

IARC International Agency forResearch on Cancer

Cơ quan nghiên cứu ung thư quốctế

ITS Internal Transcribed SpacerKAP Knowledge, Attitudes,

Kiến thức, Thái độ, Thực hànhLAMP Loop-Mediated Isothermal

Khuếch đại đẳng nhiệt mạch vòng

PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi PolymeraseTCCN,

1.2.3 Điều trị bệnh sán lá gan nhỏtrênngười 20

1.3 Các phương pháp xét nghiệm xác định tình trạng nhiễm sán lá gan nhỏtrên người 20

1.4 Kỹ thuật LAMP và nghiên cứu chế tạo bộ kít LAMP xét nghiệm pháthiện nhiễm sán lá gan nhỏtrênngười 22

1.4.1 Nguyên lý của kỹthuậtLAMP 22

2.1.1 Đối tượng, thời gian và địa điểmnghiêncứu 36

2.1.2 Phương phápnghiên cứu 37

2.2 Mục tiêu 2: Chế tạo kit LAMP xét nghiệm nhiễmClonorchis sinensis,Opisthorchis viverrinitrên người ở quymôphòngthí nghiệm 43

2.2.1 Đối tượng, thời gian và địa điểmnghiêncứu 43

2.2.2 Phương phápnghiên cứu 45

2.3 Đạo đức trongnghiêncứu 58

3.1 Thực trạngvàmộtsốyếutốliên quannhiễm sánlágan nhỏtrên ngườitạihaixãtrọngđiểmthuộctỉnhNinh BìnhvàPhú Yên(2018-2020) 59

3.1.1 Đặc điểm của đối tượngnghiêncứu 59

3.1.2 Tỷ lệ nhiễm và cường độ nhiễm sán lá gan nhỏ trên người tại địađiểmnghiêncứu 60

3.1.3 Mộtsốyếutốliênquanđếntìnhtrạngnhiễmsánlágannhỏởngười 70

3.2 Chế tạo kit LAMP xét nghiệm nhiễmClonorchis sinensis, Opisthorchisviverrinitrên người ở quymôphòngthínghiệm 78

3.2.1 Thiết kế, đánh giá lựa chọn các bộmồiLAMP 78

3.2.2 Đánh giá tính đặc hiệu và khả năng hoạt động của bộ mồiLAMPthiếtkế 79

3.2.3 Khảo sát, tối ưu hóa các điều kiện phảnứng LAMP 81

3.2.4 Đóng gói thành phẩm bộ kit LAMP chẩn đoán sán lágan nhỏ 87

3.3 Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của kít LAMP chẩn đoán sán

lágan nhỏ, so sánhbộmồi 88

3.3.1 Độ nhạy, độ đặc hiệu của kít LAMP chẩn đoánO viverrinitạiphòngthínghiệm 88

3.3.2 Độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ kit LAMP chẩn đoánC.sinensis 88

3.3.3 Kết quả so sánh bộ kít LAMP chẩn đoán sán lá gan nhỏ với bộ mồicó cùngmụcđích 89

3.3.4 Đánh giá độ ổn định của bộ kit LAMP chẩn đoán sán lá gan nhỏ 903.4 Kết quả đánh giá bộ kít LAMP chẩn đoán sán lá gan nhỏ tại thực địatỉnhPhúYên vàNinhBình 95

3.4.1 Đánh giá bộ kit LAMP chẩn đoán sán lá gan nhỏO viverrinitạithực địa tỉnhPhú Yên 95

3.4.2 Kết quả đánh giá bộ kit LAMP chẩn đoán sán lá gan nhỏC.sinensistại thực địa tỉnhNinhBình 96

3.5 Xây dựng tiêu chuẩn và kiểm định các bộkít LAMP 98

3.5.1 Xây dựng tiêu chuẩncơ sở 98

3.5.2 Kết quả kiểm định các bộ kít LAMP chẩn đoán sán lágannhỏ 99

4.1 MôtảthựctrạngvàmộtsốyếutốliênquannhiễmsánlágannhỏtrênngườitạihaixãtrọngđiểmthuộcNinhBìnhvàPhúYên(2018-2020) 100

4.1.1 Đặc điểm của đối tượngnghiêncứu 100

4.1.2 Kếtquảnghiêncứutỷlệ,cườngđộnhiễmsánlágannhỏtrênngười 102

4.2 Mộtsốyếutốliênquanđếntìnhtrạngnhiễmsánlágannhỏởngười 107

4.2.1 Liên quan giữa tuổi và tỷ lệ nhiễm sán lágannhỏ 107

4.2.2 Liên quan giữa tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ vàgiớitính 109

4.2.3 Liên quan giữa tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ vànghềnghiệp 111

4.2.4 Liên quan giữa tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ và trình độhọcvấn 112

4.2.5 Liênquangiữatỷlệnhiễmsánlágannhỏvàviệcsửdụngnhàtiêu 114

4.2.6 Liên quan giữa tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ và việc sử dụng phântươi

để chăn nuôi,trồngtrọt 115

4.2.7 Liên quan giữa tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ và có nuôichó mèo 116

4.2.8 Liênquangiữatỷlệnhiễmsánlágannhỏvàtìnhtrạngăngỏicá 118

4.2.9 Một số yếu tố khác liên quan đến tỷ lệ nhiễm sán lágannhỏ 119

4.3 Chế tạo kit LAMP xét nghiệm nhiễmClonorchis sinensis, Opisthorchisviverrinitrên người ở quymôphòngthínghiệm 122

TÀI LIỆU THAM KHẢOPHỤ LỤC

Bảng3.27.Độnhạy,độ đặchiệu củakítLAMPchẩnđoánO.viverrini 88

Bảng3.28.Độnhạy,độ đặchiệu củakítLAMPchẩnđoánC.sinensis 88

Bảng3.29.Sosánh độtươngđồng kếtquảxétnghiệmgiữabộkitLAMPchếtạovớikỹthuậtLAMPsửdụngbộmồitheoLêThanhHòavàcs 89

Bảng3.30.Sosánhđộtương đồng kếtquả xétnghiệmgiữa bộkitLAMPchếtạovớikỹthuậtLAMPsửdụngbộmồicủaRahmanvàcs 90

Bảng 3.31 Kết quả khảo sát độ ổn định của bộ kit LAMP chẩn đoán sán lágannhỏO viverrinisau 6 thángbảoquản 91

Bảng3.32.KếtquảkhảosátđộổnđịnhcủabộkítLAMPchẩnđoánsánlágannhỏO.viverrinisau 4 lần làm tan vàđôngđá 91

Bảng 3.33 Kết quả khảo sát độ ổn định của bộKitLAMPchẩnđoánsán lágan nhỏO.viverrinisau 12 thángbảoquản 92

Bảng 3.34 Kết quả khảo sát độ ổn định của bộ kit LAMP chẩn đoán sán lágannhỏC sinensissau 6 thángbảoquản 93

Bảng3.35.KếtquảkhảosátđộổnđịnhcủabộkitLAMPchẩnđoánsánlágannhỏC.sinensissau 4 lần làm tan vàđôngđá 94

Bảng3.36.KếtquảkhảosátđộổnđịnhcủabộkitLAMPchẩnđoánsánlágannhỏC.sinensissau 12 thángbảoquản 94

Bảng3.37.Tỷ lệ nhiễm sán lá gannhỏO.viverriniphát hiện bằng Kato-Katzvà bộkítLAMP 95

Bảng3.38.Sosánhhệ sốtươngđồngkếtquả xétnghiệmpháthiệnsán lágannhỏO.viverrinibằngbộkítLAMPvàrealtimePCR 96

Bảng3.39.Tỷ lệ nhiễm sán lá gannhỏC.sinensisphát hiện bằng

Kato-KatzvàbộkítLAMP 97Bảng3.40.Sosánhhệ sốtươngđồngkếtquả xétnghiệmpháthiệnsán

Hình 3.4.Ảnhđiện di sản phẩm khảo sátnhiệtđộ ủmồicủaphảnứngLAMPchẩnđoánO.viverrini 82

Hình3.5.ẢnhđiệndisảnphẩmLAMPkhảosátvớicácnồngđộMgSO4 82

Hình 3.7.ẢnhsảnphẩmLAMPvới các nồng độHNBkhảo sát khiquansátbằngmắtthường 84

Hình 3.8.Ảnhđiện di sản phẩmLAMPtrên gelagarose2% xác địnhngưỡngpháthiệnsơ cấp củakítLAMP 85

Hình 3.9.ẢnhsảnphẩmLAMPquan sátbằngmắtthườngxác địnhngưỡngpháthiệnsơ cấp củakítLAMP 86

Hình 3.10 Biểu đồ ngưỡng phát hiện của kít LAMP chẩn đoán sán lá gan nhỏO.viverrini 86

Hình 3.11 Biểu đồ ngưỡng phát hiện thứ cấp của kít LAMP chẩn đoánsán lágannhỏC.sinensis 87

Hình3.15.HìnhảnhsảnphẩmLAMPchẩnđoánO.viverrinisau 1thángdựavàochỉthịmàu 92

Hình3.16.HìnhảnhsảnphẩmLAMPchẩnđoánO.viverrinisau 6thángdựavàochỉthịmàu 92

Hình3.19.HìnhảnhsảnphẩmLAMPchẩnđoánC.sinensissau 1thángdựavàochỉthịmàu 94

Hình3.20.HìnhảnhsảnphẩmLAMPchẩnđoánC.sinenissau6thángdựavàochỉthịmàu 94

C sinensisvàO viverriniphân bố ở ít nhất 32 tỉnh thành [2].

Hai địa phương Ninh Bình và Phú Yên được coi là điểm nóng với tỷ lệ nhiễm sánlá gan nhỏ khá cao với nhiều yếu tố liên quan như thời tiết thuận lợi, địa hình nhiềusông ngòi, ao hồ,…, trong đó, nguyên nhân chính do tập quán ăn gỏi cá của nhân dânđã tồn tại lâu đời [3].

Bệnh nhân nhiễm sán lá gan nhỏ thường không có các triệu chứng trong một thờigian dài hoặc có triệu chứng nhưng không rõ ràng, điều này gây khó khăn cho việcchẩn đoán, điều trị và phòng bệnh Điều đáng chú ý là người nhiễm sán lá gan nhỏ lâungày có thể bị xơ gan ở nhiều mức độ khác nhau, đặc biệt có nguy cơ ung thưbiểumôđường mật [4] Vì vậy việc chẩn đoán sán lá gan nhỏ là rất cầnthiết.

Hiện nay, có rất nhiều phương pháp xét nghiệm nhiễm sán lá gan nhỏ Trong đó,xét nghiệm phân bằng kỹ thuật Kato-Katz được sử dụng rộng rãi, dễ thực hiện, nhanhchóng và rẻ tiền, có thể ước tính cường độ nhiễm trùng Tuy nhiên, độ nhạy của kỹthuật Kato-Katz thấp, đặc biệt là đối với các trường hợp nhiễm cường độ nhẹ [5],[6].

Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, việc ứng dụng sinh học phân tửtrong chẩn đoán các tác nhân sinh học gây bệnh ngày càng được phát triển, đặc biệt làcác kỹ thuật PCR, real time PCR để chẩn đoán sán lá gannhỏ

O.viverrinihayC.sinensischođộnhạyvàđộđặchiệucaonhưnggặpnhiều

khó khăn khi áp dụng tại thực địa, phù hợp với những trung tâm y học lớn [7] Gầnđây, nhiều nghiên cứu có xu hướng chuyển sang các phương pháp khuếch đại ADNđẳng nhiệt (trong đó được áp dụng nhiều nhất là kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt mạchvòng trung gian - Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP) với những ưuđiểm là độ nhạy và đặc hiệu tương đương kỹ thuật PCR nhưng chỉ cần các thiết bị xétnghiệm đơn giản, thời gian xét nghiệm rút ngắn xuống còn 30 - 60 phút, có khả năngphát triển thành các bộ sinh phẩm xét nghiệm (sau đây gọi là kit) phân tử cho phépứng dụng được tại thực địa [8], [9] Đến nay, tại Việt Nam chưa có kit LAMP đượcthương mại hóa để chẩn đoán nhiễm sán lá gan nhỏ trên người Cần có các nghiêncứu, phát triển ứng dụng kỹ thuật LAMP trong chẩn đoán nhiễm sán lá gan nhỏ trênngười, giúp khắc phục được một số tồn tại của các phương pháp chẩn đoán khác nhằmgiải quyết các vấn đề trong nghiên cứu, đặc biệt có thể áp dụng rộng rãi tại thựcđịa.

Xuất phát từ những yêu cầu khoa học và thực tiễn trên đây, chúng tôi

tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏtrên người ở hai xã trọng điểm thuộc Ninh Bình, Phú Yên và chế tạo kitLAMP ứng dụng trong chẩn đoán tại cộng đồng”với các mục tiêusau:

1 Mô tả thực trạng và một số yếu tố liên quan nhiễm sán lá gan nhỏtrênngười tại hai xã trọng điểm thuộc tỉnh Ninh Bình và Phú Yên(2018-2020).

2 Chế tạo kit LAMP xét nghiệm nhiễm Clonorchis sinensis,Opisthorchisviverrini trên người ở quy mô phòng thínghiệm.

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU1.1 Một số đặc điểm dịch tễ học nhiễm sán lá gannhỏ

1.1.1 Tác nhân gâybệnh

Trên thế giới, có ba loài sán lá gan thuộc họ Opisthorchiidae gây bệnh

viverrinivàOpisthorchisfelineusvới đặc điểm sinh học, vòng đời và lâm sàng

tương đối giống nhau [10] Ở Việt Nam hiện chỉ ghi nhận sự có mặt của 2 loài

sán lá gan nhỏ làClonorchis sinensisvàOpisthorchis viverrini.1.1.1.1 Đặc điểm hình thái của sán lá gan nhỏ trưởngthành

A:O felineus(7 - 12 x 2 - 3 mm)B:O.viverrini(5,5-10x0,77-1,65mm)C:C sinensis(10 - 25 x 3 - 5 mm)

Hình 1.1 Hình thể sán lá gan nhỏ trưởng thành [11]

Hình 1.2 Hình ảnh sán lá gan

nhỏ trưởng thànhC.sinensisnhuộm màu vớicarmine(Nguồn: cdc.gov.vn)

Sán lágannhỏlàloàisán lálưỡngtính, sántrưởng thànhcóhình phẳng,thon dài, hình

loàicóhìnhtháinhỏnhất.C.sinensistrưởng thành kích thướclớnnhất [12] Trênthânsáncócả bộphận sinhdục đựcvà cái.Haitinh hoàn nằm ở phía sau, chianhiều múi (O.viverrinivàO.felineus)hoặc chia nhiều nhánhnhỏ (C.

sinensis).Tử cung nhỏ xếp khúc nằm ở giữa thân,hoàngthểhaibên.

Ổtrứngh ì n h bầudục, nhỏ,dướiổtrứnglà túi tinh,sautinhhoànlàốngbàitiết[13].

1.1.1.2 Đặc điểm hình thái trứng sán lá gannhỏ

Trứng sán lá gan nhỏC sinensis,O felineusvàO viverrinirất giống nhau và giống

với trứng của các loài sán lá ruột nhỏ thuộc họ Heterophyidae [3] Vì vậy, trong nhiềutrường hợp, phân loại dựa vào hình thái gặp nhiều khó khăn và có thể bị nhầm lẫn.Trứng hình bầu dục, dài khoảng 19 - 35μm và rộng khoảng 10 - 20μm Trứng có mộtm và rộng khoảng 10 - 20μm và rộng khoảng 10 - 20μm Trứng có mộtm Trứng có mộtlớp vỏ mỏng bắt màu vàng nhạt Một đầu trứng có nắp, hai gờ của nắp nổi rõ Đuôitrứng có núm con nhỏ gọi là mấu Các mấu của mỗi loài là khác nhau Bề mặt của vỏtrứng thô và không đều[14].

C.sinensis[15]O.viverrini[16]O felineus [17]

Hình1.3.Hình thể trứng của cácloàisán lá gann h ỏ

1.1.1.3 Đặc điểm hình thái ấu trùng sán lá gannhỏ

Trong khuôn khổ luận án này chỉ đề cập tới giai đoạn ấu trùng nang là giai đoạnấu trùng truyền qua cá cho người và các động vật có vú khác được gọi là metacercaria,nó được bao bọc trong các mô khác nhau của vật chủ (tôm, cá) Metacercaria của cácloài sán lá gan nhỏ hình tròn hoặc bầu dục, kích thước khác nhau tùy loài.

Metacercaria củaC sinensiskích thước 0,13- 0,14 x 0,09-0,10 mm [18].MetacercariaO viverrinikích thước 0,19-0,25 x 0,15-0,22m [14] MetacercariaO.felineuskích thước 0,25-0,30 x 0,19- 0,23mm [11].

Hình1.4.Ấu trùng(Metacercariae) củasán lá gan nhỏ[ 1 7 ]

1.1.2 Vật chủ

- Vật chủ chính:

Vậtchủchínhcủa sánlágan nhỏ gồmngườivàmộtsốđộng vật cóvúnhưchó,mèo,lợn,

chuột (Rattusnorvegicus),mộtsốđộng vậtăn cáhoang dã,có thể cảchim,tuynhiên người

lệnhiễmC.sinensiscaoởđộngvậtcóvúbaogồmchó,mèo (0,8–4,85%)do đókiểmsoátlâynhiễm củavậtchủ trongổchứabằng cáchchovậtnuôi ăn thức ănnấuchínhoặc chếbiếnđặcbiệtvàcải thiệnviệc quảnlýphâncủa vật nuôicũngđóng vai trò trongphòngchốngnhiễm sánởngười[12],[19].

- Vậtchủtrung gian thứnhất:

Vật chủ trung gian thứ nhất của sán lá gan nhỏ gồm nhiều loài ốc khác nhau tùyđịa điểm nghiên cứu Ở các vùng lưu hành, Ốc nhiễm sán lá gan nhỏ thường được tìmthấy ở các nguồn nước gần làng, trong các hồ nước nông, ruộng lúa và đất ngập nước[20], [21], nơi có mức độ ô nhiễm phân cao [22].

Việt Nam là quốc gia duy nhất lưu hành cảO viverrinivàC sinensis, do đó sựphân bố của ốcP manchouricusở miền bắc vàBithynia spp ở miền Trung - Nam là

yếu tố quyết định sự khác biệt về địa lý giữa hai loài sán lá gan nhỏ ở nước ta Cần cónghiên cứu chi tiết hơn về vật chủ trung gian của ốc sên cũng như các vật chủ khác ởcác vùng nối giữa các vùng lưu hành bệnh sán lá gannhỏ.

Hình 1.5 Loài ốc mang ấu trùng sán lá gan nhỏ tại Việt Nam

(Nguyễn Văn Đề, Đại học Y Hà Nội, 2012)

- Vậtchủtrung gianthứhai:

Vật chủ trung gian thứ hai của sán lá gan nhỏC sinensisgồm nhiều loài cá nước

ngọt, chủ yếu là cá họ Cyprinidae (chép) [12] Một nghiên cứu (2020) tại chợ cá tỉnh

Yên Bái cho thấy tỷ lệ nhiễmC sinensistrên cá khá cao là 69,7%, cường độ nhiễm là81,2% metacercariae/cá [23] Ấu trùng sánO.viverriniđược xác định ký sinh trên nhiềuloài cá khác nhau, phổ biến nhất là cá diếc (Carassius auratus)với tỷ lệ nhiễm ấu trùng

nang là 28,1%, ngoài ra có các loài khác như cá lóc, cá chép,… [24].

Hình1.6.Cá lóc đồng (C.striata)[ 2 5 ]Hình 1.7 Cá chép (C carpio) [26]

Vòng đời của sán lá gannhỏliên quantới hai vậtchủ trung gian nênđặc điểm dịchtễhọccũng liên quantớihaivật chủtrung giannày trong đó vật chủtrung gianthứ nhất (ốc)có vai tròquyếtđịnhđến phânbố của sán do chỉmộts ố í t ố c c ó t h ể n h i ễ ms á n Vaitrò củavậtchủtrung gianthứhai ítquantrọnghơn do rấtnhiều loàicá cóthểmangấutrùngsán, tuy nhiên khảnănglây nhiễm vào vậtchủ chínhphụthuộcvào cá.

1.1.3 Đường lây và cơ chế lây truyềnbệnh

1.1.3.1 Đường lây

Ăn gỏi cá hoặc cá chưa nấu chín nhiễm nang ấu trùng sán là nguy cơ số 1 gâynhiễm sán lá gan nhỏ cho người [27], tỷ lệ nhiễm cao ở những cộng đồng có thói quenăn gỏi cá Tập quán làm nhà vệ sinh trên ao hồ, nuôi cá bằng phân người là những yếutố góp phần quan trọng lan truyền bệnh Tập quán này gặp ở nhiều nước trên thế giới[12],[19].

1.1.3.2 Cơ chế lây truyềnbệnh:

Vòng đời sán lá gan nhỏ phức tạp, qua nhiều vật chủ [2]:

(1) Giai đoạn ở người: Sán trường thành ký sinh ở đường mật đẻ trứng,trứng theo mật xuống ruột rồi theo phân phân ra ngoại cảnh Trứng rơi vàomôi trường nước tiếp tục pháttriển

(2) Giai đoạn ở ốc: Trứng sán bị ốc nuốt, trong ốc trứng nở thành ấutrùng lông (miracidia), ấu trùng lông phát triển qua hai giai đoạn là nang bàotử (sporocysts), bào tử trùng (rediae), sau đó phát triển thành ấu trùng đuôi(cercariae).

Sán lá gan nhỏ có tuổi thọ lâu dài trong vật chủ chính là con người, một báo cáo

về trường hợpC sinensissống trong cơ thể người hơn 26 năm [28].

Để gây nhiễm được cho người hay vật chủ khác, sán lá gan nhỏ phải ở giai đoạnấu trùng có khả năng gây nhiễm (giai đoạn nang ấu trùng).

Hình 1.8 Chu kỳ phát triển của sán lá gan nhỏC sinensis

(nguồn USA-CDC 2013)

1.1.4 Sức cảm thụ và miễndịch

Mọi người đều có thể mắc bệnh khi bị nhiễm sán lá gan nhỏ Người không cómiễn dịch tự nhiên với sán lá gan nhỏ, sau khi nhiễm mầm bệnh có thể dễ dàng bị táinhiễm [2].

1.1.5 Một số yếu tố liên quan đến nhiễm sán lá gan nhỏ trênngười

Yếu tố nguy cơ lớn nhất của nhiễm sán lá gan nhỏ là ăn gỏi cá, ăn cá nấu chưachín Có nhiều yếu tố liên quan đến hành vi này.

1.1.5.1 Tập quán ăn gỏicá

Thói quen ăn gỏi cá là một trong các yếu tố nguy cơ quan trọng ở những ngườinhiễm sán lá gan nhỏ, điều nay đã được chứng minh ở nhiều nghiên cứu tại Việt Namvà một số nước châu Á khác [29],[30].

Hoàng Quang Vinh (2017): những người ăn gỏi cá trong vòng 5 năm có nguy cơnhiễm bệnh cao hơn nhiều so với những người không bao giờ ăn gỏi

cá (OR = 9,06; 95% CI: 4,36 - 18,83) Những người chưa bao giờ ăn gỏi cá cũng bịnhiễm sán [29].

Nghiên cứu (2020) tại Yên Bái và Thanh Hóa cho thấy những người có tiền sử ăncá sống trong vòng 12 tháng có nguy cơ nhiễm cao gấp 8 lần so với những ngườikhông ăn cá sống Tuy nhiên khoảng 20,7% người nhiễm bệnh nhưng lại trả lời làkhông ăn cá sống, có thể do họ quên hoặc họ không muốn thừa nhận việc ăn cá sống.Một giả thuyết khác được đặt ra là có thể do ấu trùng nang đã lây nhiễm chéo quadụng cụ nấu ăn [31].

Một nghiên cứu khác tại Thái Lan (2021) cho thấy thói quen và tần suất ăn cásống hoặc chưa nấu chín có tên là Koi pla (gỏi cá sặc), một món ăn truyền thống

thường thấy ở miền Bắc và Đông Bắc Thái Lan, góp phần làm tỷ lệ nhiễmO.viverrinicao hơn các vùng khác [32].

1.1.5.2 Độ tuổi, giới tính, nghềnghiệp

Tuổi: Nói chung nhiễm sán lá gan nhỏ quan sát thấy ở tất cả các nhóm tuổi, tuynhiên thường gặp ở người lớn, hầu hết là những người trên 20 tuổi, đặc biệt ở độ tuổilao động Tỷ lệ và cường độ nhiễm tăng theo tuổi [33], [34] Nghiên cứu tại Trung

Quốc (2021) cho thấy tỷ lệ nhiễmC sinensiscao nhất ở nhóm 40 - 49 tuổi, gấp 33,51

lần nhóm 3 - 9 tuổi (95% CI: 10,13 - 110,86) [35] Điều này cho thấy cho thấy thóiquen ăn gỏi cá nước ngọt vẫn phổ biến ở những người lớn tuổi địa phương Nhiễm sánlá gan nhỏ ở trẻ em có thể do các bàmẹcho con mình ăn cá sống[12].

Giới: Nhiều nghiên cứu trên thế giới cho thấy tỷ lệ và cường độ nhiễm ở nam cao

hơn nữ [36] Nam giới làm tăng nguy cơ nhiễmC sinensisgấp 6,51 lần so với nữ giới

(95% CI: 4,67 - 9,08) Tương tự, tại Việt Nam đa số nghiên cứu đều ghi nhận tỷ lệnhiễm sán lá gan nhỏ ở nam cao hơn so với nữ Hoàng Quang Vinh (2017) cho thấy

nam có nguy cơ nhiễmC sinensiscao gấp 2,33 lần so với nữ (95% CI: 1,37 - 3,61, p

<0,001) Ngoài ra, nghiên cứu cũng tìm thấy mối quan hệ rõ ràng giữa giới tính, thóiquen ăn gỏi cá và uống rượu Tỷ

lệ nhiễm ở nam, ăn cá sống (67,41%) cao hơn ở nữ (32,59%) Nam (88%) uống rượucùng với ăn cá sống nhiều hơn so với nữ (12%, p = 0,000) Điều này phản ánh văn hóaViệt Nam, đàn ông khi “nhậu” thường uống rượu với “đồ nhắm” (như gỏi cá).

Nghề nghiệp: cũng là một trong các yếu tố liên quan đến tình trạng lây nhiễm sánlá gan nhỏ Các nhóm ngành nghề có tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ cao như là nông dân,ngư dân, đây là những người thường xuyên tiếp xúc với nguồn nước, đất và phân [31],[37] Tuy nhiên, một số nghiên cứu lại không tìm thấy mối liên hệ giữa nghề nghiệpvà nguy cơ nhiễm sán lá gan nhỏ[38].

1.1.5.3 Một số yếu tốkhác

- Yếu tố kinh tế - xãhội:

Kinh tế kém phát triển ảnh hưởng đến vệ sinh an toàn thực phẩm Dân trí thấpảnh hưởng đến ý thức và hiểu biết về biện pháp phòng chống bệnh Pháp lệnh an toànthực phẩm chưa thực sự có hiệu quả, và vệ sinh môi trường chưa được quy hoạch hợplý.

Hoàng Quang Vinh (2017) cho thấy trình độ học vấn ảnh hưởng đến tỷ lệ

nhiễmC sinensis,người có trình độ học vấn càng cao thì nguy cơ nhiễm càng thấp.Những người có trình độ trung học cơ sở có nguy cơ nhiễmC.sinensisthấphơn(OR=0,63; 95% CI: 0,38-1,05) so với nhóm có trình độ tiểu học Tất cả 14 người

có trình độ cao đẳng, đại học đều không nhiễm sán lá gan nhỏ [29].- Tập quán sinh hoạt và canhtác:

Tình trạng dùng phân tươi nuôi cá và đổ nước thải mang mầm bệnh xuống ao ởcác khu vực nông thôn là điều kiện giúp cho mầm bệnh sán lá gan hoàn thành nốt chukì gây bệnh và phát tán ra môi trường nước xung quanh Nhà có ao nuôi cá cũng đượccoi là yếu tố nguy cơ [39].

Nghiên cứu của tác giả Nguyễn Thị Thanh Huyền (2018) cho thấy những ngườithực hành sử dụng hố xí không đạt tiêu chuẩn vệ sinh thì có nguy cơ

nhiễm sán lá nhỏ cao gấp 2,5 lần so với nhóm sử dụng nhà vệ sinh đạt tiêu chuẩn(95% CI: 1,49 - 4,10) Những người thực hành sử dụng phân ủ dưới 6 tháng có nguycơ bị nhiễm sán lá nhỏ gấp 2,6 lần so với những người sử dụng phân ủ trên 6 tháng(95% CI: 1,66 - 4,22) [40].

Ngoài ra, súc vật thả rông (chó, mèo, ) và cả động vật hoang dã chính là ổ dự trữmầm bệnh làm ô nhiễm môi trường, chúng là vật chủ cảm nhiễm với sán lá gan nhỏ,do chúng ăn cá sống có chứa ấu trùng sán lá Những hộ gia đình nuôi mèo có nguy cơ

nhiễm sánO viverrinigấp 7 lần so với các hộ không nuôi mèo (95% CI: 1,36 – 36,09)

Di biến động dân cư đã kéo theo mầm bệnh và tập quán ăn gỏi cá từ vùng nàysang vùng khác[31].

- Yếu tố môi trường tự nhiên

Yếu tố khí hậu, nhiệt độ, độ ẩm, lượng mưa có liên quan đến sự phát triển của vậtchủ trung gian (ốc, cá)[41].

Khu hệ động vật/thực vật bao gồm các loài ăn ốc, ăn cá và cả những động/thựcvật làm thức ăn cho cá đều ảnh hưởng đến vật chủ trung gian của sán lá gan nhỏ [42].

Thảm họa thiên tai hàng năm cũng gây nên các biến động sinh thái đối với vậtchủ trung gian sán lá gan nhỏ (ốc và cá) và phát tán mầm bệnh [31].

1.1.6 Cácbiện pháp phòngchống

- Không ăn gỏi cá và các loại thực phẩm chế biến từ cá chưa nấuchín.- Không dùng phân người nuôi cá, không phóng uế xuống nguồnnước.- Truyền thông giáo dục sức khỏe cho cộng đồng về phòng chống bệnhsán lá gannhỏ.

- Định kỳ tẩy sán cho chó, mèo,lợn.

- Điều trị dự phòng tại cộng đồng: Áp dụng Hướng dẫn tẩy sán lá gannhỏ tại cộng đồng theo quyết định số 1931/QĐ-BYT ngày 19/5/2016 của Bộtrưởng Bộ Y tế[43].

1.1.7 Đặc điểm phân bố và tình hình nhiễm sán lá gan nhỏ ở ngườitrênthế giới và ViệtNam

1.1.7.1 Đặc điểm phân bố và tình hình nhiễm sán lá gan nhỏ trên thếgiới

Bệnh sán lá gan nhỏ phân bố trên thế giới rất đa dạng và có mặt ở nhiều quốc giakhác nhau Có khoảng 680 triệu người trên toàn thế giới có nguy cơ bị nhiễm sán lágan nhỏ Ước tính cho thấy 45 triệu người sống ở châu Á và châu Âu bị nhiễm bệnh,

với khoảng 35 triệu người nhiễmC sinensis, 10 triệu người nhiễmO viverrinivà 1,2triệu người nhiễmO felineus [44].

C sinensisgây bệnh phổ biến nhất trong số 3 loài sán lá gan nhỏ gây bệnh ở

người chủ yếu ở châu Á bao gồm Trung Quốc, Hàn Quốc, miền bắc Việt Nam vàmiền Đông nước Nga Hơn nữa, những người di cư hoặc du lịch từ các vùng lưu hànhbệnh sẽ làm tăng nguy cơ truyền bệnh sang các nước khác [45].

Theo Điều tra Toàn quốc về Ký sinh trùng Đường ruột (NSIP) năm 2012,C.sinensislà ký sinh trùng phổ biến nhất ở Hàn Quốc với tỷ lệ nhiễm là 1,9% dân

Một nghiên cứu (2020) được thực hiện trên 2.521 người tại một quận của tỉnh

Quảng Tây, tỷ lệ nhiễmC sinensisvẫn khá cao, lên tới 28,9% Phần lớn (66,2%) nhiễm

cường độ nhẹ Tỷ lệ nam giới nhiễm vừa và nặng (37,5%) cao hơn ở nữ giới (18,1%)(p <0,05) Tỷ lệ nhiễm cao nhất ở những người từ 30 - 59 tuổi Tần suất tiêu thụ cásống có liên quan đến cường độ nhiễm trùng Điều này cho thấy thói quen ăn gỏi cávẫn phổ biến ở 1 số nơi trên Thế giới, đặc biệt là khu vực Đông Á và Đông Nam Á[38].

Tương tự nhưC sinensis, dân cư nhiễm sánO viverrinithường sống ở những

vùng có nhiều ao, hồ và dọc những con sông [47] Ước tính có khoảng 12,39 triệu

người nhiễmO viverrinitại 4 quốc gia lưu hành chủ yếu bao gồm Thái Lan (6,71

triệu), CHDCND Lào (2,45 triệu), Việt Nam (2,07 triệu) và Campuchia (1,00 triệu)[48].

Myanmar vốn không phải là vùng lưu hành củaO viverrini Một nghiên cứu chothấy tỷ lệ nhiễmO viverriniở vùng nông thôn Hạ Myanmar là 9,3%, có khả năng khu

vực lưu hành mới của Myanmar nằm gần các khu vực có tỷ lệ sán lá gan nhỏ lưu hànhcao tại Thái Lan và do chính sách mở cửa biên giới bắt đầu từ năm 2015 dẫn đến việcgia tăng di cư giữa các nước Cộng đồng Kinh tế ASEAN (AEC) (Thái Lan, Cộng hòaDân chủ Nhân dân Lào, Campuchia, Việt Nam và Myanmar) [49] Một cuộc khảo sát

khác ở ba quận của Yangon cho thấy tỷ lệ hiện mắcO viverrinilà 0,7%[50].

Có một thực tế đáng lo ngại là mặc dù các chương trình điều trị và kiểm soátnhiễm sán lá gan nhỏ ở người đã được thực hiện trong nhiều thập kỷ ở tất cả các quốcgia khu vực hạ lưu sông Mê Kông song mức độ lưu hành cao của

O viverrinivà/hoặcC sinensiscũng như tỷ lệ mắc ung thư đường mật vẫn cao

đáng báo động [51].

LoàiO.felineusítphổbiếnnhấttrongsố 3loài sánlágannhỏ Nó đãđượcbáocáotừ các

quốc giachâuÂutrừPhầnLan,Na Uy và ThụyĐiển Khoảng 12,5 triệu ngườicó nguy cơ

nhiễmO.felineus,chủ yếugặp ởkhu vựcNga,Đông Âu[12].Một loạt cácđộngvật có

vúnhưmèo,chó, cáo, gấuđượcbiết đến làvật chủ chínhvà lànguyên nhân

Hầu hết các bệnh nhân nhiễm sán không có triệu chứng [53], có bằng chứng cho

thấyO.felineuslà một yếu tố nguy cơ của ung thư biểu mô đường mật (CCA) [54],

Nghiên cứu của tác giả Olga S Fedorova (2020) và cộng sự tại phía Tây Siberia,

Liên bang Nga cho thấy tỷ lệ nhiễmO felineustrong cộng đồng là 60,2% Một trong

các yếu tố nguy cơ là ăn gỏi cá nước ngọt [52].

Tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ khác nhau ở từng vùng địa lý Mặc dù đã có nhiềunghiên cứu quy mô trong quá khứ nhằm mục đích lập bản đồ phân bố các loài sán lágan nhỏ ở người tuy nhiên số liệu trên toàn cầu còn nhiều phức tạp và khác nhau ở cácnghiên cứu do nhiều lý do Dựa trên xét nghiệm PCR

được phát triển trong hai thập kỷ gần đây đã phát hiệnC sinensistrong các khu vựclưu hành truyền thống củaO viverrini và O felineus[56] Dữ liệu ban đầu liên quan

đến bệnh sán lá gan nhỏ ở một số khu vực bị đánh giá thấp, việc thiếu hụt các dữ liệutrong quá khứ ở một số nước như Hong Kong, Macau, Việt Nam, Nga đặc biệt làCộng hòa dân chủ nhân dân Triều Tiên dẫn đến sự không chính xác khi ước tính tìnhtrạng nhiễm bệnh trong tương lai Một số nghiên cứu chỉ ra rằng tỷ lệ nhiễm sán lá gannhỏcóthể đang gia tăng vàmởrộng tới nhiều khu vực địa lý vốn không phải vùng lưuhành truyền thống Điều này do nhiều nguyên nhân như: thói quen ăn uống khó thayđổi và dân số ngày càng tăng trong các khu vực lưu hành bệnh, gia tăng buôn bánquốc tế các sản phẩm nuôi trồng thủy sản nước ngọt làm lây lan sán lá gan nhỏ cũngnhư các loài ký sinh trùng truyền từ động vật sang cá khác[57].

1.1.7.2 Đặc điểm phân bố và tình hình nhiễm sán lá gan nhỏ tại ViệtNamTại Việt Nam,C sinensisnhiễm trên

người lần đầu tiên được báo cáo năm 1887[58] Sau đó, Thành phố Sài Gòn thông báo

có 291 người nhiễmC sinensis, nhưng chủ

yếu những người này có nguồn gốc từ miềnBắc di cư vào Nam [59] Mãi sau này (năm

1994), ca nhiễm sánO viverriniđầu tiên mới

được phát hiện trên những cư dân ở Phú Yên,miền Trung Việt Nam [60] Từ đó đến nay,có rất nhiều nghiên cứu về tình trạng

nhiễmC sinensis và O viverrinitrong các

khu vực lưuhành.

Hình 1.9 Phân bố của sán lá gan nhỏ tạiViệt Nam [3]

Việt Nam là nước đang phát triển, miền bắc có khí hậu cận nhiệt đới gió mùa với4 mùa riêng biệt Miền nam nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa khí hậu nóng và ẩmquanh năm với 2 mùa Hai đới khí hậu khác biệt là điều kiện thuận lợi cho cho sự xuất

hiện và phân bố của 2 loài sán lá gan nhỏ:C.sinensislưu hành ở ít nhất 21 tỉnh miềnbắc vàO viverrinilưu hành ở ít nhất 11 tỉnh miền trung và khu vực Tây Nguyên, tỷ lệnhiễm khác nhau tùy địa điểm [43].

Các tỉnh: Nam Định (nơi cao nhất là 26,0–37,5%), Ninh Bình (tỷ lệ nhiễm daođộng từ 23,5–31,0%), Phú Yên, Bình Định được coi là điểm nóng nhiễm sán lá gannhỏ, tập quán ăn gỏi cá của nhân dân đã tồn tại lâu đời [3].

Trước đây, chẩn đoán nhiễmC sinensisvàO viverrinichỉ dựa vào xét nghiệm tìm

trứng trong phân có thể đã dẫn đến xác định sai ở cấp độ loài.TrênthựctếrấtkhóphânbiệttrứngsánlágannhỏOpisthorchiidaespp(giữa

C sinensisvàO viverrini) và trứng sán lá ruột nhỏ Heterophyidae spp Tỷ lệ nhiễmH.pumiliovàH taichuiphổ biến hơnC sinensisvàO viverrinivà chúng thường đồng lây

nhiễm ở người Các cuộc khảo sát tại Nam Định và Ninh Bình cho thấy tỷ lệ nhiễmtrứng sán lá gan nhỏ trong phân lần lượt là 22,7 – 64,9% và 9,4 – 30,9% dân cư Đángngạc nhiên là các mẫu sán lá sau tẩy được xác định là sán lá ruột, ngược lại tỷ lệ sán

xác định làC sinensislại rất thấp Vì vậy, các báo cáo trước đây về tỷ lệ nhiễm sán lá

gan nhỏ ở Việt Nam có thể đã cao hơn thực tế[3].

Một báo cáo về 76 trường hợp nhiễmC sinensistrên người được ghi nhận tại Xã

Thuận Hạnh, tỉnh Đắk Nông, miền Trung Việt Nam gần Campuchia Tuy nhiên, tất cảnhững người bị nhiễm bệnh đều di cư từ các tỉnh Nam Định và Ninh Bình[61].

Chưa có báo cáo về tình trạng nhiễmO viverrinitrên người tại khu vực miềnNam, mặc dù tìm thấy ấu trùng sán lá gan nhỏ trên cá lócChannastriata(Channidae) ở

An Giang và sán trưởng thành trên mèo ở Tây Ninh[3].

Các nghiên cứu trong 20 năm gần đây đã đi sâu xác định loài bằng hình thái phốihợp với các phương pháp sinh học phân tử đã cho thấy rõ thành phần loài ở các khuvực nhiễmbệnh.

Điều tra cắt ngang (2020) của Nguyễn Thị Bích Thảo tại 4 xã lưu hành sán lá gan

nhỏ của Yên Bái và Thanh Hóa cho thấy tỷ lệ nhiễmC sinensiskhá cao 40,4%, dao

động từ 26,5% - 53,3% Các yếu tố nguy cơ bao gồm: giới tính nam, tiền sử ăn gỏi cátrong vòng 12 tháng, học vấn thấp, chưa điều trị, 19-39 tuổi, nhà tiêu không hợp vệsinh[31].

Số liệu điều tra 5 năm gần đây của Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùngTrung ương cho thấy tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ tại Bình Định là 6,8%; Quảng Trị8,9%; Đăk Lăk 4,8%; Phú Yên 15,3%; Quảng Nam 4,3%; Hòa

Bình 24,4%; Nam Định 11,8%; Ninh Bình 21%, Thanh Hóa 21,6%, Yên Bái 23 –64,7%, Sơn La < 1% [62] Tuy nhiên, còn rất nhiều địa phươngmàn g ư ờ i d â n c ót h ó i q u e n ă n g ỏ i c á n h ư n g c h ư a đ ư ợ c đ á n h g i á v à c h ư ac ó s ố l i ệ u v ề t h ự c t r ạ n g n h i ễ m s á n l á g a n n h ỏ đ ể c ó t h ểt i ế n h à n h c á c b i ệ n p h á p c a n t h i ệ p v à p h ò n g c h ố n g b ệ n hn h ư t ạ i v ù n g l ò n g hồThác Bà thuộc tỉnh Yên Bái, một số huyện của tỉnh NinhBình, tỉnhPhúYên và BìnhĐịnh.

1.1.7.3 Một số đặc điểm về tình hình nhiễm sán lá gan nhỏ tại hai xã củaNinhBình và PhúYên

- Một số đặc điểm tự nhiên về địa điểm nghiên cứu+ Xã Yên Lộc, huyện Kim Sơn, tỉnh Ninh Bình:

Tổng diện tích tự nhiên: 712,84 ha trong đó đất nông nghiệp 533,2 ha Dân số:8.709 người, trong đó có 4.904 người trong độ tuổi lao động Địa hình xã Yên Lộctương đối bằng phẳng, có vị trí giao thông thuận lợi (nằm trên quốc lộ 10, cách trungtâm huyện 3km) Đất đai mầu mỡ, cảnh quan thiên nhiên tươi đẹp, thuộc vùng nhiệtđới gió mùa khí hậu ôn hoà, chế độ thủy triều lên xuống đều đặn thuận lợi cho câytrồng Có nhiều ao, sông, ngòi là điều kiện thuận lợi cho phát triển nghề nuôi cá vàchăn nuôi gia sức giacầm.

+ Xã An Mỹ, huyện Tuy An, tỉnh Phú Yên:

Tổng diện tích đất tự nhiên khoảng 1.354,5 ha, tổng dân số 10.710 người Mật độdân số 789 người/km2, đô thị loại V chuyên ngành, tiểu vùng phía Nam của huyện TuyAn Là cửa ngõ, đầu mối phía Đông, nằm tại giao đường DT643 và Quốc lộ 1, đóngvai trò kết nối giao thương với các đô thị Vân Hòa, Trà Kê Đồng thời, là đô thị cửangõ phía Bắc của thành phố Tuy Hòa Địa hình đa dạng: đồng bằng, ven biển và đồinúi, được thiên nhiên ưu đãi tạo nên nhiều cảnhquan.

- Tình hình nhiễm sán lá gan nhỏ tại địa phương

+ Tại Ninh Bình:

Nghiên cứu của tác giả Đoàn Thúy Hòa tại Yên Khánh, Ninh Bình cho thấy: Tỷ

lệ nhiễmC sinensislà 19,5% Tỷ lệ nhiễm và cường độ nhiễm sán trung bình ở nam

cao hơn ở nữ (p< 0,001; OR = 3,994) Người ăn gỏi cá có nguy cơ nhiễm sán cao gấp5,8 lần không ăn gỏi cá (p<0,001) Đa số (87,2%) nhiễm nhẹ, không có ca nhiễm nặng[63].

Nghiên cứu của tác giả Hoàng Quang Vinh tại xã Gia Thịnh, Ninh Bình (2017)

trên 510 người (bao gồm cả ngư dân và người kinh doanh cá) cho thấy: tỷ lệ nhiễm C.sinensistrung bình là 16,5% (từ 2% đến 34,4%) Yếu tố liên quan bao gồm nam giới,

trình độ học vấn thấp, tần suất tiêu thụ cá sống và nơi sinh sống Tỷ lệ nhiễm bệnh ởngười ăn cá sống đánh bắt từ sông cao hơn đáng kể so với những người ăn cá từ aonuôi (P <0,05)[29].

Điều tra của Đoàn Thúy Hòa (2020) tại Kim Sơn và Yên Khánh, Ninh Bình chothấy tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ là 20,1% Tỷ lệ nhiễm ở nam giới (26,6%) cao hơn ởnữ (8,3%) (p< 0,001) Đa số (87,2%) nhiễm nhẹ, không có đối tượng nào nhiễm mứcđộ nặng [63].

+ Tại Phú Yên:

Năm 2008, Nguyễn Văn Chương và công sự nghiên cứu tỷ lệ

nhiễmO.viverriniPhú Yên và Bình Định từ 3,92% - 7,67% [64].

Các điều tra từ năm 2015-2018 của Viện Sốt rét – Ký sinh trùng và Côn trùng

Trung ương cho thấyO viverriniphân bố ở các tỉnh miền Trung và khu vực Tây

Nguyên, trong đó Phú Yên là 15,3%.

Gần đây, không có nhiều điều tra về thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ được thựchiện tại Phú Yên Một số nghiên cứu tiến hành tại Bình Định, địa phương tiếp giáp với

Phú Yên và cũng được coi là vùng lưu hànhO viverrinivới tỷ lệ nhiễm cao.

Đào Thị HàThanhvà Bùi Văn Tuấn(2015) điều tratại BìnhĐịnh trên254ngườibằngkỹthuậtKato-Katz.Kếtquả chothấy:Tỷ lệhiệnmắclà11,4%(95%CI:8-16), giớitính

namvàviệc tiêuthụ cá sống(Carassius auratus)lànhững yếutốnguy cơ.Sán trưởngthànhthuđượclàO.viverrini[65].

Kết quả nghiên cứu định loài bằng PCR và Real-time PCR của tác giả Nguyễn

Thị Thanh Huyền (2018) phát hiện sánC sinensiscó mặt tại Bình Định bên cạnh sánO.viverrini, tỷ lệ nhiễm 2 loài sán lá gan nhỏC sinensislà 3,0% vàO viverrinilà 21,3%.

Đây được xem như lần đầu tiên phát hiện

C sinensisở Nam Trung bộ Điều này có thể giải thích là do hiện tượng biến động dân

cư với sự giao lưu của hai miền Bắc và Nam, bệnh nhân có thể mang mầm bệnh từmiền Bắc vào miền Nam và ngược lại Điều này thúc đẩy việc tiếp tục nghiên cứu xácđịnh sự phân bố các loài sán lá gan nhỏ ở người trong tình hình hiện nay, đặc biệt ởnhững vùng vốn không phải vùng lưu hành truyền thống của sán lá gan nhỏ [40].

1.2 Đặc điểm lâm sàng, chẩn đoán và điều trị bệnh sán lá gan nhỏ trênngười

1.2.1 Đặc điểmlâmsàng bệnh sán lá gan nhỏ trênngười

Tùy thuộc vào thời gian mắc bệnh và cường độ nhiễm cũng như các yếu tố ảnhhưởng mà các biểu hiện lâm sàng điển hình hay không điển hình.

Đa số trường hợp nhiễm bệnh không có triệu chứng lâm sàng hoặc có một sốtriệu chứng như: rối loạn tiêu hóa, mệt mỏi, chán ăn, gầy sút…

Có ba thể bệnh: thể nhẹ, thể trung bình, thể nặng [2].

Tần suất gặp các biểu hiện cấp tính ở người nhiễm sán lá gan nhỏ khoảng 10%.Các triệu chứng cấp tính sốt, viêm gan, tăng bạch cầu ái toan thường gặp ở người

nhiễmO felinius, hiếm khi gặp ở người nhiễmC.sinensisvàO viverrini[66].

Một nghiên cứu năm 2004 đưa ra ước tính có khoảng 15 triệu người nhiễmC.sinensisở Đông Á, đặc biệt là ở Trung Quốc, Hàn Quốc và Việt Nam, có thể gây ra

gần 5.000 trường hợp ung thư biểu mô đường mật hàng năm trong tương lai [57].

Năm 2009, sán lá ganClonorchis sinensisđược Cơ quan Nghiên cứu Ung thư

Quốc tế (IARC) thuộc Tổ chức Y tế Thế giới xếp vào loại "gây ung thư cho người"(chất gây ung thư nhóm I) dựa trên sự liên quan đến căn nguyên của ung thư đườngmật[67].

Ca bệnh nghi ngờ có các xét nghiệm sau:

- Tìm thấy trứng sán lá gan nhỏ trong phân hoặc dịch tátràng.

- Xét nghiệm miễn dịch dương tính với kháng nguyên hoặc kháng thểcủa sán lá gannhỏ.

1.2.2.3 Chẩn đoán phânbiệt

- Áp xe gan do các loại ký sinh trùng khác, viêm gan do vi rút, sỏi túi mật, viêm đường mật, viêm tụy, cơn đau dạdày.

- Ung thư đường mật, ung thư gan nguyênphát.

1.2.3 Điều trị bệnh sán lá gan nhỏ trênngười

Praziquantel được xác định có hiệu quả điều trị khỏi cao tới 90 - 95% và khôngxảy ra tình trạng kháng thuốc và tái nhiễm [68].

Praziquantel liều 75mg/kg chia 3 lần/ngày, dùng 1 ngày, uống cách nhau 4 giờsau ăn Hoặc Praziquantel liều 75mg/kg x 3 lần/ngày, dùng 1 ngày [2].

Một số nghiên cứu cho thấy: Trong điều trị nhiễmC sinensisở người với liều

25mg/lần x 3 lần/ngày x 1 ngày, tỷ lệ khỏi là 85% và tỷ lệ giảm trứng trong phân là

99,7% trong điều trịO viverrinivới liều 40mg/kg thì tỷ lệ khỏi là 90% và tỷ lệ giảmtrứng > 99,7%; điều trịO felineusvới liều 25mg/lần x 3 lần/ngày x 1 ngày tỷ lệ khỏi là

Phương pháp tập trung trứng bằng ly tâm lắng cặn theo Esteban và cộng sự(1997) hoặc ly tâm lắng cặn formalin–ether cải tiến là phương pháp tập trung trứnggiun sán và bào nang đơn bào dựa trên nguyên lý ly tâm lắng cặn có độ chính xác cao,ngoài trứng giun sán có thể phát hiện được đơn bào thể kén, dễ dàng kiểm tra lại cácmẫu nghi ngờ do phân có thể được bảo quản

trong Formalin 10% Trong các nghiên cứu kỹ thuật Kato-Katz và formalin- etherthường được sử dụng để sàng lọc hàng loạt trong vùng lưu hành sán, được coi là có độnhạy và độ tin cậy tương đương [72] Tuy vậy, tương tự như phương pháp Kato-Katzdo lượng trứng trong phân ít nên dễ bỏ sót bệnh nhân, khó áp dụng trong xét nghiệmtại thựcđịa.

Xét nghiệm miễn dịch chẩn đoán sánlágannhỏ: phản ứng ELISA (enzyme-Linkedimmunosorbent assay) có độnhạycao, độ đặc hiệu tùy thuộc vàotừng loại testvàcònnhiều tranh luận,có hiệntượng dương tính kéodài vàdương tínhchéo giữa cácloài,khótriển khaitạithựcđịa[73].

Phát hiện trứng sán lá gan nhỏ trong phân bằng các phương pháp sinh học phântử đã được phát triển từ nhiều năm trước đây [74] Kỹ thuật PCR sử dụng các gen đích

rất đa dạng như gen ty thể, bộ đệm phiênmãnội ITS),cytochromecoxidase1(cox1),NADHdehydrogenase 1 (nad1), có độ nhạy, độ đặc

(InternalTranscribedSpacer-hiệu cao hơn kỹ thuật xét nghiệm hình thái học và kỹ thuật miễn dịch ngay cả khicường độ nhiễm sán thấp Tuy nhiên, các kỹ thuật này khó áp dụng tại các cơ sở y tếdo phải đầu tư hệ thống phòng thí nghiệm hiện đại, đào tạo nhân lực và chi phí đắt [7],[75] Gần đây có xu hướng chuyển sang các phương pháp khuếch đại ADN đẳng nhiệtvới ưu điểm là độ nhạy và độ đặc hiệu tương đương kỹ thuật PCR nhưng loại bỏ đượccác bước luân nhiệt nên chỉ cần các thiết bị xét nghiệm đơn giản, nhỏ gọn, thời gianxét nghiệm rút ngắn xuống còn 30 - 60 phút, có khả năng phát triển thành các bộ kitphân tử cho phép ứng dụng được tại thựcđịa.

Trong các điều tra trước đây, hầu hết, chỉ sử dụng phương pháp chẩn đoán dựavào hình thái học; một số nghiên cứu ứng dụng sinh học phân tử chỉ dùng để xác địnhloài là chính, không xác định được chính xác tỷ lệ nhiễm của từng loàisán.

1.4 Kỹ thuật LAMP và nghiên cứu chế tạo bộ kít LAMP xét nghiệm pháthiện nhiễm sán lá gan nhỏ trênngười

Kỹ thuật LAMP được phát triển vào năm 2000 bởi nhóm tác giả T Notomi (NhậtBản) [76] Đây là một phương pháp khuếch đại ADN có tính đặc hiệu, hiệu quả cao và

thời gian ngắn, bằng cách tận dụng ưu điểm khuếch đại của enzymeBstADN

polymerase và 4 mồi được thiết kế đặc biệt để nhận diện 6 vùng trình tự cách xa nhautrên ADN đích.

Dù mới được phát triển trong gần 20 năm nhưng LAMP cũng đã được ứng dụngvào nhiều lĩnh vực như phát hiện, chẩn đoán các mầm bệnh trên người và trong lĩnhvực thú y, công nghiệp thực phẩm, môi trường.

1.4.1 Nguyên lý của kỹ thuậtLAMP

Kỹ thuật LAMP sử dụng 4 - 6 mồi khác nhau được thiết kế đặc biệt để nhận ra 8 vùng riêng biệt trên gen đích và phản ứng diễn ra ở một nhiệt độ duy nhất LAMPchỉ xảy ra khi cả 4 chuỗi mồi, bao gồm các mồi F3, B3, FIP (F1c+F2), BIP (B1c+B2)bám được vào các vị trí đích của khuôn, tạo ra sản phẩm ADN-vòng Thành phầnphản ứng gồm có ADN khuôn, mồi, enzyme Bst DNA polymerase, dung dịch đệmphản ứng Quá trình tái bản gen đích chỉ diễn ra trong một bước duy nhất thường ở550C - 650C, hiệu quả khuếch đại cao khoảng 109- 1010bản sao trong thời gian từ 15 -60 phút Sản phẩm của phản ứng có thể quan sát bằng mắt thường do sự kết tủa củamuối pyrophotphate (Mg2P2O7) dưới dạng vẩn đục màu trắng hoặc phát quang khinhuộm bằng các chất chỉ thị màu (SYBR green, HNB, Xanhmachit…) Do vậy,LAMP thường được sử dụng để tạo các kit chẩn đoán nhanh[77].

6-1.4.2 Thành phần phản ứngLAMP

Kỹ thuật LAMP dựa trên nguyên lý tổng hợp ADN thay thế chuỗi tự xoay vòng

được thực hiện bởi sự xúc tác của enzymeBst ADN polymerasevà hai cặp mồi trong và

mồi ngoài được thiết kế đặc biệt Ở các bước đầu của

phản ứng cả 4 mồi được sử dụng, nhưng sau đó chỉ các mồi trong được sử dụng để tổng hợp ADN thay thế chuỗi [76].

Hình 1.10 Các mồi thiết kế và vị trí bắt cặp trên gen đích [78]

Cặp mồi trong gồm 2 mồi: Mồi xuôi (forward inner primer- FIP) và mồi ngược(backward inner primer- BIP) và mỗi mồi có chứa hai trình tự riêng biệt tương ứng vớitrình tự sense và antisense của ADNđích.

Thiết kế mồi có thể thực hiện tự động, sử dụng các phần mềm thiết kế mồiLAMP trực tuyến.

1.4.3 Cơchế của phản ứngLAMP

Gồm ba giai đoạn chính: tạo vật liệu khởi đầu, tái bản và kéo dài chuỗi, cuốicùng là lặp lại chu kỳ [76] Để khởi động phản ứng LAMP, hỗn hợp phản ứng LAMP

được ủ ở nhiệt độ đẳng nhiệt trong khoảng 60-65°C (nhiệt độ hoạt động củaBstADN

polymerase) trong 1giờ.

Hình 1.11 Sơ đồ phản ứng LAMP ở giai đoạn tạo vật liệu khởi đầu [78]

- Chu kỳ tái bản và kéo dàichuỗi

Để khởi đầu cho chu kì phản ứng LAMP, FIP bắt cặp bổ sung với ADN đầu vòngở vị trí F2c để tiến hành tổng hợp mạch bổ sung thay thế Mặt khác, BIP sẽ bổ sungvào đầu kia của mạch ADN đầu vòng và xảy ra quá trình tổng hợp ADN tương tự Kếtquả của phản ứng tạo ra hỗn hợp các sợi đôi ADN chứa nhiều trình tự ADN mục tiêuvới kích thước khác nhau.

Hình 1.12 Sơ đồ phản ứng LAMP giai đoạn tái bản và kéo dài chuỗi [78]

1.4.4 Đánh giá kết quả củaLAMP

- Đánhgiákếtquảbằngđiệndi[79]:Kếtquảdươngtínhchovạchsmeardài.

Hình1.13.Hìnhảnhđiện di sảnphẩmLAMP[ 7 9 ]

- Đánh giá kết quả không bằng điện di[79]:

Do lượng sản phẩm của phản ứng LAMP rất lớn nên ta có thể quan sát bằngmắt thường nếu có một số hóa chất nhuộm thích hợp:

Kết quả phản ứng LAMP được đánh giá thông qua độ đục của hỗn hợp phản ứngmà không cần điện di Khi ADN đích được khuếch đại bởi LAMP, một chất kết tủatrắng bắt nguồn từ magnesium pyrophosphate (một sản phẩm phụ của phản ứngLAMP) sẽ xuất hiện Có thể quan sát và so sánh độ đục với mẫu âm tính (đục hơn làdương tính), hoặc tiến hành đo độ hấp thụ ở 650nm.

Hình1.14.Sản phẩm LAMP khi quan sát bằng mắtthường

Mộtphươngphápkháclà sửdụng các chất nhuộmmàucho vàomẫu trước hoặcsaukhichạy LAMP.Ví dụ:bổsungSYBRGreenI,ethidiumbromidehayFluorescentsaukhicósảnphẩmLAMP,bổsungHydroxylNapthol Blue(HNB)vàophản ứngLAMPtrướckhitiếnhành nhânbản.RồiquansátdướiđènUV Kếtquảdươngtính có hiệnmàuđặctrưnghayphátsáng.

Hình 1.15 Hình ảnh sản phẩm LAMP nhuộm bằng SYBR green [79]

a Quan sát dướiđènUVb Quan sát thông thường

1.4.5 Quy trình thực hiệnLAMP

Các bước tiến hành phản ứng LAMP: Lấy mẫu, tách ADN/ARN, khuếch đạiđẳng nhiệt và phát hiện sản phẩm.

Hình 1.16 Quy trình thực hiện LAMP

(nguồn EikenGenomesiteViệt hóa)[78]