khảo sát sự hiện diện gen enba 1 của epstein barr virus ở ung thư vòm họng

Đến năm 2017, số lượng mắc ung thư vòm họng tại Việt Nam được dự đoán tăng lên đến 5,7% thể hiện sự phát triển của bệnh trong cộng đồng dân cư Việt Nam rất cao [68].. Các biến đổi epigen

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM

BÁO CÁO KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP

Tên đề tài:

KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN GEN ENBA-1

CỦA EPSTEIN-BARR VIRUS Ở UNG THƯ VÒM HỌNG

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: VI SINH-SINH HỌC PHÂN TỬ

CBHD: ThS LAO ĐỨC THUẬN SVTH: NGUYỄN TRẦN HẢI NAM MSSV: 1253012208

Khóa: 2012-2016

Tp Hồ Chí Minh, tháng 06 năm 2016

NHẬN XÉT CỦA GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin gửi lời cám ơn chân thành nhất đến khoa Công Nghệ Sinh Học, quý thầy cô, những người bạn đã tạo mọi điều kiện và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực tập

Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS TS Lê Huyền Ái Thúy, người đã dìu dắt, truyền cho em niềm đam mê làm nghiên cứu, giúp đỡ và định hướng cho em trong suốt thời gian thực tập

Xin chân thành cảm ơn ThS Lao Đức Thuận, người thầy đã luôn tận tình hướng dẫn, động viên và giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Xin chân thành cảm ơn ThS Trương Kim Phượng, người luôn sẵn lòng giúp đỡ, góp ý và đưa ra những lời khuyên bổ ích cho em để em có thể trau dồi thêm kinh nghiệm cần thiết trong công việc làm nghiên cứu

Cảm ơn bạn bè và tất cả các bạn trong phòng thí nghiệm sinh học phân tử đã nhiệt tình giúp đỡ, động viên tôi trong những lúc khó khăn trong thời gian thực hiện đề tài Cuối cùng con xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến ba mẹ, người đã nuôi dưỡng, yêu thương, chăm sóc, động viên tạo điều kiện tốt nhất cho con thực hiện ước mơ của mình

Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 10 tháng 06 năm 2016

Nguyễn Trần Hải Nam

MỤC LỤC

1 PHẦN I: TỔNG QUAN 11

1.1 Tổng quan về ung thư 11

1.1.1 Khái niệm về ung thư và tình hình ung thư trên thế giới 11

1.1.1.1 Khái niệm về ung thư 11

1.1.1.2 Tình trạng bệnh ung thư trên thế giới và Việt Nam 11

1.2 Tổng quan về ung thư vòm họng 12

1.2.1 Giải phẫu vùng vòm họng 12

1.2.2 Khái niệm về ung thư vòm họng 13

1.2.3 Sự phân bố và sự phân hóa của ung thư vòm họng 13

1.2.4 Các nguyên nhân gây ung thư vòm họng 14

1.3 Epstein-Barr Virus 16

1.3.1 Danh pháp và cấu tạo 16

1.3.2 Một số protein của EBV và chức năng 18

1.3.3 Cơ chế xâm nhiễm và hoạt động của EBV 19

1.4 Gen EBNA-1 23

1.4.1 Sơ lược về gen EBNA-1 và sản phẩm 23

1.4.2 Ảnh hưởng của protein EBNA-1 lên sự biến đổi của tế bào chủ 25

1.4.3 Vai trò của EBV, EBNA-1 và sản phẩm phiên mã trong diễn tiến ung thư vòm họng 28

1.5 Các phương hướng chẩn đoán NPC 28

1.5.1 Các phương pháp và xu hướng trong chẩn đoán NPC 28

1.5.2 Phương pháp không xâm lấn 29

2 PHẦN II: VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP 31

2.1 Vật liệu 31

2.1.1 Các phần mềm và trang web đã sử dụng 31

2.1.2 Các hoá chất và thiết bị 31

2.2 Phương pháp 32

2.2.1 Thu thập dữ liệu 32

2.2.2 Thu thập các trình tự và mồi tham khảo 32

2.2.3 Đánh giá mồi 32

2.2.4 Khảo sát sự hiện hiện của gen EBNA1 33

3 PHẦN 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 37

3.1 Khai thác dữ liệu 37

3.2 Kết quả khảo sát mồi 42

3.3 Kết quả khảo sát tách chiết DNA 47

Hình 1.6 Vòng đời EBV khi phát sinh khối u

Hình 1.7 Chức năng của từng vùng trên protein EBNA-1

Hình 1.8 Vị trí tương tác của EBNA-1 trên vùng DS (Dyad Symmetry) và FR (Family of Repeat) Các vị trí được tô màu xanh vị trí gắn EBNA-1

Hình 1.9 Các tác động của protein EBNA-1 lên tế bào chủ thông qua các đường truyền tín hiệu

Hình 1.10 Phản ứng PCR

Hình 2.1 Sơ đồ phát hiện EBNA-1 của EBV

Hình 2.2 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR

Hình 3.1 Tần số phát hiện EBNA-1 và trung bình trọng số của gen

Hình 3.2 Tần số phát hiện EBV trung bình có trọng số trên các loại mẫu khác nhau Hình 3.3 Kết quả clustal mồi EBNA-1 F

Hình 3.4 Kết quả clustal mồi EBNA-1 R

Hình 3.5 Vị trí bắt cặp của bộ mồi trên trình tự NC_0077605.1 Hình 3.6 Kết quả Blast mồi EBNA1-F

Hình 3.7 Kết quả Blast mồi EBNA1-R

Hình 3.8 Kết quả clustal 2 mồi F-R của β-actin

Hình 3.9 Kết quả anhyb với trình tự NC_018916

Hình 3.10 Kết quả Blast mồi F của β-actin Hình 3.11 kết quả Blast mồi R của β-actin

Hình 3.12 Kết quả PCR khảo sát nhiệt độ

Hình 3.13 Kết quả khảo sát EBNA1 trên một số mẫu mô UTVH và mô lành

Hình 3.14 Kết quả sản phẩm PCR mẫu dịch phết

Hình 3.15 Kết quả giải trình tự mẫu P39 Hình 3.16 Kết quả giải trình tự mẫu P40

Hình 3.17 Kết quả Clustal các trình tự với EBNA1

Hình 3.18 Kết quả Blast mẫu P39 Hình 3.19 Kết quả Blast mẫu P40

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Các protein của EBV và chức năng

Bảng 1.2 Các trạng thái tiềm tan và các gene hoạt động trong từng trạng thái Bảng 2.1 Các bước tách chiết DNA

Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR

Bảng 3.1 Một số phương pháp phát hiện EBV

Bảng 3.2 Trung bình trọng số tần số phát hiện EBNA-1 trong tế bào ung thư và tế bào

bình thường

Bảng 3.3 Một số loại mẫu được sử dụng trong phát hiện EBV

Bảng 3.4 Tần số phát hiện EBV trung bình có trọng số ở các loại mẫu khác nhau trong ung thư vòm họng

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ung thư biểu mô vòm họng (Nasopharyngeal carcinoma, NPC) là một trong tám loại ung thư phổ biến nhất tại Việt Nam Đồng thời, Việt Nam còn nằm ở khu vực Đông Nam Á, một trong ba khu vực có tỷ lệ mắc NPC cao đột biến trên bình diện thế giới Năm 2012, trên thế giới có 86.691 ca mắc NPC và có đến 66,2% số ca bệnh đến từ nhóm khu vực có tỷ lệ mắc NPC cao, vùng Nam Trung Quốc, vùng Đông Nam Á và Bắc Phi Lý do giải thích cho việc phân bố tấp trung của bệnh ở một vài khu vực chính là tính phân hóa về mặt địa lý, chủng tộc của ung thư vòm họng Trong cộng đồng dân cư ở khu vực Bắc Mĩ và các nước châu Âu tỷ lệ mắc NPC là thấp hơn 1 ca/100.000 người , trong khi tỷ lệ này ở vùng Đông Nam Á và Nam Trung Quốc lần lượt là 17 ca/ 100.000 người và 50 ca/100.000 người Tại Việt Nam vào năm 2012, có 4931 trường hợp mắc ung thư vòm họng chiếm 3,9% trên tồng số các bệnh ung thư (đứng thứ 8 về tỷ lệ mắc) và có 2.885 trường hợp tử vong do ung thư vòm họng Theo dự đoán của globalcan, đến năm 2017 sẽ có 12177 trường hợp mắc ung thư vòm họng tại Việt Nam đây là sự gia tăng khá nhanh so với thế giới và của khu vực Đông Nam Á

EBV (của Epstien-Barr virus) là virus đầu tiên con người được xác định là có liên quan với các trường hợp ung thư ở người, bao gồm cả tế bào bạch huyết cũng như tế bào biểu mô Sự xâm nhiễm EBV là một trong các nguyên nhân chính gây ung thư vòm họng ngoài các yếu tố thuộc về di truyền và môi trường Bộ gen của EBV đã được tìm thấy trong hầu hết các tế bào NPC, minh chứng cho sự xâm nhiễm EBV có liên

quan mật thiết đến việc mắc ung thư vòm EBNA-1 là gen kháng nguyên hạt nhân của

Epstein-Barr virus (Epstein-Barr nuclear antigen-1) đóng vai trò quan trọng trong sự

tồn tại và các hoạt động của EBV trong tế bào EBNA-1 được tìm thấy trong tất cả các

khối u ác tính có liên quan đến EBV nên đã được sử dụng thường xuyên nhằm phát hiện EBV và tiên lượng các bệnh (ung thư) có liên quan đến EBV (điển hình là ung thư biểu mô vòm họng)

Việc chẩn đoán sớm NPC có ý nghĩa quan trọng trong quá trình điều trị bệnh nhưng lại bị trở ngại bởi việc bệnh không có dấu hiệu lâm sàng đặc trưng Đồng thời,

EBNA-1 cho thấy tiềm năng lớn để làm marker phát hiện EBV và tiên lượng sớm NPC

1 PHẦN I: TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về ung thư

1.1.1 Khái niệm về ung thư và tình hình ung thư trên thế giới 1.1.1.1 Khái niệm về ung thư

Ung thư là tên gọi chung cho một mhóm bệnh lý ác tính của tế bào, đơn vị cấu thành các cấp độ khác lớn hơn của cơ thể [1] Đặc trưng của ung thư là sự hình thành các khối u ác tính do hoạt động tăng sinh vô hạn của các tế bào ung thư Ở trạnh thái thông thường, các tế bào tồn tại theo một quy luật chung, apoptosic (chu trình chết của tế bào), các tế bào thoát ra ngoài quy luật đó sẽ bất tử và được gọi là tế bào ung thư [69]

Đa số ung thư là bệnh có biểu hiện mãn tính, có quá trình phát sinh và phát triển lâu dài qua từng giai đoạn Trừ một số nhỏ ung thư ở trẻ em có thể do đột biến gen từ lúc bào thai, còn phần lớn các ung thư đều có giai đoạn tiềm tàng lâu dài có thể lên đến hàng chục năm không có dấu hiệu gì trước khi bị phát hiện dưới dạng các khối u Khi này khối u sẽ phát triển nhanh và bắt đầu xuất hiện các triệu chứng của bệnh Triệu chứng đau thường chỉ xuất hiện khi bệnh ở giai đoạn cuối [1] Các tế bào của khối u ác tính có thể xâm lấn đến các bộ phận liền kề và lây lan sang các bộ phận khác của cơ thể thông qua hệ thống bạch huyết hoặc máu, quá trình này được gọi là di căn Di căn là nguyên nhân chính dẫn đến tử vong vì mắc ung thư [4].Ngày nay, trên toàn thế giới đã ghi nhận lại hơn 100 loại ung thư khác nhau [69], các loại ung thư thường được đặt tên theo các cơ quan hoặc mô nơi khối u hình thành Ví dụ, ung thư phổi bắt đầu trong các tế bào của phổi và ung thư não bắt đầu trong các tế bào của não…

1.1.1.2 Tình trạng bệnh ung thư trên thế giới và Việt Nam

Ung thư là nguyên nhân hàng đầu dẫn đến tử vong trên thế giới, với 8,2 triệu trường hợp tử vong trên toàn Thế Giới và khoảng 12 triệu trường hợp mới mắc vào năm 2012 (Globocan) Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế Giới (WHO) các vùng gồm châu Phi, châu Á, Trung và Nam Mỹ chiếm hơn 60% trong tổng số các trường

hợp mắc mới và 70% các trường hợp tử vong do ung thư của Thế Giới Cũng theo dự đoán của WHO, đến năm 2032 sẽ có đến 22 triệu trường hợp mắc ung thư

Vào năm 2012, Việt Nam có khoảng 125 nghìn ca mắc mới và 94,7 nghìn trường hợp tử vong do ung thư Những loại ung thư phổ biến ở Việt Nam là ung thư gan, phổi, vú, dạ dày và mũi họng [68] Ở Việt Nam, tỉ lệ ung thư vòm họng đứng hàng đầu trong các bệnh ung thư vùng đầu mặt cổ và đứng thứ tám trong tất cả các loại ung thư nói chung, tỷ lệ mắc bệnh ung thư vòm họng tính đến năm 2012 là 3,9% trong tất cả các loại ung thư tương đương 4931 ca mắc Trong đó, có đến 2885 trường hợp tử vong chiếm một tỷ lệ khá cao so với các loại ung thư khác Đến năm 2017, số lượng mắc ung thư vòm họng tại Việt Nam được dự đoán tăng lên đến 5,7% thể hiện sự phát triển của bệnh trong cộng đồng dân cư Việt Nam rất cao [68]

1.2 Tổng quan về ung thư vòm họng 1.2.1 Giải phẫu vùng vòm họng

Vùng vòm họng là một khoang hổng ở phần trên của cổ họng nằm phía sau mũi, ngay trên phần mềm của vòm miệng và nằm dưới phần nền của hộp sọ Vùng vòm họng nối liền mũi và mặt sau của khoang miệng, giúp thự hiện chức năng hô hấp và là phần nằm cao nhất trong vùng họng [2]

Hình 1.1 Giải phẫu vòm họng [72]

1.2.2 Khái niệm về ung thư vòm họng

Ung thư biểu mô vòm họng là một dạng phổ biến của nhóm ung thư biểu mô(carcinoma) Ung thư biểu mô vòm họng (Nasopharyngeal carcinoma, NPC) là dạng ung thư có khối u biểu mô bắt nguồn ở lớp tế niêm mạc vùng hầu họng, đây là những tế bào thường trú ở đầu vòi nhĩ trong thành bên vòm họng [39] Một cách chi tiết hơn, khối u ác tính bước đầu xuất hiện trong các hố yên (hố Rosenmuller) ở thành bên vòm họng sau đó lan rộng ra phía trong hoặc ra ngoài vùng vòm họng đến nền sọ hoặc vòm miệng mềm, khoang mũi hoặc thực quản Các khối u có thể di căn đến các hạch bạch huyết cổ và có thể di căn xa hơn đến xương, phổi, gan, thông qua đường máu [7] Ở các giai đoạn đầu, NPC không có dấu hiệu đặc trưng riêng dễ nhầm lẫn với các bệnh viêm, nhiễm khác ở vùng họng [5]

NPC lần đầu được mô tả vào năm 1901, đến năm 1922 thì được chẩn đoán lâm sàng và cho đến năm 1941 mới có một nghiên cứu toàn diện về NPC được công bố [45] Ngày nay tổ chức y tế Thế giới (WHO) chia NPC thành 3 loại: loại I là ung thư biểu mô vảy (Squamous cell carcinoma), loại II là ung thư không có vảy (Non-keratinizing Carcinoma), loại III ung thư không biệt hóa (Undifferrentisted Carcinoma) Trong đó, NPC loại III luôn có tỷ lệ mắc bệnh cao nhất ở tất cả các vùng dân cư khác nhau (75%-97%) [39]

1.2.3 Sự phân bố và sự phân hóa của ung thư vòm họng

Theo thống kê của Globocan năm 2012 có khoảng 86.691 triệu ca mắc ung thư vòm họng, tỷ lệ tử vong là 50.831 triệu ca mỗi năm trên thế giới; theo ước tính đến 2.017 thì tỷ lệ số nhiễm ung thư vòm họng sẽ tăng 161.899 ca trên toàn thế giới (Globocan) Tỷ lệ mắc NPC thấp nhất thế giới là dưới 1/100.000 dân trong 1 năm ở nhóm người da trắng phân bố khu vực Bắc mĩ và châu Âu [7], còn ở vùng Đông Nam Á và miền Nam nước Trung Quốc thì tỷ lệ này rất cao (lần lượt là 17/100.000 người và 50/100.000) [39] Điều đó cho thấy tỉ lệ mắc NPC có sự phân hóa về mặt đại lý và dân tộc khá rõ ràng

Ngoài sự phân hóa về tỷ lệ mắc NPC ở các dân tộc và khu vực địa lý khác nhau, ở mỗi khu vực địa lý và nhóm tuổi khác nhau cũng có một loại ung thư vòm họng đặc trưng cho nhóm bệnh nhân đó (có 3 loại, theo WHO) Hầu hết các trường hợp mắc ung thư vòm họng ở trẻ em và vị thành niên rơi vào loại III và một vài trường hợp là loại II Tại các khu vực như Nam Trung Quốc, ung thư vòm họng loại III chiếm đến hơn 97% trong khi ở các nước phương Tây ung thư vòm họng loại III lại ít phổ biến hơn (xấp xỉ 75%) [39]

Sự phân hóa của ung thư vòm họng còn thể hiện ở giới tính Tại riêng Việt Nam cũng như ở mức độ thế giới, tỷ lệ mắc ung thư vòm họng ở nam luôn cao hơn nữ Năm 2012 tại việt nam tỷ lệ nam mắc ung thư vòm họng là 4,7% torng các loại ung thư cao hơn tỷ lệ này ở nữ giới (3%) Dự đoán đến năm 2017 tỷ lệ mắc NPC ở nam giới sẽ tăng vọt lên 9% tạo khoản cách lớn với tỷ lệ này ở nữ giới (3,3%) [68]

1.2.4 Các nguyên nhân gây ung thư vòm họng

Có ba nguyên nhân chính đã được xác định gây NPC: yếu tố môi trường, yếu tố di truyền và Epstein-Barr virus [39]

Yếu tố môi trường

Các phương pháp chế biến các sản phẩm muối (như cá muối) thường được sử dụng rộng rãi ở Việt Nam và các vùng khác có tỷ lệ mắc ung thư vòm họng cao được cho là có liên quan mật thiết với tỷ lệ mắc bệnh cao tại địa phương Đồng thời, bảo quản thực phẩm đóng hộp sử dụng các hóa chất như nitrosodimethyamine (NDMA), N-nitrospyrrolidene (NPYR) và N-nitrospiperidine (NPIP), các chất này có thể làm tăng khả năng mắc ung thư vòm họng Ngoài ra việc sử dụng thuốc lá, bia, rượu hoặc tiếp xúc với các chất thải độc hại trong cuộc sống (formaldehyde, bụi gỗ, hạt khói…) là các yếu tố thuận lợi dẫn đến việc mắc và phát triển của ung thư vòm họng [7,39]

Yếu tố di truyền

NPC là ung thư có tính chất gia đình rất cao trong các bệnh lý ác tính, điều này cho thấy tính nhạy cảm di truyền đóng vai trò lớn trong sự hình thành ung thư vòm họng [30] Một số sai hỏng trong bộ nhiễm sắc thể của các bệnh nhân UTVH đã được

chứng minh và sự đa hình di truyền trong các gen chuyển hóa chất gây ung thư (metabolize carcinogens genes) đóng một vai trò quan trọng trong sự hình thành, phát triển của UTVH [39] Các biến đổi epigenetic dẫn đến sự thay đổi các chức năng của một số gen có các vai trò quan trọng như điều hòa chu trình tế bào, apoptosis, đường truyền tín hiệu cũng một là nguyên nhân gây nên ung thư vòm họng Những gen ức chế khối u bị methyl hóa mạnh ở vùng promoter sẽ dẫn đến giảm chức năng hay mất biếu hiện hoặc đột biến cũng gây nên bất hoạt-hoạt động của gen Sự methyl hóa bất thường của các gen ức chế khối u dẫn đến giảm chức năng, mất biểu hiện hay gây bất hoạt gen, các đột biến sẽ hình thành UTVH thông qua việc phá vỡ cơ chế điều hòa chu trình tế bào như chu trình chết (apoptosis), tăng sinh tế bào và bám dính tế bào [39]

Epstein-Barr virus

EBV là virus đầu tiên được được xác định là có liên quan với ung thư ở người, bao gồm cả tế bào bạch huyết cũng như tế bào biểu mô [11] Mối quan hệ giữa EBV và ung thư vòm họng được đề cập lần đầu tiên vào năm 1966 khi Old và cộng sự tiến hành thí nghiệm lai tại chỗ (in situ hybridization) và phân tích kháng thể miễn dịch huỳnh quang (anticomplement immunofluorescent), qua đó cho thấy sự hiện diện của DNA virus trong nhân tế bào ung thư vòm họng Những nghiên cứu tiếp theo chứng minh sự liên quan giữa UTVH với hoạt động của các gen EBV tiềm tàng: Epstein-Barr virus nuclear antigen (EBNA), Latent membrane protein-1 (LMP-1), LMP-2 và EBV encoded small RNAs (EBER) trong các tế bào biểu mô UTVH [68] Đây là bằng chứng rõ nét và vững chắc nhất về mối quan hệ giữa EBV và ung thư vòm họng.Không những vậy, sự biểu hiện của kháng nguyên sớm EBV (Early Antigen-EA) được cho là tỷ lệ thuận với lượng tiêu thụ muối và thực phẩm ướp muối Theo Shao và cộng sự 1988, cho rằng sự phát hiện của EBV dương tính trong UTVH còn liên quan đến thói quen ăn uống [68]

Mặt khác, EBV còn được phát hiện tồn tại trong 95% người trưởng thành trên toàn thế giới EBV thường tồn tại ở tạng thái tiềm tan và không gây hại cho người nhiễm Chỉ khi người nhiễm EBV tiếp xúc với các yếu tố gây hại có khả năng tác động đến

hoạt động của chúng như môi trường và lối sống (rượu, bia, thuốc lá, môi trường ô nhiễm…) trong thời gian dài hoặc do các yếu tố di truyền [31], một số gene của EBV sẽ được kích hoạt dẫn đến việc hình thành khối u Từ năm 2006 trở lại đây, đã có nhiều nghiên cứu sử dụng EBV như là một marker nhằm hỗ trợ chẩn đoán sớm bệnh ung thư vòm họng [40, 48, 50]

1.3 Epstein-Barr Virus

1.3.1 Danh pháp và cấu tạo

Epstien-Barr virus (EBV) là một loại Herpesvirus, có danh pháp phân loại là

Herpesvirus type 4, thuộc họ Herpesviridae, phân họ Gammaherpesvirinae, chi Lymphocrytovirus, loài Human Herpes virus 4 (HHV4) [9] Cấu trúc của EBV bao gồm

3 lớp phân biệt bảo vệ cho bộ gen virus bên trong Ở ngoài cùng lớp vỏ, có cấu tạo như màng nhân và lưới nội chất Bên trong lớp vỏ là vùng chứa enzyme giúp chống lại hệ miễn dịch của vật chủ Trong cùng là bộ gen của virus được bao bọc bởi lớp vỏ capsid có hình icosahedral, có 20 mặt đều nhau và trên mỗi tam giác có ít nhất ba protein giống hệt nhau nhưng không đối xứng [2, 41]

Hình 1.2 Cấu tạo của Virus Epstein-Barr [41]

Lớp vỏ capsid có hình thái đối xứng hình khối 20 mặt với 12 đỉnh và 3 trục đồng dạng đối xứng theo kiểu 5 – 3 – 2 Vỏ capsid bao gồm 162 capsome Capsome là những đơn vị cấu trúc trên 5 đỉnh hay 6 đỉnh, các capsome tạo nên một cấu trúc protein

đóng kín để bảo vệ nhân DNA của virus và mang tính kháng nguyên đặc hiệu của EBV (hình 1.2) [50] Capsid được bao bọc bởi một vỏ bao ngoài khác gọi là vỏ ngoài (envelope protein, hình 1.2), vỏ ngoài có bản chất là glycoprotein Khoảng không giữa capsid với vỏ ngoài chứa các protein đệm cấu trúc và các enzyme của virus [50]

Hình 1.3 Bộ gen của EBV dạng episome [31]

Bộ gen EBV là dạng sợi đôi DNA có chiều dài khoảng 172 kb [7] chứa hơn 85 gen Sau khi xâm nhiễm vào tế bào chủ bộ gen của EBV sẽ chuyển sang dạng episome (hình 1.3) Trong hơn 85 gen của EBV những gen tiềm tàng (latent genes) bao gồm

những họ:gen kháng nguyên hạt nhân- Epstein-Barr nuclear antigen (bao gồm 1, 2, 3A, 3B, 3C và LP); gene mã hóa protein màng-Latent membrane protein (bao gồm LMP-1, 2A và 2B); gen mã hóa các RNA nhỏ-Epstein – Barr Virus-encoded small RNA (bao gồm EBER1 và 2) và gen BamHI-A Right-ward Transcripts (BARTs) [65] đóng

EBNA-vai trò quan trọng trong việc xâm nhiễm và nhân lên trong tế bào ung thư

Hình 1.4 Các vị trí vùng Unique, TR và IR của bộ genome EBV [33]

Sự phân bố của các vùng lặp lại tạo ra sự phân bố riêng và cấu trúc đặc trưng cho bộ gen EBV Bộ gen EBV có các vùng lặp lại gồm hai đoạn trình tự lặp lại ở mỗi đầu (Terminal Repeat – TR) và bốn vùng nội lặp lại (Internal Repeat – IR) IR1, IR2, IR3 và IR4 [4, 65] Sáu trình tự lặp lại (TR và IR) chia bộ gen EBV thành năm vùng riêng (Unique): U1, U2, U3, U4, U5 [5, 39] (Hình 1.4)

1.3.2 Một số protein của EBV và chức năng

Bảng 1.1 Các protein của EBV và chức năng [65, 29]

trong chu kì tế bào

EBNA-LP Tương tác với EBNA-2 nhằm bất hoạt p53 và Rb, tương tác với các yếu tố phiên mã trong con đường tín hiệu Notch, phân

phối EBNA-3 trong nhân, góp phần tạo nên sự bất tử của tế bào chủ

LMP-1 Giả dạng tín hiệu của CD40 ligand, tăng mức độ biểu hiện

của bcl-2 và a20, đóng vai trò như một thụ thể hoạt động liên

tục, góp phần tạo nên sự bất của tử tế bào chủ

LMP-2A và B Đưa EBV vào trạng thái tiềm tan, xuất hiện trong hội chứng Hodgkin và NPC

EBER-1 và 2 Tạo phức hợp với L22, kết hợp với PKR và các chức năng chính vẫn chưa được tìm hiểu

CSTs/BARTs Là một protein có khả năng thay đổi tín hiệu Notch và là

protein được biểu hiện rất cao trong bệnh NPC

1.3.3 Cơ chế xâm nhiễm và hoạt động của EBV

Con người là vật chủ tự nhiên chính của EBV [47] Con đường lây truyền chủ yếu của EBV là tuyến nước bọt [18] EBV tồn tại trong cơ thể người với hai hướng riêng biệt là tăng sinh và xâm nhiễm vào các tế bào hoặc tồn tại dạng tiềm tàng một cách âm thầm trong suốt vòng đời vật chủ [69]

Hình 1.5 Các giai đoạn hoạt động của EBV [41]

Sự xâm nhiễm đầu tiên của EBV bắt đầu từ lớp biểu mô hầu họng, chủ yếu là

các tế bào B và tế bào biểu mô [18, 29] EBV xâm nhiễm vào tế bào B bằng cách gắn

glycoprotein g350/220 trên lớp vỏ ngoài của chúng với các thụ thể CR2 (CD21) trên bề mặt các tế bào B, ngoài ra EBV còn xâm nhiễm vào tế bào B thông qua sự xâm nhập vào tế bào biểu mô (có rất ít thụ thể CR2) nhờ glycoprotein gH trên lớp vỏ [24] Sau khi xâm nhiễm vào tế bào B, EBV sẽ tiến hành dịch mã protein EBNA-1 chuyển bộ gen của virus từ mạch thẳng thành dạng episome [7]

Protein EBNA-1 sẽ kích hoạt quá trình dịch mã của một loạt các gen tiềm tan, các sản phẩm của quá trình này sẽ kích thích biểu hiện của các protein khác, ví dụ: protein EBNA-2 kích thích biểu hiện của protein LMP-1 và LMP-2 Các protein EBNA-2, EBNA-3 và LMP-1 có vai trò kéo dài sự tồn tại của tế bào B đã bị xâm nhiễm bằng cách tăng cường điều hòa biểu hiện của những protein tế bào B, trong đó LMP-1 là một dạng tương đồng của thụ thể CD40 và mô phỏng sự tham gia của BRC [27] Bên cạnh việc kích hoạt các protein khác, EBNA-1 còn có khả năng ngăn chặn sự phân hủy bởi proteosome của tế bào [27] Khi protein của virus bị phân cắt bằng

proteasomes tạo thành các đoạn peptide để đưa ra trình diện với tế bào T, hoạt động của EBNA-1 sẽ cho phép các đoạn peptide này tránh khỏi sự hoạt hóa của tế bào T, giúp EBV được bảo về khỏi hệ thống miễn dịch [11]

Sự xâm nhiễm EBV trong tế bào B còn kích thích sự phát triển và biệt hóa tế bào B thành tế bào B nhớ thông qua các phản ứng tại germinal center Các tế bào B nhớ đã bị xâm nhiễm được phát tán vào máu, tiếp tục quá trình xâm nhiễm và tăng lên của EBV [41] Đây chính là một hướng tồn tại của EBV trong cơ thể người

Các dạng tiềm tàng của EBV

EBV còn có khả năng tồn tại trong cơ thể người ở trạng thái tiềm tàng một cách lâu dài và không biểu hiện bệnh vậy nên có thể tìm thấy EBV ở 95% người trưởng thành nhưng tỷ lệ mắc bệnh do EBV lại thấp hơn tỷ lệ nhiễm Tiềm tan là trạng thái khi virus xâm nhiễm vào cơ thể và tồn tại lâu dài mà không gây hại cho con người Sự biểu

hiện của các protein EBV (các sản phẩm của gen EBNAs và LMPs) bị hạn chế trong

suốt quá trình tiềm tan Sự biểu hiện của gen EBV trong các dòng tế bào khác nhau (như các khối uBurkitt’s và EBV-immortalized lymphoblastoid cell lines [LCLs]) đã chứng minh EBV có ba trạng thái tiềm tan trong cơ thể con người [41] Sự xâm nhiễm EBV vào các tế bào B bắt đầu bằng sự phát triển và quá trình tăng sinh của virus, sự khởi phát trên không diễn như vậy ở các tế bào biểu mô Các promoter khác nhau của virus đượcc kích hoạt trong suốt quá trình hình thành các giai đoạn tiềm tan của EBV biểu hiện trong tế bào B và biểu mô, các gen tiềm tan khác nhau được phiên mã ( tiềm tan 3 diễn ra trong các tế bào B và tiềm tan 2 xảy ra ở các tế bào biểu mô) [70] Việc sử dụng các chương trình phiên mã khác nhau do khác biệt về các promoter dẫn đến các dạng tiềm tàng cũng khác nhau: khiến cho bộ gen của EBV nhân lên trong tế bào B nhớ (loại 1), thúc đẩy biệt hóa tế bào B (loại 2) và kích hoạt các tế bào B nguyên phát

Trong trạng thái tiềm tan 1 chỉ có gen EBNA-1 của EBV được biểu hiện EBNA-1 và

LMP1/2A được biểu hiện trong trạng thái tiềm tan 2, LMP-1 và LMP-2 có vai trò kích hoạt tế bào B và quá trình phát triển của nó Trong trạng thái tiềm tan 3, tất cả các sản phẩm gen của EBV đều được biểu hiện [41]

Hình 1.6 Vòng đời EBV khi phát sinh khối u[55]

Hoạt động của EBV trong cơ thể diễn ra theo sơ đồ màu đen EBV thường nhiễm vào các tế bào B nguyên phát trong vòng Waldeyer của amidan, và có thể phân hóa vào trong các tế bào B bằng cách tác động vào khu vực tăng sinh trung tâm mạng bạch huyết sau đó phóng thích ra khỏi chu kỳ tế bào vào máu, không gây bệnh.Tuy nhiên, trong suốt quá trình tồn tại của EBV (theo hình 1.6) có sự tồn tại của một số điểm có thể chặn quá trình này lại Các điểm chặn khác nhau sẽ dẫn đến các bệnh lý khác nhau như burkitt lymphoma, hodgkin và NPC

NPC được cho là phát sinh từ tế bào biểu mô đã bị xâm nhiễm ở dạng tiềm tàng ( dạng 2) Theo hình 1.6, EBV tồn tại dạng tiềm tàng ở các tế bào biểu mô để tái bản và phóng thích ra ngoài Ở các tế bào biểu mô chưa phân hoá nếu quá trình (hình 1.6) bị

chặn lại khiến EBV không được tiếp tục phóng thích ra ngoài và sự phát triển của virus vẫn tiếp tục sẽ đẩy tế bào này đi vào quá trình NPC [55]

1.4 Gen EBNA-1

1.4.1 Sơ lược về gen EBNA-1 và sản phẩm

EBNA-1, có chiều dài khoảng 1,9 kb, là một gen có vai trò quan trọng và biểu

hiện trong tất cả các trạng thái tiềm tan và ly giải của EBV trong tế bào Đây cũng là gene đầu tiên được mã hóa trong quá trình xâm nhiễm của EBV [27, 41]

Bảng 1.2 Các trạng thái tiềm tan và các gene hoạt động trong từng trạng thái [41] Trạng thái Trường hợp bệnh tương ứng Gene biểu hiện

Tiềm tan I Burkitt lymphoma, Gastric carcinoma EBNA-1, EBERs, BARF0

Tiềm tan II NPC, Hodgkin disease, Peripheral T/NK lymphoma

EBNA-1, EBERs, LMP-1, LMP-2, BARF0

Tiềm tan III

AIDS-associated lymphomas,

Post-transplant lymphoproliferative disorders

EBNA-1, EBNA-2, EBNA-3, EBERs, LMP-1, LMP-2, BARF0

Protein EBNA-1 là một phức hợp phosphoprotein và DNA [8, 11].Theo nghiên cứu của Frappier L và cộng sự (2013), EBNA-1 có vai trò quan trọng trong việc giúp EBV giữ trạng thái episome của bộ gene vàchuyển tiếp giữa các trạng thái tiềm tan với nhau [17], do đó protein EBNA-1 luôn hiện diện trong tế bào chủ [40] Ngoài ra EBNA-1 đóng vai trò trong việc sao chép và phân tách trong nguyên phân của EBV episome

Hình 1.7 Chức năng của từng vùng trên protein EBNA-1 [16]

Chú thích: vùng được tô đen là vùng trực tiếp liên quan và thực hiện chức năng còn vùng màu xám thì có hoặc không liên quan đến chức năng được đề cập

Protein EBNA-1 của EBV có trọng lượng khoảng 95 kDa và kích thước là 641 acid amin Kích thước này khác nhau ở từng chủng do sự khác nhau ở đoạn lặp lại gly-ala [16] EBNA-1 là một protein quan trọng giúp duy trì dạng episome của EBV trong tế bào và chuyển tiếp giữa các trạng thái tiềm tan [26] Vai trò của EBNA-1 trong EBV dạng episome là: sao chép, kiểm soát sự phân ly, kích hoạt phiên mã [16]

Hình 1.8 Vị trí tương tác của EBNA-1 trên vùng DS (Dyad Symmetry) và FR (Family of Repeat) Các vị trí được tô màu xanh vị trí gắn EBNA-1 [15]

Vùng đính DNA của protein EBNA-1 tương tác với hai khu vực ở vùng OriP

của promoter Cp [21] bao gồm gia đình lặp lại FR (Family of Repeat) có 20 vị trí gắn, cặp đối xứng tương đồng DS (Dyad Symmetry) có 4 vị trí gắn (hình 1.7); đồng thời còn tương tác với một vùng có hai vị trí gắn nằm sau promoter Qp [8],[9] Các gen này

được điều hòa hoạt động bởi promoter Cp hoặc Wp EBNA-1 được điều hòa bởi promoter Qp thể hiện ở tiềm tan 1 hoặc 2 và EBNA-1 được điều hòa hoạt động bởi

promoter Cp hoặc Wp thể hiện ở tiềm tan 3 ( hình 1.4)

Vào mỗi chu kì của tế bào, EBV episomes sẽ tạo ra một bản sao thông qua việc

protein EBNA-1 sẽ gắn vào bốn vị trí DS thuộc oriP [4, 20, 23] Nhằm hạn chế việc bị

tế bào T phát hiện, EBV episomes tồn tại trong tế bào chỉ hiện diện với số lượng ít và chỉ nhân lên một lần trong mỗi một chu kì tế bào Do đó EBV duy trì lượng bản sao một cách ổn định trong sự phân chia của tế bào nhờ vào cơ chế để kiểm soát sự phân ly

trong nguyên phân [27] Ngoài ra EBNA-1 còn có vai trò kích hoạt các gen tiềm tan khác của EBV như LMP-1, EBNA-2,…; chức năng này được thực hiện thông qua sự kết hợp giữa EBNA-1 và vùng FS của oriP [ 30]

1.4.2 Ảnh hưởng của protein EBNA-1 lên sự biến đổi của tế bào chủ

EBNA-1 thể hiện vai trò lớn trong việc làm bất tử và sự biến đổi các tế bào chủ Vai trò đó đã được chứng minh bằng thực nghiệm bởi Wilson và đồng sự [61] thông qua chuột bị biến đổi gene; kết quả cho thấy là khi EBNA-1 được biểu hiện càng mạnh thì số lượn tế bào B bị rơi vào trạng thái bất tử càng nhiều

Ngoài ra EBNA-1 còn tác động lên tế bào chủ thông qua các đường truyền tín hiệu theo hai hướng: khích thích hoặc bất hoạt

Hình 1.9 Các tác động của protein EBNA-1 lên tế bào chủ thông qua các đường truyền tín hiệu [15] (Dấu mũi tên thể hiện sự tăng biểu hiện protein tương ứng, dấu mũi tên

bằng thể hiện sự ức chế protein tương ứng)

Khả năng ức chế:

EBNA-1 thể hiện khả năng ức chế lên SMAD2 (Sma and Mad Related Family) bằng gây rối loạn sự sản sinh SMAD2, thông qua đó quả giảm số lượng của protein SMAD2 từ đó giảm khả năng tạo thành phức hợp SMAD với SMAD4 thông qua đó bất hoạt tín hiệu TGF-β1[15] Mà TGF-β1(ransforming growth factor-β 1) đóng vai trò lớn trong miễn dịch, điều khiển tăng sinh của tế bào và phản ứng viêm [55fef] Vậy nên việc EBNA-1 tác động lên SMAD2 đã bất hoạt và mất đi chức năng của TGF-β1, torng miễn dịch và điều khiển sự tăng sinh tế bào

Vào năm 2010, Valentine và cộng sự đã chứng minh rằng EBNA-1 còn gây ức chế lên con đường NF-κB (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells) NF-κB có chức năng chính là kiểm soát phiên mã DNA đồng thời có vai trò reong các quá trình viêm, tăng sinh, apoptosis EBNA-1 thông qua việc gây ức chế sự phosphoryl hóa IKKα/β sẽ dẫn đến giảm sự phosphoryl hóa và sự chuyển vị hạt nhân của p65 NF-κB, sự tác động lên NF-κB của EBNA-1 là gián tiếp Chính sự ức chế lên con đường NF-κB góp phần vào hình thành NPC [15, 57]

P53 là một gen ức chế khối u nằm trên cánh ngắn nhiễm sắc thể số 17, protein

p53 đóng vai trò liên kết DNA, điều hòa sao mã và kiểm soát quá trình đi vào pha S trong chu kỳ tế bào Phân tử p53 đóng vai trò trung tâm trong ức chế khối u, nếu thiếu phân tử p53 thì tế bào không còn phải trải qua (apoptosis) và các tế bào này có thể mất kiểm soát trong tăng sinh và tham gia tạo khối u Đồng thời, EBNA-1 có khả năng bảo vệ các tế bào đang bị gây nhiễm khỏi việc đi vào chu trình chết tự nhiên (apoptosis) bằng cách giảm khả năng đáp ứng của p53 lên những DNA bị tổn thương EBNA-1 sẽ cạnh tranh gắn lên N-terminal domain của UPS7 (ubiquitin-specific protease) với p53 và Mdm2 (một E3 ubiquitin ligase cho p53) từ đó làm giảm sự ổn định của p53 và Mdm2 [12,15] Vậy nên, sự tác động lên p53 của EBNA-1 làm ảnh hưởng trực tiếp đến khá năng ức chế khối u đã đẩy những tế bào nhiễm EBV dễ trở thành tế bào ung thư

Ngoài ra EBNA-1 còn có khả năng phân hủy protein Promyelocytic leukemia (PML) Protein PML này đóng vai trò trong các quá trình kích hoạt p53, apoptosis và sửa sai DNA trong chu trình tế bào[15] Kết quả của sự thiếu hụt PML là giảm khả

năng sửa sai DNA, bất hoạt p53 và apoptosis do đó các tế bào vẫn tồn tại với các DNA sai hỏng dẫn đến sự hình thành khối u

Khả năng tăng biểu hiện:

STAT1 (Signal transducers and activators of transcription) đóng vai điều chỉnh các trạng thái của tế bào chết Tùy thuộc và loại kích thích và loại tế bào, STAT1 sẽ điều chỉnh lượng tế bào chết và các con đường apoptotic, non-apoptotic Nghiên cứu chỉ ra rằng sự rối loạn STAT1 có liện hệ với các sự phát triển ung thư Và EBNA-1 thể hiện khả năng gia tăng STAT1 gây ảnh hưởng đến chức năng vốn có Giúp tế bào nhiễm EBV có thể nằm ngoài một số quy trình của tế bào bình thường [15, 38]

Surviving là một protein AIP (Inhibitor of Apoptosis), hai chức năng chính của surviving trong tế bào là là bất hoạt apoptpsic và đều tiết chu kỳ của tế bào Các hoạt động của surviving thường thể hiện ở mức cao đối với các tế bào da, biểu mô, SCC EBNA-1 tăng khả năng biểu hiện bằng cách kết hợp với promoter survivin thông qua Sp1 qua đó tăng cường sự phiên mã của surviving Kể từ khi surviving ức chế apoptosic ở tế bào (đặc biệt là tế bào biểu mô) EBNA-1 đã góp phần vào quá trình tạo khối u ác tính ở những tế bào nhiễm EBV [16], [17]

Trong quá trình hô hấp, tế bào phải chịu stress vì nhiều lý do khác nhau trong đó có áp lực về oxi hóa (reactive oxygen, ROS) Những thay đổi trong oxi hóa mà ROS mang lại cho tế bào tạo ra các biến đổi trên những phân tử lớn (lipid, DNA, protein) Những biến đổi mà ROS gây ra có thể được tích lũy và đến một mức độ nào đó tế bào sẽ bị mất khả năng tự hồi phục hoặc còn thể thoát ra khỏi apoptosic ROS gây ra các thiệt hại liên quan đến sự thoái hóa nghiêm trọng ở người ví dụ như ALS (xơ cứng teo cơ bên), bệnh Alzheimer, và ung thư Sự xâm nhiễm EBV và việc tăng biểu hiện của ROS trong tế bào được chứng minh là có liên quan với nhau Chính EBNA-1 của EBV là tác nhân có thể của mối liên hệ trên, ví dụ là hoạt động của EBNA-1 trong tế bào B đã tăng tốc độ oxi hóa (ROS) khiến DNA bị hư hại EBNA-1 tăng hoạt áp lực ROS thông qua việc tăng biểu hiện của các NOX2 NADPH oxidase, vì NOX2 có khả năng cảm ứng làm tăng áp lực về oxi hóa Ngoài ra, EBNA-1 cũng có thể giảm áp lực ROS

thông qua các chất chống oxi hóa superoxide dismutase 1 (SOD1) và peroxiredoxin 1 (Prx1), các tương tác xảy ra ở mức độ protein Mức độ tương tác giữa ROS và NOX2 sẽ tăng lên đáng kể trong NPC do hoạt động của EBNA-1 Vậy nên EBNA-1 đã góp phần thúc đẩy phát triển NPC cũng như các ung thư khác bằng cách tăng áp lực oxi hóa, gia tăng các sai hỏng ở DNA [15, 27]

1.4.3 Vai trò của EBV, EBNA-1 và sản phẩm phiên mã trong diễn tiến ung thư

vòm họng

EBV có vai trò trong nhiều bệnh lý ác tính khác nhau với điển hình là NPC Điều này được chứng minh bằng cách đánh giá sự có mặt của EBV trong khối u và những tế bào lành xung quanh, kết quả thu nhận được là chỉ có khối u dương tính với EBV còn các tế bào xung quanh thì cho kết quả âm tính [47] Trong các tế bào ung thư luôn luôn có sự hiện diện của protein EBNA-1 và thỉnh thoảng xuất hiện protein LMP- 1 [13] Vào năm 2007, Kaul và các cộng sự [27] đã chứng minh rằng sự có mặt của protein EBNA-1 trên dòng tế bào ung thư vú sẽ làm gia tăng khả năng mắc bệnh ung thư của những con chuột mang dòng tế bào này Ngoài ra còn có nhiều nghiên cứu chứng minh sự tác động của EBNA-1 lên quá trình di căn của NPC [30, 53]

1.5 Các phương hướng chẩn đoán NPC

1.5.1 Các phương pháp và xu hướng trong chẩn đoán NPC

Hiện nay có rất nhiều phương pháp phát hiện và chẩn đoán sớm ung thư vòm họng đã được nghiên cứu trên thế giới Các phương pháp chẩn đoán chính hiện nay là chẩn đoán huyết thanh, xét nghiệm mô sinh thiết và xác định loại virus Nhược điểm lớn của các phương pháp này là khi phát hiện thì khối u vòm họng đã phát triển đến một mức độ nhất định vì việc chẩn đoán hoàn toàn dựa trên các mẫu xâm lấn Vì vậy việc xây dựng một quy trình phát hiện bệnh trên các mẫu không xâm lấn sẽ tạo ra lợi ích lớn trong điều trị bệnh và tăng tỉ lệ sống sót cho bệnh nhân Phương pháp không xâm lấn tiêu biểu là phát hiện kháng nguyên virus EBV dựa trên kháng thể, phát hiện sự hiện

diện của virus qua các đặc trưng, gen EBNA-1 và sản phẩm, bằng phương pháp PCR,

hoặc định lượng bằng Realtime PCR [18, 51]

1.5.2 Phương pháp không xâm lấn

Phương pháp không xâm lấn được xem là thuận lợi nhất để phát hiện sớm dấu hiệu của các khối u Các thuận lợi là dễ dàng lấy mẫu (thường sử dụng mẫu dịch phết), chi phí rẻ…Từ các nghiên cứu trước đã cho thấy từ mẫu dịch phết đều tìm thấy DNA hoặc RNA virus Sự hiện diện của DNA hoặc RNA hay đồng thời cả hai sẽ là dấu chứng sinh học hết sức tiềm năng để chẩn đoán ung thư vòm họng dựa trên mẫu không xâm lấn

Một số phương pháp không xâm lấn được phát triển hiện nay là: phương pháp PCR (Polymerase chain reaction) được thực hiện trên mẫu dịch phết, nước tiểu; Phương pháp Real-Time PCR và phương pháp MMSP (Multiplex Methylation Specific PCR) PCR là phương pháp nhanh chóng, đặc hiệu với độ nhạy cao, PCR còn được ghi nhận là phương pháp có khả năng phát hiện các trường hợp nhiễm trùng phối hợp một cách dễ dàng [37] Phản ứng PCR có thể tạo ra hơn một triệu bản sao từ một DNA cụ thể hoặc trình tự RNA trong một chuỗi phản ứng nhiều chu kì lặp lại gồm 3 giai đoạn (hình): giai đoạn biến tính DNA (tách chuỗi DNA mạch đôi thành mạch đơn); Giai đoạn bắt cặp của mồi với trình tự theo (nguyên tắc bổ sung); Giai đoạn kéo dài (tổng hợp chuỗi DNA mới giống chuỗi DNA gốc) Thành phần trong mỗi phản ứng PCR bao gồm trình tự DNA gốc , một cặp mồi, các nucleotide tự do và polymerase [34] PCR cũng là phương pháp phổ biến hiện nay để phát hiện sự xâm nhiễm của EBV

EBNA-1 đã được chứng minh là gen duy nhất xuất hiện trong tất cả các trạng thái tiềm tan [41] Mặt khác, EBNA-1 là gen đầu tiên được EBV phiên mã Do đó gen EBNA-1 và sản phẩm đã được sử dụng rộng rãi để phát hiện EBV và chẩn đoán sớm NPC Việc phát hiện EBNA-1 dựa vào phương pháp PCR hoặc định lượng bằng Real-

Time PCR dựa trên mẫu không xâm lấn cho khả năng phát hiện sớm ung thư vòng

họng, tiên lương tình trạng bệnh , EBNA-1 còn giúp phát hiện sự hiện diện của EBV

nhằm phân biệt rõ ung thư vòm họng với các loại ung thư khác ở vùng đầu – cổ [41,53]

Hình 1.10 Phản ứng PCR [34]

2 PHẦN II: VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP

2.1 Vật liệu

2.1.1 Các phần mềm và trang web đã sử dụng

Trang web http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed: khai thác dữ liệu

Trang web www.ncbi.nlm.nih.gov: khai thác dữ liệu, lấy trình tự gen khảo sát Phần mềm trực tuyến IDT: www.idtdna.com: xác định các thông số của mồi Annhyb 4.946 (Olivier Friard, 2012): Kiểm tra vị trí bắt cặp của mồi và sản phẩm bắt cặp

Clustalw2.1: sắp gióng cột các trình tự 2.1.2 Các hoá chất và thiết bị

Thiết bị:

Máy vortex (Vortex ZX3, Velp )

Máy ly tâm lạnh (Hettich Universal 320R, Đức) Bộ điện di DNA (BioRad)

Tủ lạnh (LG) Tủ đông (Sanyo)

Tủ ủ nhiệt (Multitemp III) Cân kỹ thuật (Satorious, Đức) Tủ hút khí độc (Ascent Max)

Máy quang phổ kế (Scanning UV/VIS, Smart Spec, BioRad) Máy luân nhiệt (My-Cycler Thermal, BioRad)

Máy chụp ảnh gel (Gel Doc XR System, BioRad) Lò vi sóng (Sharp)

Hoá chất:

Hóa chất sử dụng trong quá trình tách chiết DNA gồm: Dung dịch đệm PSB 1X

Dung dịch ly giải tế bào: Lysis buffer: Tris-HCl pH 1M, EDTA 0,5M; 2% SDS 10%; 0.1M NaCl 0,5M (Đã hấp); ddH2O (đã hấp), 100 µg/ml proteinase K 1mg/ml

Dung loại protein: Phenol/chloroform/isoamylalcohol (25:24:1 v/v/v) Dung dịch tủa và rửa: NaOAc 3M Ethanol 95%-99% Ethanol 70% Dung dịch bảo quản DNA: TE buffer: Tris 1M pH 8,0; EDTA 0,5 M Hóa chất dùng để PCR: Mastermix (2X), ddH2O (đã hấp)

Hóa chất điện di:

Ethidium bromide: 1,7 µl 2.2 Phương pháp

2.2.1 Thu thập dữ liệu

Các thông tin, dữ liệu thu thập và chọn lọc từ cơ sở dữ liệu NCBI (National Center for Biotechnology information) và pubmed thông qua các thừ khóa: nasopharyngeal carcinoma, virology and molecular biology of Epstein – Barr virus,

EBNA-1, early diagnosis, non – invasive method…Các bài báo được lựa chọn từ các

tạp chí có độ tin cậy và uy tín cao như: natural, journal of virology, như Clinical Cancer Research…và những bài báo nghiên cứu thực nghiệm có sử dụng phương pháp không xâm lấn

2.2.2 Thu thập các trình tự và mồi tham khảo

Tiến hành thu thập các trình tự gen EBNA-1 và bộ gen EBV trong cơ sở dữ liệu

Genbank trong NCBI Trong đó, sưu tầm cơ sở dữ liệu ở nhìêu nghiên cứu khác nhau với các típ khác nhau có liên quan đến bệnh.Các mồi tham khảo được chọn lọc từ các nghiên cứu đã công bố trên các tạp chí

2.2.3 Đánh giá mồi

Từ cặp mồi tham khảo được, dùng phần mềm Annhyb kiểm tra lại khả năng bắt

cặp bổ sung của mồi trên gen EBNA-1 và bộ gen EBV, xác định vị trí mà mồi bắt cặp

và sản phẩm bắt cặp

Kiểm tra và phân tích các thông số của mồi bằng Phần mềm trực tuyến IDT: www.idtdna.com Các thông số của mồi bao gồm độ dài mồi, tỷ lệ GC, nhiệt độ nóng chảy, khả năng tạo cấu trúc kẹp tóc (Hairpinloop), khả năng các mồi bắt cặp với nhau (Homodimer, Heterodimer)

Kiểm tra độ đặc hiệu của mồi bằng phần mềm trực tuyến BLAST

Đối với mồi β-actin ngoài kiểm tra các thông số vật lý, độ đặc hiệ củamồi tương tự cách kháo sát của mồi EBNA-1cần khảo sát thêm độ tương thích của 2 cặp mồi

quathông số Homodimer, Heterodimer

2.2.4 Khảo sát sự hiện hiện của gen EBNA1

Sử dụng nguồn mẫu thu từ bệnh viện Chợ Rẫy đã được xét nghiệm là mẫu bệnh hoặc lành bằng phương pháp hoá mô miễn dịch và bảo quả trong PBS

Khảo sát thực nghiệm được tiến hành theo các bước sau: tách chiết DNA bộ gen từ mẫu mô bệnh ung thư vòm họng, xác định độ tinh sạch và nồng độ DNA bằng cách đo quang phổ, PCR, đọc kết quả điện di

Hình 2.1 Sơ đồ phát hiện EBNA-1 của EBV

Phương pháp tách chiết phenol-chloroform

Nguyên tắc: Đề tài sử dụng phương pháp phenol-chloroform để tách chiết DNA Trong đó, màng tế bào và màng nhân được biến tính bằng chất tẩy mạnh Sau đó protein sẽ được biến tính bằng phenol-chloroform và bị loại bỏ DNA bộ gen sẽ được tủa với ethanol lạnh

Quy trình tách chiết DNA cho mẫu ung thư vòm họng:

Bảng 2.1 Các bước tách chiết DNA Các bước tiến hành

Bước 1 Mẫu mô/ dịch phết được cắt nhỏ và cho vào một eppendorf (1,5 ml), cho 1 ml dung dịch đệm PBS, vortex nhẹ và ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút, thực hiện bước này tối thiểu hai lần

Bước 2 Tiến hành phá vỡ màng tế bào với 700 µl lysis buffer (NaCl, EDTA, Tris HCl, SDS, Proteinase K và ddH2O), ủ qua đêm ở nhiệt độ 56oC Bước 3 Loại bỏ protien: Bổ sung 700 µl phenol:chloroform:isoamyl alcohol

(25:24:1) rồi vortex nhẹ, ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút và thu phần dịch nổi bên trên, tương tự như vậy lặp lại bước này hai hoặc ba lần

Bước 4 Bổ sung 1V chloroform, đảo trộn nhẹ và ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút thu phần dịch nổi

Bước 5 Tủa DNA:bổ sung 0.2V NH4OAC 5M ( hoặc NaOAc 3M) và 2,5V Ethanol 95%-99%, ủ qua đêm ở nhiệt độ -20oC Thực hiên ly tâm 13.000 vòng/phút trong 20 phút và loại bỏ phần dịch nổi

Bước 6 Rửa mẫu bằng 500 ml Ethanol 70% để loại bỏ các ion còn lại sau quá trình tủa DNA và ly tâm 13.000 vòng/15 phút, phơi DNA qua đêm Bước 7 Bảo quản DNA: bổ sung 50 µl TE và bảo quản ở -20oC

Đánh giá DNA tách chiết bằng Phương pháp đo quang phổ:

Nguyên tắc: hàm lượng DNA có thể xác định được nhờ sự hấp thu mạnh ánh sáng ở bước sóng 260 nm Giá trị mật độ quang OD260 (Optical Density 260 nm) của các mẫu DNA cho phép xác định nồng độ DNA trong dung dịch (với OD260= 1OD = 50 μg/ml DNA sợi đôi) Độ tinh sạch của DNA được đánh giá qua tỷ lệ OD260/OD280 nằm trong khoảng giá trị từ 1,6-2,0 Song song đó, chỉ số OD230 cũng được tiến hành đo chung với chỉ số OD260 và OD280 Chỉ số OD230cho thấy khả năng nhiễm tạp chất của mẫu chẳng hạn bị nhiễm carbohydrate hoặc phenol và tỷ lệ OD260/230 đạt trong khoảng giá trị là từ 2,0-2,2 thí mẫu tách chiết sẽ tinh sạch

Các bước tiến hành: DNA sau khi tách chiết được pha loãng 50 lần bằng TE Sau đó chuyển tất cả dung dịch vào cuvette và đo nồng độ DNA ở các bước sóng 230 nm, 260 nm và 280 nm Độ tinh sạch của dung dịch được xác định bằng tỷ lệ OD260/OD280 [74]

Kỹ thuật PCR:

Tiến hành đặt phản ứng multiplex PCR với bộ mồi dùng để phát hiện đồng thời EBNA-1và β-actin.Phản ứng PCR được tiến hành trong thể tích 15 µl với thành phần:

Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR Thành phần Thể tích (µl)

β-actin-F primer 0,25 β-actin-r primer 0,25