khảo sát sự hiện diện của một số gen liên quan đến con đường sinh tổng hợp lovastatin trên mẫu nấm thuộc chi pleurotus

Lao Đức Thuận Học viên thực hiện: Phạm Thị Phương Trinh Lớp: DH18YD01 Ngày sinh: 10/07/2000 Nơi sinh: Đồng Nai Tên đề tài: KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA MỘT SỐ GEN LIÊN QUAN ĐẾN CON ĐƯỜNG SI

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - ∞0∞ -

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - ∞0∞ -

Giảng viên hướng dẫn: TS LAO ĐỨC THUẬN TP HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨAVIỆT NAM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

GIẤY XÁC NHẬN

Tôi tên là: Phạm Thị Phương Trinh

Tôi đồng ý cung cấp toàn văn thông tin khóa luận tốt nghiệp hợp lệ về bản quyền cho Thư viện Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh Thư viện Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh sẽ kết nối toàn văn thông tin khóa luận tốt nghiệp vào hệ thống thông tin khoa học của Sở Khoa học và Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh

(Ghi rõ họ và tên)

Phạm Thị Phương Trinh

Ý KIẾN CHO PHÉP BẢO VỆ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỦA GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN

Giảng viên hướng dẫn: TS Lao Đức Thuận

Học viên thực hiện: Phạm Thị Phương Trinh Lớp: DH18YD01 Ngày sinh: 10/07/2000 Nơi sinh: Đồng Nai

Tên đề tài: KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA MỘT SỐ GEN LIÊN QUAN ĐẾN CON

ĐƯỜNG SINH TỔNG HỢP LOVASTATIN TRÊN MẪU NẤM THUỘC CHI

Ý kiến của giáo viên hướng dẫn về việc cho phép sinh viên Phạm Thị Phương Trinh

được bảo vệ khóa luận trước Hội đồng:

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, em xin gửi lời tri ân chân thành đến thầy hướng dẫn TS Lao Đức Thuận Em cảm ơn thầy đã luôn quan tâm đồng hành, thấu cảm và sẵn sàng giúp đỡ khi em gặp khó khăn, đồng thời truyền đạt nhiều kiến thức cũng như kinh nghiệm quý báu giúp em thêm hoàn thiện bản thân và trưởng thành hơn Thầy luôn theo sát và kịp thời

góp ý giúp em hoàn thành tốt khóa luận: “Khảo sát sự hiện diện của một số gen liên

quan đến con đường sinh tổng hợp lovastatin trên mẫu nấm thuộc chi Pleurotus”

Bên cạnh đó, em cũng không quên gửi lời cảm ơn Thầy/Cô trong khoa Công nghệ sinh học và nhà trường đã giúp đỡ em, tạo điều kiện cho em có cơ hội được học tập, trải nghiệm ở các cuộc thi nghiên cứu khoa học Qua đó, em có thể tích lũy thêm nhiều kiến thức mới, tầm nhìn mới, cũng như nhìn nhận được những thiếu sót nơi bản thân em

Em cảm ơn anh Nguyễn Thanh Tùng đã nhiệt tình hướng dẫn lúc em mới vào phòng thí nghiệm và còn nhiều bỡ ngỡ Em cảm ơn anh Phan Đặng Hoàng Nam đã nhiệt tình chỉ bảo, góp ý khi em gặp khó khăn Em cảm ơn chị Thiều Hồng Huệ và các bạn, cùng những người em đã góp ý, hỗ trợ, động viên và hỏi thăm em Cảm ơn bạn Bùi Thị Ngọc Lệ đã hỗ trợ tôi thu nhận mẫu nấm nghiên cứu

Con xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến ba mẹ vì luôn ủng hộ, động viên, nâng đỡ con và là hậu phương tinh thần vững chắc cho con trong những lúc khó khăn nhất Con cảm ơn ba mẹ đã luôn bên cạnh và hỗ trợ con về mọi mặt của cuộc sống Ba mẹ là người thầy đầu tiên của con, dạy con bài học làm người, dạy con biết sống chan hòa yêu thương, kiên trì nỗ lực, chăm chỉ và tử tế Ba mẹ luôn là tấm gương tốt cho con về mọi mặt để con không ngừng phấn đấu mà nên hoàn thiện hơn mỗi ngày

Một lần nữa, với tất cả tình cảm cùng thiện chí chân thành, con xin cảm ơn ba mẹ, em cảm ơn thầy, anh, chị và các bạn, các em Sau cùng, em rất mong nhận được ý kiến đóng góp của Thầy/Cô và mọi người để đề tài của em được hoàn thiện hơn Em xin trân trọng cảm ơn

1.1 Vài nét lịch sử về nấm 5

1.2 Tổng quan chi nấm Pleurotus 6

1.2.1 Đặc điểm chung của chi Pleurotus 6

1.2.2 Lịch sử nghiên cứu chi nấm Pleurotus 8

1.2.3 Khóa phân loại của chi nấm Pleurotus 9

1.3 Thành phần dinh dưỡng chi Pleurotus 9

1.3.1 Thành phần dinh dưỡng chung 9

2.3 Lovastatin diketide synthase (LovF) 20

PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 22

1.1 Các công cụ khai thác dữ liệu 22

1.2 Mẫu nấm 23

1.3 Dụng cụ, thiết bị và hóa chất 23

1.3.1 Dụng cụ 23

1.3.2 Thiết bị 23

1.3.3 Hóa chất của quá trình tách chiết DNA 23

1.3.4 Hóa chất cho quá trình PCR và điện di 24

1.4 Quy trình nghiên cứu 24

2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 Phương pháp khai thác cơ sở dữ liệu 25

2.2 Phương pháp đánh giá mồi 25

2.2.1 Đánh giá thông số vật lý mồi 25

2.2.2 Kiểm tra độ đặc hiệu của mồi 25

2.3.6 So sánh với cơ sở dữ liệu Genbank 30

PHẦN III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

1 KẾT QUẢ KHẢO SÁT IN SILICO CÁC GEN LIÊN QUAN ĐẾN CON ĐƯỜNG

SINH TỔNG HỢP LOVASTATIN 32

1.1 Kết quả kiểm tra thông số vật lí của các cặp mồi bằng IDT analyzer 32

1.2 Kết quả kiểm tra cặp mồi Transesterase (LovD) trên phần mềm Annhyb và Blast 34

1.3 Kết quả kiểm tra cặp mồi Lovastatin diketide synthase (LovF) trên phần mềm Annhyb và Blast 36

2 KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM 38

2.1 Kết quả tách chiết DNA 38

2.2 Kết quả phản ứng PCR khuếch đại gen mục tiêu 39

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Hình ảnh Pleurotus ostreatus ngoài tự nhiên 8

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của Lovastatin 11

Hình 1.3 Sơ đồ con đường chuyển hóa Lovastatin trên Aspergillus terreus 18

Hình 2.1 Hình ảnh mẫu nấm bào ngư T (a) và X (b) dùng trong nghiên cứu……… 23

Hình 2.2 Quy trình thực hiện nghiên cứu 24

Hình 2.3 Chu trình nhiệt độ chung của PCR 29

Hình 3.1 Kết quả kiểm tra bằng phần mềm Annhyb của cặp mồi LovD-F/R………34

Hình 3.2 Kết quả kiểm tra bằng phần mềm Blast của cặp mồi LovD-F/R 35

Hình 3.3 Kết quả kiểm tra bằng phần mềm Annhyb của cặp mồi LovF-F/R 36

Hình 3.4 Kết quả kiểm tra bằng phần mềm Blast của cặp mồi LovF-F/R 37

Hình 3.5 Kết quả điện di sản phẩm PCR của gen LovD 39

Hình 3.6 Kết quả điện di sản phẩm PCR của gen LovF 40

Hình 3.7 Kết quả giải trình tự gen LovD của mẫu X 41

Hình 3.8 Kết quả Blast kết quả giải trình tự gen LovD trên mẫu X 41

Hình 3.9 Kết quả giải trình tự gen LovF của mẫu X 43

Hình 3.10 Kết quả Blast kết quả giải trình tự gen LovF trên mẫu X 43

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 2.1 Lượng hóa chất cần để pha dung dịch PBS 1X 26

Bảng 2.2 Thông tin về mồi sử dụng trong thực nghiệm 28

Bảng 2.3 Thành phần của một phản ứng PCR 28

Bảng 3.1 Các thông số vật lí của các cặp mồi 32

Bảng 3.2 Giá trị đo OD của các mẫu nấm thuộc chi Pleurotus 38

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

ĐẶT VẤN ĐỀ

Pleurotus (Jacq Fr.) P Kumm là một chi nấm thuộc họ Pleurotaceae, bộ Agaricales, lớp Agaricomycetes, ngành Eumycota (Nấm thật) Các loài thuộc chi Pleurotus có tên gọi chung là Nấm Bào ngư hay nấm Sò (Oyster mushroom) – Hirakate,

Houbikate hay Houbiko (theo tiếng Nhật) Nấm Bào ngư là 1 trong 5 nhóm nấm được trồng và cung cấp hàng đầu thế giới (Royse et al 2017; Tsiantas et al., 2021), nổi tiếng thế giới với hương vị thơm ngon và thành phần dinh dưỡng cao (giàu chất xơ, protein, carbohydrate, vitamin, khoáng chất) (Patil et al., 2010; Khan et al., 2012; Feene, 2014)

Ở nước ta, có một số loài nấm được ghi nhận thuộc chi Pleurotus như: Pleurotus

blaoensis Thám sp nov đã được tác giả Lê Xuân Thám phát hiện vào năm 1999 và

chứng minh đây là loài mới thuộc phân chi Coremiopleurotus Hillber (1982) thu thập ở tỉnh Lâm Đồng Pleurotus pulmonarius (Fr.) Quel phân bố ở Tây Nguyên được tác giả

Lê Xuân Thẩm phát hiện vào năm 1998,… Bên cạnh chức năng là nguồn thực phẩm giá

trị, một số loài Pleurotus còn có tiềm năng về y dược cao trong việc tổng hợp nên nhiều

hợp chất tự nhiên mang hoạt tính sinh học có tác dụng kháng virus, kháng ung thư, kháng nấm, kháng khuẩn, giảm cholesterol và điều hòa miễn dịch (Cohen et al., 2002; Chu et al., 2005)

Lovastatin còn được gọi là mevinolin hay monacolin K, được thu nhận đầu tiên

từ Aspergillus terreus bởi Endo và cộng sự năm 1978 và từ Monascus ruber bởi Alberts

và cộng sự vào năm 1979 Đây là một chất có tác dụng ức chế cạnh tranh với 3-methylglutaryl-coenzyme A reductase - enzyme xúc tác quá trình khử HMG-CoA để hình thành nên mevalonate trong quá trình tổng hợp cholesterol (Singer et al., 1988) Lovastatin không những có chức năng điều hòa nồng độ cholesterol trong máu, phòng ngừa bệnh Parkinson, Alzheimer và xơ vữa động mạch mà chất này còn có tác dụng nổi bật về kháng viêm và tăng cường tái tạo xương cho cơ thể (Upendra et al., 2013); kháng ung thư, kháng khuẩn (Klawitter et al., 2010; Zhou et al., 2018) Lovastatin đã được tìm

3-hydroxy-thấy trong một số loài Pleurotus gồm P eryngii (Lee et al., 2006), P ostreatus Cimerman, 1995), P cornucopiae (Krasnopolskaya et al., 1998),

(Gunde-Có nhiều bài báo nghiên cứu trước đó về con đường chuyển hóa Lovastatin trên

nấm Aspergillus terreus đã chứng minh rằng Lovastatin nonketide synthase, Lovastatin

diketide synthase là những enzyme đóng một vai trò quan trọng trong việc tổng hợp

Lovastatin và được mã hóa lần lượt bởi gen LovB, LovF Lovastatin nonketide synthase là một enzyme được mã hóa từ gen LovB, enzyme này tương tác với enroylreductase do gen LovC mã hóa có vai trò xúc tác tổng hợp nên Dihydromonacolin L từ acetate và

methionine (Kennedy et al., 1999; Ma et al., 2009; Vijai and Maria, 2014) Lovastatin

diketide synthase là một enzyme do gen LovF mã hóa tham gia tổng hợp nên 2

metylbutyryl-CoA từ 2 đơn vị acetyl-CoA và 1 đơn vị malonyl-CoA Enzyme này còn giúp chuyển đổi 2-methybutyryl –CoA thành alpha-methyl-beta-ketobutyryt (hay còn được gọi là monacolin J) (Hutchinson et al., 2000)

Lovastatin hiện diện trong nhiều loài nấm thuộc các khóa phân loại khác nhau như:

Ascomycetes, Gymnoascus, Aspergillus, Monascus, Doratomyces, Penicillium, Hypomyces, Trichderma, Paecilomyces, Phoma, hay basidiomycetes như Pleurotus, Omphalotus, Lenzites, Trametes, Phanerochaete (Pandey et al., 2019; Javed et al.,

2014) Tuy nhiên, đến nay chưa có công bố khoa học nào nghiên cứu về con đường chuyển hóa Lovastatin ở các loài nấm ăn thuộc chi Pleutorus Cùng với đó, giá trị của các loài nấm chi Pleurotus đã được làm rõ thông qua rất nhiều chứng cứ về khoa học

Trong số những bằng chứng đó, đặc biệt chúng tôi xem trọng và đánh giá cao đến khả

trọng nhằm chọn lọc được chủng giống tốt Và việc nghiên cứu các gen tham gia quá trình tổng hợp Lovastatin chính là cơ sở khoa học quan trọng để hiểu được sự chuyển hóa của chất quý này Vì thế đề tài “KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA MỘT SỐ GEN LIÊN QUAN ĐẾN CON ĐƯỜNG SINH TỔNG HỢP LOVASTATIN TRÊN MẪU

NẤM THUỘC CHI PLEUROTUS” được đề xuất dựa trên mục tiêu khảo sát sự hiện

diện của gen liên quan tham gia con đường sinh tổng hợp Lovastatin nhằm hỗ trợ giúp sàng lọc chủng nấm có tiềm năng cao trong y học tại Việt Nam.

PHẦN I: TỔNG QUAN

1 TỔNG QUAN NẤM

1.1 Vài nét lịch sử về nấm

Nấm đã bắt đầu xuất hiện trên Trái Đất cách đây hàng tỉ năm trước (Bruns et al., 2006) Nấm được ghi nhận có sự tồn tại trước cả thực vật, chúng bắt đầu phổ biến trên mặt đất trong kỷ Cambri (Brundrett, 2002) Nấm có môi trường sống đa dạng, có thể phân bố trên cạn, dưới nước hay trên cơ thể sinh vật khác Nấm đóng vai trò là sinh vật phân hủy trong tự nhiên ở nhiều lưới thức ăn, từ đó tạo thành các chất vô cơ - nguồn nguyên liệu cho quá trình đồng hóa của thực vật hay các sinh vật khác Qua đó, có thể thấy rằng trong tự nhiên nấm tuy nhỏ bé nhưng lại là mắt xích quan trọng kết nối với các sinh vật khác, góp phần giúp duy trì và cân bằng hệ sinh thái

Nấm đã được Linnaeus phân loại thuộc bộ Thallophyta, giới Plantae (Thực vật)

vào năm 1753 Có sự phân loại này là do Nấm và Thực vật đều không có khả năng di động, thành tế bào của nấm có cấu tạo giống với thực vật hơn là động vật Năm 1969, Whitaker đã đề xuất chia thế giới sinh vật thành một hệ thống phân loại gồm có 5 giới

đó là giới Monera (Khởi sinh), giới Protista (Nguyên sinh), giới Fungi (Nấm), giới

Plantae (Thực vật) và giới Animalia (Động vật) Năm 1990, C Woese đã sắp xếp lại

sinh giới thành 3 lãnh giới dựa vào trình tự nucleotide 16S rRNA là Archaea (Cổ khuẩn),

Bacteria (Vi khuẩn) và Eukarya (Sinh vật nhân thực) Trong đó, Nguyên sinh, Nấm, Thực vật và Động vật được xếp chung vào lãnh giới Eukarya Qua đó, Nấm đã được xác nhận

là một giới riêng cùng với các giới còn lại được xếp trong lãnh giới Eukarya

Ngoài ra, có nhiều nghiên cứu ngày nay còn chứng minh rằng hệ sinh vật nấm có các tính năng riêng Các loại nấm khi so với thực và động vật lại có sự khác biệt là do khác nhau trong thành phần, thành tế bào cấu tạo chủ yếu là kitin (chitin), kiểu dinh dưỡng theo kiểu dị dưỡng (osmotrophic), nhưng không phải là tiêu hóa như các loài động vật Đây là những đặc điểm khác biệt để phân chia nấm thành một giới riêng gọi là giới

Nấm (Miles et al., 2004; Bruns et al., 2006) Giới Nấm bao gồm các sinh vật nhân thực

và phần lớn chúng phát triển dưới dạng sợi nấm (hyphae) hay còn gọi là các sợi đa bào, phần còn lại thì phát triển theo dạng đơn bào, thành tế bào của nấm chứa phần lớn là chitin (kitin), không có chứa lục lạp, lông hay roi, sinh sản của nấm là hữu tính và vô tính bằng bào tử Chúng lấy các chất dinh dưỡng bằng cách hấp thụ thông qua bề mặt của tế bào, kiểu dinh dưỡng của nấm chủ yếu là kí sinh, hoại sinh; khác với tự dưỡng ở thực vật và nội tiêu hoá bằng ống tiêu hoá ở động vật

Theo hệ thống phân loại của Ainsworth năm 1973, giới nấm được chia thành 2

ngành chính là ngành Myxomycota và ngành Eumycota Trong đó ngành Myxomycota gồm những loài giả nấm (plasmodia và pseudoplasmodia), ngành Eumycota gồm chủ yếu là nấm sợi Đa số nấm ăn được xếp vào ngành phụ Basidiomycota và Ascomycotina (Nguyễn Lân Dũng, 2001) thuộc ngành chính Eumycota

1.2 Tổng quan chi nấm Pleurotus

1.2.1 Đặc điểm chung của chi Pleurotus

Pleurotus (Jacq Fr.) P Kumm là một chi nấm thuộc về họ Pleurotaceae, bộ Agaricales, lớp Agaricomycetes, ngành Eumycota (Nấm thật) Chi nấm này ghi nhận có

khoảng 70 loài (Nguyen et al., 2019) Các loài Pleurotus thích hợp sinh trưởng ở vùng

có khí hậu cận và nhiệt đới (Barh et al., 2019; Cohen et al., 2002) nên tại những khu vực này chúng có sự phát triển tốt nhất, hình thức dinh dưỡng chủ yếu của các loài nấm này

chủ yếu là hoại sinh trên các cây thân gỗ (Karim et al., 2016) Phần lớn các loài Pleurotus

được xếp vào nhóm nấm ăn ngon mang lại giá trị thương mại cao, được liệt kê vào một trong số các loại nấm được trồng (canh tác) làm thực phẩm nhiều nhất trên toàn thế giới

(Zhao et al., 2021) Các loài Pleurotus có nguồn gốc tiến hóa tách biệt (Zevakis et al.,

2004), được áp dụng trong những mục đích khác nhau về lĩnh vực y dược, lĩnh vực môi trường và lĩnh vực công nghệ sinh học (Kirk et al., 2008; Cohen et al., 2002) Nấm Bào ngư còn được gọi là nấm Sò hay Hirakate, Houbikate, Houbiko (theo tiếng Nhật) là tên

gọi chung của các loài Pleurotus Nổi bật trong chi nấm này là các loài Pleurotus

ostreatus, P eryngii, P pulmonarius, P citrinopileatus, P cornucopiae – đây là những

loài nấm đặc trưng, nổi tiếng nhờ hương thơm cùng với vị đặc trưng và hàm lượng dinh dưỡng cao (dồi dào protein, carbohydrate, khoáng chất, chất xơ, vitamin) (Khan et al., 2012; Feeney, 2014), được trồng làm thực phẩm ở nhiều khu vực và nghiên cứu ở nhiều quốc gia (Zadrazil, 1978; Sibel Yildiz et al., 2002; Chang, 2006)

Hiện nay, các loài Pleurotus đứng thứ 3 trong số những loài nấm ăn ngon được

canh tác phổ biến nhất thế giới, chỉ xếp sau nấm mỡ (button mushroom) và nấm hương hay nấm đông cô (shiitake mushroom) (Fernandes et al., 2015) Ba Lan là quốc gia sản xuất thương mại nấm Bào ngư dẫn đầu ở Châu Âu với sản lượng nấm mỗi năm đạt đến

80,000 tấn Trong đó, P ostreatus và P pulmonarius là 2 loài được đánh giá là kinh tế

nhất (dos Santos Bazanella et al., 2013; Golak-Siwulska et al., 2018) Việc sản xuất

thương mại các loài Pleurotus chiếm khoảng 30%, đạt 15 triệu tấn về sản lượng, có giá

trị hơn 50 tỉ đô la (Chang, 2008) Số tiền thống kê này đã tăng lên đến con số 63 tỉ đô la

vào năm 2013 (Roy et al., 2017) Từ đó, trong tương lai thị trường về các loài Pleurotus

rất có tiềm năng và sẽ còn được phát triển rộng rãi

Đặc điểm chung của các loài Pleurotus là thường mọc thành cụm, tai nấm có dạng

hình phễu lệch, cấu tạo gồm 3 phần: mũ nấm, phiến nấm và cuống nấm Đến một giai đoạn thích hợp của quá trình trưởng thành, nấm sẽ phân tán bào tử ra môi trường, khi tiếp xúc với điều kiện thuận lợi, ở các bào tử này sẽ diễn ra quá trình nảy mầm và phát

triển tạo nên hệ sợi sơ cấp (Lê Duy Thắng, 2001; Nguyễn Lân Dũng, 2002) Pleurotus

ostreatus là một loài nấm điển hình có mức độ phổ biến rộng ở cả Châu Âu, Châu Á

Loài nấm này có màu từ xám đến nâu (Zervakis et al., 1996; Bao et al., 2004; Stanley et al., 2017) hoặc có màu trắng đến trắng kem, thường mọc thành cụm trên thân cây ẩm ướt (Wilson, 2020), mũ nấm có hình bán nguyệt, cuống lệch tâm, bào tử có màu từ trắng đến

xám (Zervakis et al., 1996) Các loài Pleurotus thường được gọi là nấm thối gỗ do hình

thức dinh dưỡng của chúng chủ yếu là hoại sinh trên các cây thân gỗ (Karim et al., 2016)

Hình 1.1 Hình ảnh Pleurotus ostreatus ngoài tự nhiên (Zervakis et al., 2015) 1.2.2 Lịch sử nghiên cứu chi nấm Pleurotus

Hệ thống phân loại của Pleurotus là vấn đề đã từng gây nên nhiều tranh cãi trong nhiều năm giữa các nhà nấm học Cụ thể, năm 1981, Julich đã xếp chi Pleurotus (Jacq Fr.) P Kumm thuộc họ Pleurotaceae, bộ Polyporales (Gauman, 1926) Nhưng theo hệ thống học của Singer, 1986 thì ông lại xếp chi Pleurotus vào họ Polyporaceae (Fr.), bộ

Agaricales (Clements, 1909) Ông cho rằng Agaricales phát sinh từ Aphyllophorales

(trong đó đã bao gồm cả Polyporales) trong khi đó Julich cũng cho rằng họ Pleurotaceae là dạng trung gian chuyển tiếp giữa Polyporales và Agaricales Các tác giả trên thống nhất xem Pleurotus nằm ở miền ranh giới giữa nhóm nấm lỗ (polyporoid) và nấm tán

(agaricoid) Tên chi đã trải qua nhiều lần hiệu chỉnh và sau cùng các nhà nấm học quyết

định giữ lại tên Pleurotus (Guzmán et al., 2000; Lê Xuân Thám., 2010)

Đến năm 1982, Hilber công bố công trình mà trong đó ông tập trung, nhấn mạnh

mô tả về đặc điểm hình thái của “Pleurotus eryngii complex” Khái niệm “species

complex” thường dùng để định nghĩa các loài nấm có mối quan hệ gần nhau, giữa chúng có khả năng tương thích giao phối với nhau hoàn toàn hoặc một phần (Vilgalys et al., 1994; Zervakis et al., 2001; Bao et al., 2004; Estrada et al., 2010) Dựa trên cơ sở mà

ông phân tích, ông đã đề nghị phát sinh 3 phân chi trong hệ thống phát sinh chủng loại

đó là: Lentodiopsis (Bubák) O Hilber, Coremiopleurotus O Hilber và Pleurotus

(Guzmán et al., 2000; Lê Xuân Thám, 2010) Các loài có khả năng tạo quả thể vô tính

thì được sắp xếp phân loại thuộc phân chi Coremiopleurotus Hilber (Zervakis et al., 2004) Một số loài thuộc phân chi Coremiopleurotus là Pleurotus abalonus Han et al (1974) và Pleurotus cystidiosus var formosensis Moncalvo (1995); Pleurotus smithii Guzman (1975); Pleurotus fuscosquamulosus (Reid et al., 1998 ; Zervarkis et al., 2004)

Các loài không có khả năng tạo quả thể vô tính, hệ sợi là monomitic (sợi sinh sản) hoặc

dimitic (gồm sợi sinh sản và sợi bện) được xếp vào phân chi Pleurotus là Pleurotus

ostreatus (Jacq.) P.Kumm 1871, P enrygii (DC.) Quél 1872;… Một số loài có hệ sợi

dimitic được xếp vào phân chi Lentodiopsis (Bubák) 0 Hilber là: Pleurotus dryinus (Pers.: Fr.) P Kumm 1871 (St, L 2001); Pleurotus calpyptratus (Lindblad ex Fr.) Sacc

1887 (Hilber, 1982);…

1.2.3 Khóa phân loại của chi nấm Pleurotus

Pleurotus là một chi nấm thuộc ngành Eumycota có khóa phân loại như sau:

Giới (Regnum): Fungi Ngành (Phylum): Eumycota Lớp (Class): Agaricomycetes Bộ (Ordo): Agaricales

Họ (Familia): Pleurotaceae Chi (Genus): Pleurotus

1.3 Thành phần dinh dưỡng chi Pleurotus

1.3.1 Thành phần dinh dưỡng chung

Các loài P ostreatus, P sajor-caju, P eryngii,… đã được khẳng định qua nhiều

công bố khoa học về những giá trị dinh dưỡng Cụ thể, các công trình này đã chứng minh chúng chứa nhiều axit amin, protein, carbonhydrate, nguyên tố vi lượng, đa lượng (Cu,

Fe, Mg, Na, K, Zn, P,…) (Khan et al., 2012; Josiance et al., 2018; Herndndez et al.,

2003; Kalmis et al., 2008) Pleurotus ostreatus là một trong số các loài Nấm Bào ngư

được chọn để nghiên cứu nhiều nhất vì nó rất giàu dinh dưỡng như: vitamin, chất xơ, axit amin và khoáng chất, các phức hợp polysaccharides, proteins, sterols, nucleosides,

axit gallic, flavonoid, axit chlorogenic, lycopene, β –carotene, v.v (Reis et al., 2011;

Garganno et al., 2017)

1.3.2 Thành phần hóa học chính 1.3.2.1 Lovastatin

Lovastatin thuộc nhóm chất statin có cấu trúc chung gồm một vòng hexahydronaphthalene và một vòng β-hydroxyl lactone (Pandey et al., 2019) Chất này còn có tên gọi là mevinolin hay monacolin K Đây là một polyketide có chức năng ức chế cạnh tranh làm giảm cholesterol (Krukemyer et al., 1987) thông qua việc ức chế 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase – một enzyme xúc tác quá trình khử HMG-CoA để hình thành nên mevalonate trong quá trình tổng hợp nên cholesterol (Singer et al., 1988) giúp ngăn cản quá trình tổng hợp cholesterol trong cơ thể (Sumarmi et al 2004) Lovastatin được Endo và cộng sự, 1978 phân lập thành công đầu tiên từ

Aspergillus terreus Sau đó, chất này được Alberts và cộng sự, 1979 nghiên cứu và thu

nhận từ Monascus ruber Lovastatin còn được tìm thấy trong quả thể của nấm Pleurotus

ostreatus (Cimerman et al., 1995); Pleurotus eryngii (Lee et al., 2006); Pleurotus caju, Pleurotus florida (Khan et al., 2011; Golak-Siwulska et al., 2018), Lovastatin có

sajor-rất nhiều tác dụng, ngoài việc giảm cholesterol trong máu, lovastatin còn ngăn ngừa ung thư ruột kết, bệnh bạch cầu dòng tủy cấp tính và những rối loạn về thần kinh như bệnh Parkinson (Zixiao Xiong et al.,2019), kháng ung thư (Chen et al., 2015; Klawitter et al., 2010; Lin et al., 2006), bảo vệ thần kinh (Divsalar et al., 2018; Lin et al., 2015; Ghanizadeh et al., 2014), kháng khuẩn và kháng viêm (Zhou et al., 2018) Hàm lượng

Lovastatin trung bình có trong mẫu nấm Pleurotus khô chiếm khoảng 0,7 – 2,8%

(Alarcon et al., 2003) và dao động tùy theo loài: khoảng 101 mg/kg trọng lượng khô ở

P cystidiosus, 216 mg/kg trọng lượng khô của quả thể ở P ostreatus (Chen et al., 2012)

Ngoài ra, tuy là cùng một loài nhưng hàm lượng lovastatin lại khác nhau vì chúng được

thu lấy từ những nơi khác nhau như Pleurotus ostreatus thu nhận từ Nhật Bản có lượng

lovastatin là 606,5 µg/g trọng lượng khô, ở Đài Loan là 216,4 µg/g nhưng ở Hàn Quốc chỉ đạt 165,3 µg/g (Piska et al., 2017) Chất này đã được Alam và cộng sự nghiên cứu

trên chuột và chứng minh Lovastatin hiện diện trong quả thể P ostreatus và P

sajor-caju có kết quả ảnh hưởng tích cực đến thành phần lipid cũng như chức năng của gan và

thận, tổng mức cholesterol và triglyceride trong máu chuột giảm (Alam et al., 2009)

1.3.2.2 Polysaccharide

Polysaccharide thuộc về nhóm hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học rất nổi bật vì nhờ vào tác dụng kháng oxi hóa (Liu et al., 2010; Ruthes et al., 2015; Zhang et al.,

2016; Seedevir et al., 2019), kháng khuẩn (Staphylococcus aureus; E coli; Bacillus

cereus;…) (Gbolagade et al., 2007; Mehment and Sevda, 2009; Adebayo et al., 2012),

kháng viêm (Jose et al., 2002; Adebayo et al., 2012), kháng u (Yang et al., 2013)

Polysaccharide chứa hàm lượng cao trong quả thể nấm Pleurotus (Wasser, 2002) dao

động từ 36 g đến 60 g/100 g quả thể khô (Alam et al., 2008; Khan et al., 2008; Mshandete et al., 2007; Akindahunsi et al., 2006) Polysaccharide gồm có β-glucan và α-glucan tham

gia cấu thành nên vách tế bào Pleurotus là nguồn cung cấp β-glucan dồi dào (Rop et al.,

2009) Tổng lượng glucan gồm α-glucan và β-glucan có sự khác nhau giữa các loài

Pleurotus (Golak-Siwulska et al., 2018) Cụ thể, tổng lượng glucan đạt 18,260 g/100 g Hình 1.2Cấu trúc hóa học của Lovastatin (Grabarczyk et al., 2019)

trọng lượng khô ở P citrinopileatus và đạt 25,636 g/100 g trọng lượng khô ở P ostreatus (Sari et al., 2017) Lượng β-glucan có trong P eryngii và P ostreatus đạt lần lượt là

15,321 g/100 g trọng lượng khô và 24,230 g/100 g trọng lượng khô Theo Synytsya et

al (2009) nghiên cứu về lượng β-glucan ở P ostreatus, tác giả nhận thấy lượng β-glucan

có trong thân nấm đạt 32,5-50% trọng lượng khô cao hơn trong mũ nấm (27,4-39,2%)

P eryngii có lượng glucan trong thân nấm đạt 39,1% trọng lượng khô cũng cao hơn

lượng glucan có trong mũ nấm chiếm 20,4% (Golak-Siwulska et al., 2018) Pleurotus

ostreatus và Pleurotus djamor đã được xác nhận là hai loài nổi bật hơn cả nhờ vào khả

năng chống bệnh, kháng oxy hóa, kháng u và điều hòa miễn dịch (Su et al., 2016; Itisam et al., 2006), chống ung thư gan và ung thư mô liên kết (Hexiang et al., 2000), giảm cholesterol ở người (Inga et al., 2010)

1.3.2.3 Vitamin

Vitamin được xếp vào nhóm yếu tố vi lượng, là những yếu tố mà cơ thể không thể tự tổng hợp mà phải được cung cấp từ bên ngoài qua việc tiêu thụ những thực phẩm hoặc đồ uống chứa vitamin Mặc dù cơ thể chỉ cần vitamin với một lượng nhỏ (yếu tố vi lượng ở dạng vết) nhưng nó lại giữ vai trò chủ đạo trong nhiều quá trình trao đổi chất

của tế bào và cơ thể Quả thể của các loài Pleurotus chứa rất nhiều loại vitamin, trong

đó chiếm đa số là vitamin D2, vitamin B1, vitamin C và vitamin B2 (Manzi et al.,2004) Các vitamin nhóm B có rất nhiều trong quả thể nấm, đặc biệt là thamine, pantotene acid, riboflavin, nicotinic acid, folic acid, pyridoxine, nicotinamid và cobalamin cũng như các vitamin khác như ergosterol, biotin, phytochinon và tocopherols (Mattiala et al., 2001)

Hàm lượng vitamin có sự dao động giữa các loài Cụ thể, P ostreatus chứa nhiều

folacine, vitamin B1, vitamin B3 nhưng hàm lượng vitamin B12 lại ít hơn những loài

khác (Deepalakshmi et al., 2014)

1.3.2.4 Protein, axit amin và các hợp chất khác

Các loài Pleurotus được đánh giá là nguồn protein dồi dào tốt cho cơ thể và rất thích

hợp với những người ăn chay (Raman et al., 2021) Mức độ dao động trong lượng protein

giữa các loài Pleurotus cũng có sự khác nhau tùy theo loài, hàm lượng này chiếm khoảng

từ 9,29 g đến 37,4 g/100 g khối lượng khô (Ritota, 2019) Cụ thể, hàm lượng protein

được tìm thấy ở Pleurotus ostreatus và Pleurotus djamor var roseus khoảng 23,91–35,5

g/100g (Alam et al., 2008; Jegadeesh et al., 2018) Protetin có trong thể quả tươi của

Pleurotus ostreatus chiếm 28,85% (Tolera and Abera, 2017), của Pleurotus eous chiếm

24,10% (Kortei et al., 2015) Một số axit amin góp phần nâng cao hương vị thơm ngon của nấm (Kortei et al., 2015) Axit amin tryptophan, cysteine, alanine và glycine có tác dụng hiệp đồng (hiệu ứng đồng vận) với vitamin C và E trong việc chống oxi hóa của cơ

thể (Raman et al., 2021) Ngoài ra, Pleurotus còn cung cấp cho cơ thể một nguồn chất

xơ dồi dào hỗ trợ tiêu hóa (Raman et al., 2021) Hàm lượng chất xơ có trong quả thể của

Pleurotus ostreatus là 10,21%, Pleurotus flabellatus là 11,9%, Pleurotus florida là

29,9%, P sajor-caju là 10,9%, P pulmonarius là 14,7%, P eous là 15,91%, P djamor

var roseus là 14,60%, và P tuber-regium là 10,86% (Bano et al., 1981; Ijeh et al., 2009;

Smiderle et al., 2012; Mshandete and Cuff, 2008; Salami et al., 2017; Jegadeesh et al., 2018)

1.4 Tiềm năng ứng dụng của Pleurotus

Từ xa xưa, nấm nói chung và cách riêng các loài Pleurotus đã sớm được con người

khai thác để làm thực phẩm hay trong những nét đặc trưng về truyền thống văn hóa dân tộc cũng như phong tục tập quán của người Châu Âu, người Châu Mĩ và người Châu Á (Tsiantas et al., 2021) Cùng với đó, nấm cũng được các danh y thời xưa áp dụng để chữa nhiều bệnh khác nhau vì chúng có nhiều đặc tính quý giúp cải thiện nâng cao sức khỏe như kháng viêm, chống oxy hóa, giảm cholesterol, chống ung thư, điều hòa miễn dịch và còn nhiều đặc tính khác liên quan đến một chất cụ thể có trong nấm như ergothioneine, polysaccharide (chitosan, β-glucan), terpene, lectin và lovastatin (Patel et al., 2012; El

Enshasy et al., 2013; Gargano et al., 2017; Muszýnska et al., 2018; Boulaka et al., 2020; Tsiantas et al., 2021).

1.4.1 Đối với lĩnh vực thực phẩm

Các loài Pleurotus phần lớn thuộc các loài nấm ăn đặc trưng với mùi vị thơm ngon và tính chất bổ dưỡng nên đây cũng chính là lí do Pleurotus đã sớm được trồng và khai

thác làm thực phẩm trong suốt thời kì chiến tranh thế giới ở Đức (Kaufert et al., 1936)

Ngày nay, một số loài Pleurotus được trồng thương mại vì chúng có hàm lượng khoáng chất cao, tính chất dược liệu và rất kinh tế (Yildiz et al., 2002) Các loài Pleurotus xếp

trong 5 nhóm nấm được trồng và cung cấp hàng đầu thế giới (Royse et al 2017; Tsiantas

et al., 2021); đạt gần 13 tỉ tấn năm 2013 (Royse et al., 2017) Chi nấm Pleurotus được

chứng minh là thành phần tiềm năng trong việc tạo các sản phẩm thịt (Torres-Martínez et al., 2022) do vậy rất phù hợp cho những người ăn chay Ở Việt Nam, về lĩnh vực thực

phẩm hiện đã có các đề tài về Pleurotus đã được triển khai ứng dụng Trong đó, nổi bật

là “Nghiên cứu định danh và khả năng sinh trưởng hệ sợi của các giống nấm bào ngư thương mại trên một số môi trường dinh dưỡng” của nhóm tác giả Bùi Ngọc, T et al., 2021; “Nghiên cứu về quy trình chế biến nấm bào ngư sấy tẩm gia vị ăn liền” của tác giả

Nguyễn, T T D., 2019; “Nghiên cứu nuôi trồng nấm (Pleurotus spp.) sử dụng cơ chất

lên men” của nhóm tác giả Mai, N H., Nguyên, T B., & Đại, P H (2019); “Nghiên cứu

thành phần dinh dưỡng và một số hoạt tính sinh học của nấm bào ngư trắng Pleurotus

plorida được trồng ở Miền Bắc Việt Nam” của tác giả Bích N.T N, (2018);… 1.4.2 Đối với lĩnh vực y học

1.4.2.1 Khả năng giảm cholesterol trong máu

Theo Durrington và Ramakrishman, sự tăng cholesterol (hypercholesterolemia) được hiểu là sự biểu hiện ở mức độ cao nồng độ cholesterol trong máu (Durrington 2003; Ramakrishnan et al., 2017) Tăng cholesterol là một dạng rối loạn chuyển hóa có thể là thứ phát đối với nhiều bệnh, nó góp phần hình thành các dạng bệnh như cao huyết áp,

xơ vữa động mạch, tim mạch vành, béo phì và nhiều biến chứng liên quan (Khan et al.,

2012) Tam et al., 1986 đã báo cáo đầu tiên chiết xuất từ P sajor-caju được sử dụng để

giảm huyết áp ở chuột Tình trạng tăng cholesterol gây xơ vữa ở chuột và thỏ đã được

cải thiện sau khi áp dụng điều trị bằng chế độ ăn kết hợp với P ostreatus và P florida

đã được nhiều báo cáo chứng minh (Bobbek et al., 1995; 1999; Bajaj et al., 1997; Hossain et al., 2003) Bột nấm từ quả thể khô, dịch chiết nước nóng, dịch chiết từ ethyl acetate

và methanol của P citrinopileatus được Hu et al, Khan et al chứng minh có khả năng

giảm lipid máu và chống oxi hóa ở chuột (Hu et al., 2006; Khan et al., 2012) Vào những năm trở lại đây, lovastatin là một trong những chất được tiến hành nghiên cứu nhiều nhất trong việc hỗ trợ làm giảm cholesterol trong máu Chất này không những có chức năng làm giảm lipid trong máu, phòng ngừa bệnh Parkinson, Alzheimer và xơ vữa động mạch mà nó còn có chức năng kháng viêm và tăng cường tái tạo xương cho cơ thể (Upendra et al., 2013) Lovastatin đã được sự công nhận từ Cục quản lí Thực phẩm và Dược phẩm Hoa kì (FDA) vào năm 1987 (Endo 1988) Lovastatin được tìm thấy ở một số loài

Pleurotus gồm P eryngii, P ostreatus (Gunde-Cimerman, 1995), P cornucopiae

(Krasnopolskaya et al., 1998), Các nhà khoa học hiện nay trên thế giới đang hướng đến nghiên cứu khảo sát khai thác các loài nấm ăn có khả năng sản xuất nguồn Lovastatin dồi dào với mục đích phát triển thuốc điều trị bệnh tăng cholesterol trong tương lai (Ramakrishnan et al., 2017)

1.4.2.2 Khả năng kháng ung thư

Choi et al., 2004 đã nghiên cứu thành công dịch chiết từ quả thể của Pleurotus

ferulae có chức năng chống ung thư phổi và ung thư cổ tử cung sau khi thực hiện trên

hai dòng tế bào SiHa và HeLa Năm 2006, Gu và cộng sự chứng minh dịch chiết nước

nóng của P ostreatus ngăn được sự tăng sinh của dòng tế bào MCF-7 ở bệnh nhân ung thư vú Sau đó, Jedinak và Silva tiếp tục thử nghiệm hiệu quả với dịch chiết P ostreatus

từ ethanol và nhóm tác giả kiểm tra thấy dịch chiết này kìm hãm được sự tăng sinh của các tế bào ung thư vú (MDA-MB-231, MCF-7) và ung thư ruột kết (HCT-116, HT-29)

mà không tác động đến sự tăng sinh bình thường của các tế bào biểu mô tuyến vú 10A và tế bào ruột kết bình thường FHC (Jedinak and Sliva, 2008) Sau đó, càng ngày có nhiều công trình nghiên cứu chống ung thư từ dịch chiết quả thể của các loài

MCF-Pleurotus Điển hình là nghiên cứu P citrinopileatu, P eryngii kháng ung thư bạch cầu

bằng việc tác dụng lên tế bào đích U937 (Chen etial., 2009; Bae etial., 2009); P

nebrodensis kháng ung thư cổ tử cung (HeLa), ung thư phổi (Lu-04), ung thư gan

(HepG2) (Lv et al., 2009), dịch chiết nước nóng polysaccharide của P geesteranus có

chức năng gây độc cho dòng tế bào MCF-7 ở bệnh nhân ung thư vú (Zhang et al., 2011),…

1.4.2.3 Khả năng kháng virus

Gần đây, Pleurotus ostreatus là 1 trong 3 loài nấm đã được nhận định rất có tiềm

năng nghiên cứu về khả năng kháng SARS-CoV2 (Elhusseiny et al., 2022) Điều đó cho

thấy các loài Pleurotus rất có giá trị tiềm năng trong việc kháng lại virus nói chung và SARS-CoV2 nói riêng Hợp chất polysaccharide từ chiết xuất nước và methanol của P

pulmonarius có khả năng kháng vi rút cúm A (Ilyicheva et al., 2020) Enzyme laccase

được tinh sạch từ P ostreatus tác dụng lên Hepatitis C virus làm ức chế sự xâm nhiễm

của nó đồng thời ngăn chặn tế bào HepG2 sao chép (El-Fakharany et al., 2010) Một

ubiquitin mới có bản chất protein được thu thập từ P ostreatus ức chế được hoạt động

của HIV-1 reverse transcriptase (Wang et al., 2000) Một enzyme laccase khác và lectin

được tách chiết từ quả thể tươi của P cornucopiae có nồng độ ức chế lần lượt với IC50

là 22 µM và IC50 là 0,93 µM có hiệu quả với reverse transcriptase ở HIV-1 (Wong et

al., 2010; Li et al., 2008) Các loài P djamour, P sajor-caju, và P citrinopileatus được

khuyến khích dùng trong thực phẩm và trong việc điều trị bệnh và chú trọng cách riêng với bệnh nhân bị nhiễm HIV/AIDS vì chiết xuất methanol từ các loài nấm này cho thấy hiệu quả kháng HIV cao (Kidukuli et al., 2010),…

1.4.2.4 Khả năng kháng khuẩn

P levis và P tuber-regium là 2 loài được cho là có tiềm năng cao trong kháng

khuẩn Bacillus subtilis (Adebayo et al., 2018) Dịch chiết từ Pleurotus ostreatus 800) có nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) là 36,38 µg/ml đối với Stenotrophomonas

(CP-spp., 145,52 µg/ml đối với Streptococcus agalactiae, Escherichia coli, Bacillus subtilis

và Pseudomonas aeruginosa Nồng độ diệt khuẩn có hiệu quả nhất ở dịch chiết của P

tuber-regium (CP-182) là 24,12 µg/ml; của P ostreatus (CP-800) là 36,38 µg/ml Không

chỉ kháng các vi khuẩn ở trên, dịch chiết của P tuber-regium còn có tác dụng kháng S

typhi và P aeruginosa với MBC là 24,12 µg/ml, MBC là 48,23 µg/ml đối với S agalactiae, Stenotrophomonas spp., B subtilis, S aureus, L monocytogenes và ở 96,46

µg/ml đối với E coli (Adebayo et al., 2018) Cao chiết từ P sajor-caju có tác dụng ức chế Pseudomonas aeruginosa và Staphylococcus aureus (Ngai et al., 2004)

2 CON ĐƯỜNG SINH TỔNG HỢP LOVASTATIN

2.1 Cơ chế tổng hợp Lovastatin

Chú thích: LNKS: Lovastatin nonketide synthase LDKS: Lovastatin diketide synthase

Cơ chế sinh tổng hợp Lovastatin ở Aspergillus terreus: Lovastatin được biết đến

là sản phẩm trao đổi chất thứ cấp được tổng hợp từ Aspergillus terreus (Kennedy et al.,

1999) Năm 1999, Kennedy và nhóm của ông đã tìm thấy được 18 gen có liên quan tham gia con đường tín hiệu tổng hợp Lovastatin được tổ chức thành một cụm gen có kích thước 64 kb chứa nhiều gen có chức năng mã hóa cho nhiều enzyme khác nhau tham gia

Hình 1.3 Sơ đồ con đường chuyển hóa Lovastatin trên Aspergillus terreus

(Kennedy et al, 1999; Ma et al, 2009; Xu et al, 2013)

con đường chuyển hóa Lovastatin Con đường tín hiệu tổng hợp cũng được làm rõ thông qua các đặc điểm về di truyền (Kennedy et al., 1999; Hendrickson et al., 1999) và sinh hóa (Xie et al., 2009) Từ đó, hiểu được quá trình sinh tổng hợp Lovastatin sẽ mở ra một cơ hội tiềm năng nhằm tận dụng những kiến thức của các nhà khoa học góp phần cho những nỗ lực trong tương lai trong việc tác động, điều chỉnh, chỉ đạo việc sinh tổng hợp Lovastatin hoặc các hợp chất tương tự Lovastatin (Ames et al., 2012) Lovastatin được tổng hợp theo con đường polyketide synthase loại I lặp đi lặp lại (PKS) Quá trình tổng hợp Lovastatin đi theo 2 hướng, hướng 1 tổng hợp khung naphatalen-lactone do LovB và nhiều enzyme khác do qua nhiều giai đoạn phản ứng, hướng 2 tổng hợp chuỗi bên 2(S)-methylbutyrate chủ yếu do LovF xúc tác Sau đó, chuỗi bên sẽ gắn vào khung nhờ LovD Cụ thể hơn, Lovastatin nonketide synthase (LNKS hoặc LovB), enoylreductase (LovC) và Thioesterase (LovG) là những enzyme quan trọng để tổng hợp nên dihydromonacolin L bắt đầu từ 9 đơn vị acetyl-CoA và 1 đơn vị malonyl-CoA (Kennedy et al., 1999; Ma et al., 2009; Xu et al., 2013) Sau đó, dihydromonacolin L bị hydroxyl hóa và khử nước liên tục, lần lượt tạo ra axit monacolin L và axit monacolin J bởi có sự xúc tác của cytochrome P450 monooxygenase (LovA) Chính vì thế, lượng Lovastatin được kiểm soát thông qua việc tác động vào những gen có chức năng mã hóa cho các enzyme cần thiết tham gia xúc tác trong con đường chuyển hóa chất quý này.

2.2 Transesterase (LovD)

Transesterase là một enzyme được mã hóa từ gen LovD Enzyme này có chức năng

xúc tác việc chuyển chuỗi bên α-metylbutyrat đến vị trí C8-hydroxy của axit monacolin J (MJA) để tạo ra lovastatin Ngoài ra, theo như Hendrickson et al, 1999 và Kennedy et al, 1999 enzyme methylbutyryt transesterase còn xúc tác gắn axit 2 – metylbutyric vào monacolin J trong bước cuối cùng của con đường sinh tổng hợp lovastatin Để khẳng định transesterase có tầm quan trọng đến mức nào, có một số nghiên cứu đã thực hiện

gây đột biến bất hoạt gen LovD trên Aspergillus terreus Kết quả cho thấy rằng mặc dù có gen LovB, LovF và LovC hiện diện và cho thấy có sự tích tụ monacolin J nhưng cuối

cùng lại không hình thành Lovastatin Điều đó ủng hộ cho quan điểm rằng transesterase tham gia vào phản ứng este hóa hình thành nên Lovastatin trong bước cuối cùng của con đường chuyển hóa Điều này đã được Martín và cộng sự của ông xác nhận khi cho gen

LovD biểu hiện trong E coli và khi đem ủ với monacolin J và CoA-thioester của

2(S)-methylbutyrate thì Lovastatin được tạo ra (Martín et al, 2014)

2.3 Lovastatin diketide synthase (LovF)

LovF là một enzyme do gen LovF tổng hợp gồm có 7 miền xúc tác: KS

(ketosynthase), AT (Acyl transferase), MeT (Methyl transferase), ACP (Acyl carrier protein), ER (enoyl reductase), DH (Dehydratase) và KR (ketoreductase) Enzyme này tham gia tổng hợp nên 2-metylbutyryl-CoA bắt đầu từ 2 đơn vị acetyl-CoA và 1 đơn vị malonyl-CoA, đây là hướng thứ 2 tổng hợp chuỗi bên của quá trình sinh tổng hợp Lovastatin Đây là nhân tố quyết định giúp chuyển đổi 2-methybutyryl–CoA thành alpha-methyl-beta-ketobutyryt (hay còn được gọi là monacolin J) LovF ngoài chức năng xúc tác việc tổng hợp chuỗi bên của alpha-S-methylbutyrate và sau đó được chuyển thành monacolin J, hình thành nên Lovastatin mà một miền protein mang acyl (ACP) của LovF có vai trò chuyển nhóm α-methylbutyrate đến transesterase (LovD), và sau đó

đến Monacolin J (Hutchinson et al., 2000)

PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

1.1 Các công cụ khai thác dữ liệu

- Trang cơ sở dữ liệu (CSDL) sinh học NCBI (National Center for Biotechnology Information) với địa chỉ trang web: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ là CSDL được dùng để tìm kiếm và khai thác thông tin, dữ liệu sinh học

- Genbank: Là CSDL dùng cho việc tìm kiếm toàn bộ thông tin có liên quan đến trình tự nucleotide của một hoặc nhiều gen đã được mã hóa (DNA, RNA) và protein, genome,… đã công bố trên Pubmed

- Pubmed với địa chỉ: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/.pubmed/ là CSDL sinh học dùng để thu thập toàn bộ các bài báo đã được công nhận khoa học về Y – Sinh trong MEDLINE

- Phần mềm trực tuyến BLAST với địa chỉ https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi/: giúp tìm kiếm các vùng tương đồng cục bộ giữa các trình tự được lưu trữ trên Genbank của NCBI với trình tự đầu vào bằng cách so sánh với hàng trăm triệu trình tự được lưu trữ trên Genbank để tìm ra các trình tự được cho là có tương đồng với trình tự truy vấn

- IDT analyzer với địa chỉ truy cập: https://sg.idtdna.com/calc/analyzer là phần mềm trực tuyến dùng để đánh giá các thông số quan trọng của mồi như: phần trăm GC, chiều dài của mồi, nhiệt độ nóng chảy cũng như khả năng mồi hình thành nên cấu trúc thứ cấp (hairpin-dimer, self-dimer và hetero-dimer),…

- Annhyb phiên bản 4.946: là phần mềm kết hợp nhiều công cụ dùng để chỉnh sửa và xử lí các trình tự nucleotide như: sắp gióng cột trình tự, đọc và xuất thông tin về trình tự mục tiêu cũng như kiểm tra độ đặc hiệu của mồi,

- Chromas Lite phiên bản 2.1.1: đây là phần mềm dùng để thực hiện đọc kết quả giải trình tự

- Bioedit version 7.2.5: Phần mềm dùng để phân tích và hiệu chỉnh trình tự gen, protein

1.2 Mẫu nấm

Mẫu nấm thuộc chi Pleurotus dùng trong nghiên cứu thực nghiệm gồm có hai mẫu

được thu mua từ AEON Mall Canary Bình Dương ở khu phố Thuận An, tỉnh Bình Dương Hình ảnh về mẫu nấm thực nghiệm được hiển thị rõ nét trong hình sau

1.3.3 Hóa chất của quá trình tách chiết DNA