khảo sát sự methyl hóa tại đảo cpg thuộc vùng promoter của gen rassf1a bằng phương pháp msp trong mẫu bệnh ung thư biểu mô vòm họng ở người việt nam

Đáng chú ý, sự mất biểu hiện hoặc sự biểu hiện bất thường của gen RASSF1A có liên quan đến sự methyl hóa bất thường tại đảo CpG thuộc vùng promoter và có liên quan đến sinh bệnh học của

BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Tên đề tài:

KHẢO SÁT SỰ METHYL HÓA TẠI ĐẢO CpG

THUỘC VÙNG PROMOTER CỦA GEN RASSF1A

BẰNG PHƯƠNG PHÁP MSP TRONG MẪU BỆNH UNG THƯ BIỂU MÔ VÒM HỌNG Ở

NGƯỜI VIỆT NAM KHOA: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: VI SINH-SINH HỌC PHÂN TỬ

CBHD: PGS TS LÊ HUYỀN ÁI THÚY ThS LAO ĐỨC THUẬN SVTH: NGUYỄN THỊ HƯƠNG

MSSV: 1253012147 Khóa: 2012-2016

Bình Dương, tháng 06 năm 2016

biểu mô vòm họng tại phòng thí nghiệm Sinh học phân tử, trường ĐH Mở TP Hồ Chí Minh Bên cạnh, sự tự giác tìm hiểu, sự nỗ lực và phấn đấu của bản thân Để hoàn thành đề tài này, không thể thiếu được sự chỉ bảo, giúp đỡ từ Cô và Thầy hướng dẫn cho em Vì vậy, cho phép em gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến:

Cô - PGS TS Lê Huyền Ái Thúy, người luôn đầy nhiệt huyết với khoa học đã

truyền cho em sự đam mê trong nghiên cứu, góp ý và chỉnh sửa đề tài cho em

Thầy - ThS Lao Đức Thuận, người hướng dẫn và giải thích các vấn đề thắc mắc

cho em trong suốt quá trình thực tập tại phòng Sinh học phân tử Thầy luôn góp ý và chỉnh sửa bài cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài của mình

Các Thầy Cô khoa Công nghệ Sinh học, trường ĐH Mở TP Hồ Chí Minh, những

người đã truyền đạt cho em kiến thức và lý luận nghiên cứu khoa học

Cảm ơn các bạn cùng thực tập tại phòng Sinh học phân tử, các bạn cùng lớp DH12SH01 và DH12VS01 đã cùng đồng hành và chia sẻ với mình trong suốt thời

gian qua

Cuối cùng, Con xin cảm ơn Gia đình mình, những người luôn yêu thương, chăm

sóc, động viên Con trong suốt quá trình học tập

Bình Dương, tháng 6/2016 Nguyễn Thị Hương

MỤC LỤC

MỤC LỤC I DANH MỤC HÌNH IV DANH MỤC SƠ ĐỒ V DANH MỤC BẢNG VI DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT VII ĐẶT VẤN ĐỀ IX

1.1.2.21.1.3 Tình trạng ung thu vòm họng trên thế giới và ở Việt Nam 3

1.1.4 Nguyên nhân gây ung thư vòm họng 3

Yếu tố môi trường 3

1.1.4.1 Virus Epstein Barr (EBV) 4

1.1.4.2 Yếu tố di truyền 4

1.1.4.31.2 Tổng quan về epigenetics 5

1.2.1 Epigenetics 5

1.2.2 Methyl hóa DNA 7

Đảo CpG (Cytosine phosphate guanine dinucleotides) 7

1.2.2.1 Methyl hóa DNA 7

1.2.2.21.2.3 Vai trò của sự methyl hóa DNA 9

1.2.4 Methyl hóa DNA và ung thư 9

1.3 Tổng quan về gen RASSF1A 12

1.3.1 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về sự methyl hóa của gen RASSF1A trong UTVH 12

1.3.2 Vị trí, tên gọi và cấu trúc gen RASS1A trên NST 13

1.3.3 Vai trò và chức năng của gen RASSF1A 15

1.3.4 Sự im lặng của gen RASSF1A và ung thư 22

1.3.5 Sự methyl hóa RASSF1A là một dấu chứng sinh học của ung thư 24

1.4 Phương pháp phát hiện sự methyl hóa DNA 24

1.4.1 Quá trình xử lý DNA bằng sodium bisulfite 24

2.1.3.2 Hóa chất 28

2.1.3.32.2 Phương pháp 29

2.2.1 Khai thác cơ sở dữ liệu 29

2.2.2 Khảo sát in silico 30

Thu nhận trình tự vùng promoter gen RASSF1A, xác định cấu 2.2.2.1trúc gen và đảo CpG 30

Khảo sát, đánh giá bộ mồi cho phản ứng MSP 30 2.2.2.2

2.2.3 Khảo sát thực nghiệm 30

Tách chiết DNA từ các mẫu bệnh 31

2.2.3.1 Xác định độ tinh sạch và nồng độ của DNA sau tách chiết bằng 2.2.3.2phương pháp đo quang phổ 33

Quá trình biến đổi bisulfite DNA bằng bộ kít 34

2.2.3.3 Phương pháp MSP 35

2.2.3.4 Đọc kết quả MSP bằng phương pháp điện di 37

2.2.3.53 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 39

3.1 Kết quả Khai thác dữ liệu 39

3.2 Kết quả khảo sát in silico 49

3.2.1 Khảo sát in silico gen RASSF1A 49

3.2.2 Thu nhận trình tự gen RASSF1A và xác định vùng promoter cần khảo sát 49

Hình 1.5 Chức năng của các DNA methyltransferase và demethylase

Hình 1.6 Sự im lặng của gen do epigenetic trong suốt quá trình hình thành khối u Hình 1.7 Sự methyl hóa DNA ở promoter làm im lặng sự biểu hiện gen bằng các cơ

chế khác nhau

Hình 1.8 Vị trí gen RASSF1A trên nhiễm sắc thể số 3

Hình 1.9 A: Bản đồ của gen RASSF1; B: Cấu trúc phân tử protein RASSF1A

Hình 1.10 Sự tương tác và chức năng ức chế khối u của RASSF1A

Hình1.11 RASSF1A điều hòa apoptosis thông qua con đường tín hiệu thụ thể chết Hình 1.12 Sự ức chế hoạt động của APC/C trong suốt chu kì tế bào

Hình 1.13 Sự im lặng của gen RASSF1A gián tiếp qua HOXB3

Hình 1.14 Quá trình biến đổi bisulfite của DNA Hình 1.15 Phương pháp MSP

Hình 2.1 Chu kì nhiệt của phản ứng MSP đối với hai cặp mồi gen RASSF1A

Hình 3.1 Biểu đồ tần số methyl hóa và tần số methyl hóa trung bình có trọng số

của gen RASSF1A trong tế bào ung thư vòm họng và tế bào bình thường

Hình 3.2 Biểu đồ tần số methyl hóa và tần số methyl hóa trung bình có trọng số của

gen RASSF1A trên các loại mẫu bệnh ung thư vòm họng khác nhau Hình 3.3 Vị trí gen RASSF1A trên nhiễm sắc thể số 3

Hình 3.4.Trình tự của gen RASSF1A theo mã số truy cập DQ 444 319

Hình 3.5.A: Biểu đồ thể hiện vị trí các đảo CpG trên trình tự khảo sát B: trình tự promoter chứa đảo CpG, vị trí bắt cặp mồi unmethyl, mồi methyl và vị trí nhận biết của các nhấn tố phiên mã

Hình 3.6 Kết quả bắt cặp của mồi xuôi và mồi ngược methyl trên vùng promoter

gen RASSF1A đã biến đổi bisulfite

Hình 3.7 Kết quả bắt cặp của mồi xuôi và mồi ngược không methyl trên vùng

promoter gen RASSF1A đã biến đổi bisulfite

Hình 3.8 Kết quả sản phẩm MSP với cặp mồi M_RASSF1A _F, R trên 10 mẫu DNA đã biến đổi bisulfite

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 1 Quy trình thực nghiệm tổng quát của nghiên cứu

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Nồng độ và thể tích các chất trong lysis buffer

Bảng 2.2 Mồi methyl và unmethyl của gen RASSF1A trong phản ứng MSP

Bảng 2.3 Thành phần phản ứng MSP

Bảng 3.1 Tần số methyl hóa của gen RASSF1A, phương phát phát hiện, loại mẫu sử

dụng trong 17 nghiên cứu khảo sát được

Bảng 3.2 Bảng tần số methyl hóa trung bình có trọng số của gen RASSF1A ở bệnh

ung thư vòm họng phân theo loại tế bào

Bảng 3.3 Các phương pháp phát hiện sự methyl hóa được sử dụng trong 17 nghiên cứu đã khảo sát

Bảng 3.4 Loại mẫu được sự dụng trong 17 công trình nghiên cứu được khảo sát

Bảng 3.5 Tần số methyl hóa trung bình có trọng số của gen RASSF1A ở bệnh ung

thư vòm họng phân theo loại mẫu

Bảng 3.6 Kết quả khảo sát các đặc tính vật lý của hai cặp mồi khảo sát bằng chương trình IDT

Bảng 3.7 Nồng đồ và độ tinh sạch của DNA sau tách chiết

Bảng 3.8 Kết quả sơ bộ của phương pháp MSP trên 10 mẫu nghiên cứu

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

C1 Protein kinase C conserved region 1 C19ORF5 Chromosome 19 open reading frame 5 COBRA Combined bisulfite restriction analysis CpG Cytosine-phosphate-guanine dinucleotides

M_RASSF1A_F Mồi xuôi methyl RASSF1A M_RASSF1A_R Mồi ngược methyl RASSF1A

MAP1 Modulator of apoptosis 1

MAP1B The microtubule-associated protein 1B MAPK Mitogen-activated protein kinase

reaction

PMCA4b Plasma membrane calmodulin-dependent calcium ATPase 4b

RASSF RAS-association domain family

RASSF1A Ras association domain family 1 isoform A

SAM S-adenosyl-L-methionine

TRAIL TNFα-related apoptosis-inducing ligand U_RASSF1A_F Mồi xuôi unmethyl RASSF1A

U_RASSF1A_R Mồi ngược unmethyl RASSF1A

ĐẶT VẤN ĐỀ

Tại Việt Nam, theo thống kê của Globocan 2012, ung thư vòm họng (UTVH) được xếp là một trong năm loại ung thư phổ biến ở nam giới Ung thư vòm họng là một khối u biểu mô của khoang mũi - họng, hiếm gặp ở hầu hết các khu vực trên thế giới, với tỷ lệ mắc bệnh hằng năm, trên toàn cầu ít hơn 1/100,000 người Tuy nhiên, UTVH lại phổ biến ở khu vực phía Nam Trung Quốc, Nam Á với tỷ lệ mắc bệnh hằng năm là 30 - 50 người trên 100,000 người Hiện nay, trên thế giới có nhiều công trình nghiên cứu cho thấy sự phát triển của UTVH là một quá trình gồm nhiều giai đoạn, liên quan đến nhiều yếu tố như sự xâm nhiễm của virus Epstein - Barr, các yếu tố môi trường và di truyền Các công trình nghiên cứu chủ yếu tiếp cận hướng phân tích sự methyl hóa bất thường ở vùng promoter của các gen ức chế

khối u như p16Ink4a, Rb, RBSP3, Blu, RASSF1A và sử dụng nó như một dấu chứng

sinh học cho việc chẩn đoán UTVH

Đã có rất nhiều công trình nghiên cứu phân tích sự methyl hóa bất thường tại

vùng promoter của gen RASSF1A trong UTVH Một số công trình nghiên cứu tiêu

biểu như Kwok- Wai Lo và cộng sự (2001), Fendri A và cộng sự (2009), Nawaz I và cộng sự (2015), … Qua các nghiên cứu tiêu biểu này, cho thấy tần số methyl hóa

của gen RASSF1A khá cao trong UTVH Sự methyl hóa ở vùng promoter đóng một

vai trò thiết yếu trong việc làm mất chức năng của các gen ức chế khối u Đáng chú

ý, sự mất biểu hiện hoặc sự biểu hiện bất thường của gen RASSF1A có liên quan

đến sự methyl hóa bất thường tại đảo CpG thuộc vùng promoter và có liên quan đến sinh bệnh học của nhiều loại ung thư, bao gồm ung thư vòm họng, ung thư tuyến tiền liệt, ung thư phổi không tế bào nhỏ, ung thư vú và các ung thư khác

Trong tế bào bình thường, gen RASSF1A là một gen ức chế khối u, nó mã

hóa tạo ra protein RASSF1A, có khả năng điều chỉnh một loạt các chức năng sinh học quan trọng trong tế bào như điều hòa các vi ống, duy trì sự ổn định của bộ gen, kiểm soát chu kì tế bào và điều hòa apoptosis, … Theo Wang T (2009), qua nghiên

cứu in vitro cho thấy RASSF1A có thể ức chế sự hình thành khối u thông qua sự

ngưng chu kì tế bào ở pha G0/G1 và gây ra apoptosis theo con đường phụ thuộc Ras

Tuy nhiên, ở các tế bào ung thư, gen RASSF1A bị methyl hóa vượt mức tại đảo CpG thuộc vùng promoter, làm quá trình phiên mã của gen RASSF1A im lặng, dẫn

đến RASSF1A không được tạo thành và làm mất chức năng điều hòa các con đường tín hiệu, tăng sinh của tế bào và dẫn đến sự tạo u Do đó, tính trạng methyl

hóa của gen RASSF1A được xem là một dấu chứng sinh học rất hữu ích cho chẩn

đoán sớm và tiên lượng UTVH đầy tiềm năng

Thế nhưng, ở Việt Nam, chưa có công trình nghiên cứu tiêu biểu nào liên quan đến việc sử dụng sự methyl hóa bất thường tại đảo CpG thuộc vùng promoter

của gen RASSF1A vào trong chẩn đoán sớm ung thư vòm họng Vì vậy, chuyên đề

khóa luận tốt nghiệp được thực hiện với tên đề tài: “Khảo sát sự methyl hóa tại

đảo CpG thuộc vùng promoter của gen RASSF1A bằng phương pháp MSP

trong mẫu bệnh ung thư biểu mô vòm họng ở người Việt Nam” Kết quả đề tài

sẽ cung cấp cơ sở lý thuyết khoa học trên cả in silico và thực nghiệm về đặc điểm đảo CpG và vùng promoter của gen RASSF1A, vị trí bắt cặp tốt nhất cho các cặp

mồi dùng cho phản ứng MSP, xây dựng quy trình MSP Đặc biệt là xác định tần số

methyl hóa của gen RASSF1A trong các mẫu bệnh phẩm UTVH ở Việt Nam Đóng

góp của đề tài sẽ là bước khởi đầu cho một nghiên cứu lớn, nhằm tìm ra dấu chứng sinh học tiềm năng cho chẩn đoán sớm và tiên lượng bệnh UTVH ở Việt Nam Trong giới hạn của đề tài, nghiên cứu tập trung thực hiện những mục tiêu chính sau:

− Khảo sát in silico, thu nhận vùng promoter của gen RASSF1A và xác định được

các vị trí CpG “hot spot” mà sự methyl hóa tại các vị trí này sẽ ảnh hưởng đến

quá trình phiên mã của gen RASSF1A

− Kế thừa và đánh giá lại cặp mồi methyl và unmethyl đặc hiệu cho phản ứng MSP giúp đánh giá mức độ methyl hóa tại các vị trí CpG thuộc vùng promoter

gen RASSF1A

− Xây dựng quy trình tách chiết DNA từ mẫu mô bệnh UTVH và quy trình MSP

để đánh giá mức độ methyl hóa gen RASSF1A trên các mẫu bệnh UTVH ở Việt Nam

Hình 1.1 Cấu tạo họng [61]

1.1.2 Định nghĩa, triệu chứng, phân loại ung thư vòm họng

Định nghĩa, triệu chứng 1.1.2.1

Ung thư vòm họng (UTVH) là một khối u biểu mô ác tính, khởi phát từ niêm mạc của khoang mũi họng [8, 53] Những bệnh nhân ở giai đoạn đầu của bệnh thường không có triệu chứng bị bệnh hoặc xuất hiện với các triệu chứng bình thường [8]

Triệu chứng phổ biến nhất trong ung thư vòm họng là hạch cổ (neck lump) Ngoài ra, UTVH còn có các triệu chứng ở mũi như: đờm có lẫn máu, ngạt mũi, chảy dịch mũi và những triệu chứng ở tai như ù tai, viêm tai, mất khả năng nghe Đồng thời, thường xuyên đau đầu [35]

Hố Rosenmuller của vòm họng và vòi Eustachian là vị trí khởi đầu phổ biến nhất của ung thư vòm họng [8, 35] UTVH thường lan truyền bằng mạch bạch huyết đến các hạch bạch huyết ở cổ UTVH có thể lan truyền thông qua đường máu để đến những vị trí xa như xương, phổi và gan [8]

Phân loại ung thư vòm họng 1.1.2.2

Ung thư vòm họng là một loại ung thư đặc biệt của ung thư cổ và đầu [35] Năm 1978, Tổ chức Y Tế Thế Giới (WHO) đã đưa ra sự phân loại dựa vào mô bệnh học, phân chia ung thư vòm họng thành 3 loại Loại I là ung thư biểu mô tế bào vảy hóa sừng (keratinizing squamous cell carcinoma) Loại II là ung thư biểu mô không hóa sừng (nonkeratinizing carcinoma) và loại III là ung thư biểu mô không biệt hóa (undifferentiated carcinoma) [9, 12, 35]

UTVH có khác biệt rõ ràng về sự phân bố địa lý và theo dân tộc [35] UTVH phân bố ở hầu hết các khu vực trên thế giới, nhưng phổ biến nhiều ở các khu vực như Đông Nam Á, các nước Bắc Phi (Algeria, Morocco và Tunisia) và vùng phía Bắc của Bắc Mỹ và Greenland (Đan Mạch) [7, 53]

Ở Đông Nam Á, dân cư gồm nhiều loại khác nhau và có nguy cơ mắc bệnh UTVH khác nhau Giống như các nước khác trong khu vực Đông Nam Á, Trung Quốc là nước có nhiều loại người chung sống với nhau như người Hokkien và nhiều loại người khác của Trung Quốc có nguồn gốc từ tỉnh Fujian Những vùng đặc hữu như phía Nam Trung Quốc, theo thống kê của WHO, UTVH loại III chiếm hơn 97% [35] Tỉnh Quảng Đông có nguy cơ mắc UTVH cao gấp 2 lần so với các tỉnh khác ở Trung Quốc và các nước khác

So với Trung Quốc, các nước như Thái Lan, Việt Nam, Malaysia và Philippin cũng được biết là các nước có nguy cơ mắc UTVH ở mức trung bình đến mức cao, có khoảng biến thiên của xuất độ chuẩn hóa theo tuổi (ASR) từ 2,5 đến 15 đối với nam giới [7]

1.1.3 Tình trạng ung thu vòm họng trên thế giới và ở Việt Nam

Theo thống kê của Globocan năm 2012, trên toàn thế giới, ung thư vòm họng có 86691 trường hợp mắc bệnh, chiếm 0,6% và xuất độ chuẩn hóa theo tuổi là 1,2 Tỷ lệ tử vong là 50831 trường hợp, chiếm 0,6% và ASR là 0,7 Ước tính đến năm 2017, số ca mắc bệnh tăng lên tới 228698 ca ở cả nam và nữ trên toàn thế giới, chiếm 0,7%

Tại Việt Nam, UTVH được xếp là một trong năm loại ung thư phổ biến ở nam giới theo thống kê của Globocan 2012 Trong đó, số ca mắc bệnh là 3301 ca, chiếm 4,7%, có chỉ số ASR 7,7 và có 1931 ca tử vong, chiếm 3,3%, có ASR là 4,8 Ở nữ giới, số ca tử vong là 954 ca, chiếm 2,7% và có ASR là 2 Có 1630 trường hợp mắc bệnh, chiếm 3% và ASR là 3,4

1.1.4 Nguyên nhân gây ung thư vòm họng

Sự phát triển của UTVH là một quá trình gồm nhiều giai đoạn, liên quan đến nhiều yếu tố gây bệnh, trong đó có 3 yếu tố chính: yếu tố môi trường, sự xâm nhiễm của Epstein – Barr virus, di truyền [9, 12, 35, 50]

Yếu tố môi trường 1.1.4.1

Nhiều nghiên cứu cho thấy, ở Trung Quốc, Greenland và Tunisia, điều kiện kinh tế xã hội thấp (nơi ở đông đúc, thiếu sự thông khí, vệ sinh kém, lối sống) có sự liên kết với bệnh UTVH [9] Đáng chú ý nhất là lối sống, việc sử dụng cá muối và các thực phẩm truyền thống bảo quản lâu ngày có chứa hợp chất N-nitrosamine - một yếu tố gây UTVH chủ yếu [9, 35]

Ở Việt Nam, đặc biệt ở các vùng có thói quen sử dụng nhiều cá muối, cá khô, tương và các thực phẩm muối chua lâu ngày (nhất là miền Nam) đều có nguy cơ mắc UTVH cao, do các loại thực phẩm này chứa nhiều hợp chất N-nitrosamine – chất gây ung thư Hơn nữa, độ tuổi sử dụng cá muối, cách chế biến và loại cá sử dụng là những yếu tố quan trọng liên quan đến nguy cơ mắc UTVH [35]

Qua thử nghiệm cho thấy việc sự dụng cá muối ở giai đoạn thiếu nhi làm tăng nguy cơ bị UTVH ở Nam Trung Quốc, trong khi sự tiêu thụ cá muối ở giai đoạn người trưởng thành thì không tăng nguy cơ bị UTVH [9, 35] Ngoài độ tuổi sử dụng, loại cá cũng quan trọng như cá biển muối chứa nguy cơ mắc bệnh UTVH cao hơn cá nước ngọt… Những thử nghiệm trên chuột, cho thấy những khối u ở mũi và vòm họng đã xuất hiện ở chuột sử dụng cá muối Trung Quốc [35]

Tóm lại, do chế độ dinh dưỡng, việc sử dụng cá muối và các thực phẩm truyền thống bảo quan lâu ngày, chúng tác động như các chất gây ung thư, gây nên những tổn thương di truyền trong các tế bào biểu mô vòm họng Bên cạnh đó, việc dụng thuốc lá, rượu, các chất độc hại khác, khi tiếp xúc với các chất thải công nghiệp và lượng khói… cũng là một trong số các yếu tố dẫn đến việc hình thành UTVH [9, 35]

Virus Epstein Barr (EBV) [7].1.1.4.2

Virus Epstein Barr là một trong những nguyên nhân gây UTVH EBV là một

loại Herpes virus, có DNA mạch đôi, dạng thẳng, xâm nhiễm hơn 90% dân số trên

toàn thế giới và sống lâu dài trong tế bào vật chủ Trong hầu hết các trường hợp, EBV tồn tại ở dạng tiềm tàng trong các tế bào bạch huyết máu ngoại vi nên không ảnh hưởng nghiêm trọng, khi có điều kiện, EBV bắt đầu hoạt động và có thể góp phần vào sự tạo thành một vài khối u ác tính [7]

Sau khi xâm nhiễm, EBV có thể làm giảm sự điều hòa của một loạt các protein quan trọng liên quan đến sự chết theo chương trình của tế bào (apoptosis), điểm kiểm soát chu kì tế bào, sự di căn và hoạt đông như một tác nhân kích thích khối u hơn là một yếu tố khởi đầu của quá trình hình thành ung thư [7]

Yếu tố di truyền 1.1.4.3

Trong suốt quá trình tiến triển của UTVH, sự bất thường của nhiễm sắc thể (NST) như việc lặp đoạn, mất đoạn NST xảy ra ở giai đoạn sớm của UTVH Mất đoạn nhiễm sắc thể ở nhánh 3p được xác định là sự bất thường trong UTVH và được xem như là một sự kiện sớm của bộ gen liên quan đến sự phát triển của UTVH

[7] Sự gián đoạn của các gen ức chế khối u định vị ở 3p, 9p là rất quan trọng trong

suốt giai đoạn khởi đầu của UTVH, bao gồm các gen CDKN2A, CDKN2B ở vị trí 9p21 và RASSF1A, ZMYDN10/ BLU ở vị trí 3p21.3 [7] Bên cạnh đó, việc mất DNA bộ gen hay đột biến xảy ra trong suốt quá trình phát sinh bệnh UTVH, cũng là một cơ chế chính, đại diện cho sự bất hoạt của các gen ức chế khối u [12, 26] Trong nhiều trường hợp, việc mất đoạn của gen ức chế khối u được xác định như những dấu chứng chỉ thị trong tiên lượng và chẩn đoán ung thư [12]

Sự im lặng của những gen ức chế khối u do sự biến đổi epigenetics là một cơ chế chủ yếu gây bất hoạt của các gen liên quan đến ung thư Đặc biệt sự methyl hóa của vùng promoter đóng một vai trò thiết yếu trong việc làm mất chức năng của các gen ức chế khối u [15] Trong UTVH, sự methyl hóa vượt mức bất thường ở vùng

promoter của gen RASSF1A xảy ra thường xuyên và sự bất hoạt biểu hiện gen của hai gen ức chế khối u p16Ink4a, RASSF1A được xác định ở tần số cao [32] Sự bất hoạt

của gen RASSF1A có mối liên quan với sự methyl hóa vượt mức tại đảo CpG thuộc vùng promoter của gen RASSF1A Mối tương quan trực tiếp giữa sự methyl hóa vùng promoter và sự mất biểu hiện của gen RASSF1A đã được tìm thấy trong nhiều

loại ung thư, bao gồm ung thư vòm họng, ung thư phổ tế bào nhỏ, ung thư phổi không tế bào nhỏ, ung thư thận, ung thư vú, buồng trứng và nhiều loại ung thư khác nữa [2]

1.2 TỔNG QUAN VỀ EPIGENETICS 1.2.1 Epigenetics

Epigenetics được định nghĩa là những thay đổi có tính di truyền trong biểu hiện gen, nhưng không liên quan đến những thay đổi trong trình tự DNA [16, 29, 36, 42, 43, 49]

Theo Davies P F và cộng sự (2014), sự biến đổi epigenetic có tính ổn định và di truyền (hình 1.2)

Hình 1.2 Sự bán bảo tồn của kiểu methyl hóa DNA đối xứng thông qua quá trình sao chép DNA [13]

Chú thích: Trong suốt quá trình phát triển phôi ở giai đoạn sớm, sự methyl hóa

DNA được thực hiện bởi các enzyme DNA methyltransferase nhóm de novo

DNMT3A, DNMT3B Sau mỗi chu kì sao chép DNA, enzyme DNA methyltransferase duy trì DNMT1 tiến hành sao chép kiểu methyl hóa CpG từ chuỗi DNA của bố mẹ truyền sang chuỗi DNA con

Những cơ chế điều hòa chủ yếu của epigenetic là sự methyl hóa DNA (methyl hóa vượt mức, giải methyl hóa), sự biến đổi histone (acetyl hóa, methyl hóa), tổ chức lại chất nhiễm sắc và sự điều hòa sau phiên mã bởi các RNA ngắn và dài (chủ yếu là các microRNA và RNA dài không mã hóa (hình 1.3) [16, 30, 42, 49]

Hình1.3 Sơ đồ cơ chế điều hòa của epigenentics [30]

Theo Vaissie`re T và cộng sự (2008), những cơ chế của epigenetics rất cần thiết cho sự phát triển, biệt hóa tế bào và sự bảo vệ chống lại các bộ gen của virus ký sinh Tuy nhiên, sự mất điều hòa của các cơ chế epigenetic có liên quan đến nhiều bệnh khác nhau ở người, đáng chú ý là ung thư [49]

1.2.2 Methyl hóa DNA

Đảo CpG (Cytosine phosphate guanine dinucleotides) 1.2.2.1

Trong bộ gen người, có 1% chứa vùng DNA giàu CpG - được gọi là đảo CpG CpG có nghĩa là nucleotide C gắn với nucleotide G bằng liên kết phosphodiester [16, 29] Đảo CpG phải có độ dài lớn hơn 200 bp và có %GC ít nhất 55% [29] Các đảo CpG thường được tìm thấy trong vùng promoter của gen và có khoảng gần 40 - 50% các promoter của hầu hết gen người chứa đảo CpG [16, 29] Một phần của các đảo CpG (chiếm khoảng 37%) định vị ở đầu 5’ vùng promoter của các gen [38] Khoảng 70% các gen có chứa đảo CpG trong vùng -2 kb đến +1 kb của vị trí khởi đầu phiên mã của chúng [38]

Methyl hóa DNA 1.2.2.2

Hiện tượng methyl hóa DNA là một quá trình xảy ra ngay lập tức sau qua trình sao chép DNA và được hoàn thành trong khoảng 1 phút sau khi hoàn thành quá trình sao chép [43] Sự methyl hóa DNA là hiện tượng gắn một nhóm methyl (-CH3) vào vị trí carbon số 5 trong vòng pyrimidine của một phân tử cystosine (5’C) để hình thành 5-methylcytosine (5mC) Quá trình methyl hóa DNA được xúc tác bởi emzym DNA methyltransferase (DNMTs) (hình 1.4) [16, 43, 49]

Hình 1.4 Cơ chế của sự methyl hóa DNA[21]

DNMTs là một hệ enzyme xúc tác sự vận chuyển nhóm methyl (-CH3) từ một phân tử cho như S - adenosyl methionine (SAM) đến vị trí carbon số 5 của vòng pyrimidine của một cytosine (hình 1.4) [27] Ở động vật có vú, đã phát hiện ra có 5 thành viên của họ enzyme DNA methyltransferase liên quan đến sự methyl hóa của các vị trí CpG, đó là DNMT1, DNMT2, DNMT3A, DNMT3B và DNMT3L [6, 21, 43] Trong đó, ba loại DNMT1, DNMT3A, DNMT3B là tham gia trực tiếp và đóng vai trò chủ yếu trong việc thúc đẩy sự methyl hóa [16]

DNMTs gồm có 2 nhóm

là: nhóm de novo methyltransferase và nhóm methyltranferase duy trì [16, 43, 49] Nhóm enzyme methyltranferase duy trì (mammalian DNA methyltransferases) phổ biến trong tế bào là DNMT1 Theo Davies P F và cộng sự (2014), DNMT1 chịu trách nhiệm duy trì sự methyl hóa trong suốt quá trình phân

bào của tế bào soma và DNMT1 sử dụng để làm tăng hoạt tính methyl hóa de novo

trong giai đoạn phân chia phôi [16]

Nhóm de novo methyltransferase gắn thêm nhóm methyl (-CH3) vào cystosine hình thành 5-methylcytosine (5mC) tạo vị trí methyl hóa mới (hình 1.5)

5-DNMT3A, DNMT3B thuộc nhóm này, điều hòa sự methyl hóa de novo trong suốt

quá trình phát triển của phôi [16, 38] Một enzyme khác, DNMT3L thiếu hoạt tính xúc tác, bị bất hoạt nhưng nó lại quan trọng cho sự ổn định của DNMT3A và có liên kết

với các phức hợp trong suốt sự methyl hóa de novo trong tế bào mầm [16]

Hình 1.5 Chức năng của các DNA methyltransferase và demethylase [46]

Những emzym DNMTs có vai trò điều hòa sự methyl hóa DNA Sự biểu hiện vượt mức của tất cả các loại DNMTs ở mức độ mRNA đã biểu hiện trong một số loại ung thư [40] Trong các tế bào bình thường, sự tăng biểu hiện của DNMT1 là

nguyên nhân dẫn đến sự methyl hóa de novo bất thường ở đảo CpG, thúc đẩy sự

biến đổi tế bào và dẫn đến sự hình thành ung thư [40]

1.2.3 Vai trò của sự methyl hóa DNA

Sự methyl hóa DNA (sự methyl hóa cytosine) là một cơ chế cần thiết cho sự phát triển bình thường của các sinh vật bao gồm thực vật và động vật [49] Sự methyl hóa có thể kiểm soát sự biểu hiện gen ở động vật có xương sống và đóng vai trò thiết yếu trong quá trình phát triển bình thường của tế bào, của phôi [38, 43] Sự methyl hóa thường liên quan đến sự im lặng phiên mã của gen, điều hòa sự biểu hiện của gen dấu vết và một số gen ức chế khối u trong ung thư và liên quan đến sự im lặng của các gen định vị trên NTS X [38, 43] Trong suốt quá trình phát triển phôi hoặc quá trình biệt hóa tế bào, trạng thái methyl luôn được điều hòa [32] Do đó, sự methyl hóa bất thường (việc giảm sự methyl hóa cũng như sự methyl hóa vượt mức) có thế góp phần hình thành các bệnh, đáng chý ý là ung thư [36].

1.2.4 Methyl hóa DNA và ung thư

Sự rối loạn điều hòa epigenetics là trung tâm để khởi xướng và tiến triển của một số ung thư Những cơ chế epigenetics trong tế bào ung thư bao gồm những biến đổi bất thường của histone và sự methyl hóa DNA bất thường [36] Sự methyl hóa DNA bất thường là sự giảm methyl hóa DNA (DNA hypomethylation) và sự methyl hóa DNA vượt mức (DNA hypermethylation) ở vùng đảo CpG [36]

Trong tế bào bình thường, đảo CpG hầu như không bị methyl hóa, không đóng vai trò quan trọng trong kiểm soát sự phiên mã của gen [29] Tuy nhiên, khi các đảo CpG ở gần vùng promoter hoặc tại vùng promoter xảy ra sự methyl hóa thì dẫn đến kết quả cuối cùng là làm im lặng gen (hình 1.6) [16, 29]

Hình 1.6 Sự im lặng của gen do epigenetic trong suốt quá trình hình thành khối u [49]

Qua hình 1.6 cho biết, khi một gen biểu hiện ở mô bình thường, đảo CpG ở vùng promoter chủ yếu không bị methyl hóa và histon tại NST đó bị acetyl hóa Trong quá trình hình thành khối u từ mô bình thường sang tiền khối u và tới giai đoạn khối u, dần dần xảy ra sự khử acetyl hóa ở đuôi histon và lan truyền sự methyl hóa cytosine ở các đảo CpG, hai quá trình này đi kèm với nhau, làm giảm sự biểu hiện gen và tiến dần đến sự mất biểu hiện gen

Sự giảm methyl hóa (hypomethylation) chủ yếu xảy ra ở các vị trí CpG định vị ở các trình tự DNA lặp lại [ 29, 36], xảy ra phổ biến trong nhiều ung thư như ung thư tuyến giáp, ung thư vú, ung thư cổ tử cung, [36]

Một số cơ chế của sự giảm methyl hóa có thể dẫn đến ung thư

Thứ nhất là sự giảm methyl hóa ở đảo CpG của vùng promoter có thể làm tăng sự biểu hiện của gen, hoạt hóa các gen tiền ung thư (proto-oncogenes) và thúc đẩy sự biểu hiện của các gen gây ung thư (oncogenes) [29, 36] Các gen gây ung thư mã hóa tạo protein, khi mà có đột biến hoặc sự biểu hiện vượt mức của protein thì làm biến đổi một tế bào bình thường thành một tế bào ung thư [29]

Thứ hai, việc giảm sự methyl hóa DNA làm thúc đẩy sự tái sắp xếp bất thường của NST trong suốt quá trình phân bào, điều này có thể làm tăng khả năng mất gen [29] Do đó, sự giảm methyl hóa DNA có thể làm giảm sự ổn định của bộ gen và dẫn đến kết quả cuối cùng là hình thành và phát triển khối u [21]

Sự methyl hóa DNA vượt mức (DNA hypermethylation) có thể làm bất hoạt các gen ức chế khối u và góp phần hình thành và phát triển ung thư [29, 36] Một số

gen ức chế khối u bị im lặng do sự methyl hóa vượt mức tại đảo CpG như VHL,

p16Ink4a, hMLH 1 [29] Sự methyl hóa vượt mức làm kìm hãm hoạt động của các gen sửa chữa DNA, đây là môi trường lý tưởng để lan truyền các đột biến DNA và biến đổi tế bào [29] Ngoài ra, sự methyl hóa vượt mức có liên quan đến sự im lặng của các gen liên quan đến kiểm soát chu kỳ tế bào, apoptosis, các gen giải độc và gen chuyển hóa Cholesterol [36]

Sự methyl hóa DNA vượt mức ở các đảo CpG thuộc vùng promoter có xu hướng làm im lặng gen, do các cytosine bị methyl hóa có khả năng gắn vào các họ protein liên kết với 5’mC như MeCP1, MeCP2, MBD1, MBD2, MBD3 và MBD4, điều này “khóa” các yếu tố phiên mã gắn vào vùng promoter của gen, vì thế ức chế sự phiên mã của gen (hình 1.7) [29, 36]

Đồng thời, sự liên kết với những protein MeCPs và MBDs trên, giúp thu hút và gắn bổ sung các phức hợp làm bất hoạt chất nhiễm sắc bao gồm deacetylase (HDACs) và histone methyltransferase (HMTs) vào các đoạn trình tự bị methyl hóa và thúc đẩy sự cô đặc của chất nhiễm sắc, dẫn đến làm bất hoạt sự phiên mã (hình 1.7) [36, 46] Sự methyl hóa DNA còn can thiệt vào sự liên kết của một số yếu tố phiên mã Do đó, nó ức chế sự phiên mã, làm bất hoạt các gen ức chế khối u và góp phần vào sự phần khởi xướng, tiến triển tạo u và hình thành ung thư [21, 29]

Hình 1.7 Sự methyl hóa DNA ở promoter làm im lặng sự biểu hiện gen bằng các cơ chế khác nhau [46]

Chú thích: Cơ chế đầu tiên, sự can thiệt vào sự liên kết của các yếu tố phiên mã (phía trên bên phải) Cơ chế thứ hai liên quan đến sự bổ sung các enzyme biến đổi chất nhiễm sắc và thiết lập sự bất hoạt của chất nhiễm sắc (phần phía dưới bên phải) AC: sự acetyl hóa histon, mũi tên ngang: sự phiên mã, MeCP2 là một protein liên kết với 5’mC, HDAC: là enzyme khử sự acetyl hóa histon, SUV39 là một ezyme methyltrasferase histon, Sin3A là chất kìm hãm (a co-repressor), HPI là một protein liên kết với histon bị methyl hóa

1.3 TỔNG QUAN VỀ GEN RASSF1A

1.3.1 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về sự methyl hóa của

gen RASSF1A trong UTVH

Hiện tượng methyl hóa DNA vượt mức thuộc vùng promoter của gen

RASSF1A được xem như là một dấu chứng sinh học cho việc chẩn đoán ung thư

Hiện nay, trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về sự methyl của gen này trong ung thư vòm họng (UTVH)

Một số nghiên cứu tiêu biểu như nghiên cứu của Kwok- Wai Lo và cộng sự

(2001), đã nghiên cứu về sự methyl vượt mức ở vùng promoter của gen RASSF1A

trên 21 mẫu mô của các bệnh nhân UTVH giai đoạn đầu, đã xác định tần số methyl

hóa của gen RASSF1A trong 21 mẫu này là 66,7%, không xảy ra sự methyl hóa ở

mẫu mô vòm họng bình thường [31] Năm 2005, Zhou L và cộng sự đã nghiên cứu

về tần số methyl hóa của gen RASSF1A, kết quả thu được dựa vào sự phân chia theo vị trí lấy mẫu, tại vị trí ung thư vòm họng, tần số methyl hóa RASSF1A chiếm 82%, ở vị trí xung quanh cách khối u 0,5 cm tần số methyl hóa RASSF1A là 75%, cách vị

trí khối u 1,0 cm là 46% Theo Fendri A và cộng sự (2009) nghiên cứu về sự

methyl hóa RASSF1A trên 68 mẫu sinh thiết UTVH ở giai đoạn đầu thì đã xác định được tần số methyl hóa của các gen từ 88% của cả hai gen RARβ2và DAP-kinase đến 91% của gen RASSF1A [22] Ngoài ra, còn nhiều công trình nghiên cứu tiêu biểu khác trên thế giới như Thian-Sze Wong và cộng sự (2004) [47], Wang T và cộng sự (2009) [50], Zhi-Gang Pan và cộng sự (2005) [55], Challouf S và cộng sự (2012) [10], Zhang Z và cộng sự (2012) [54], Nawaz I và cộng sự (2015) [39], cũng nghiên cứu

về tần số methyl hóa của gen RASSF1A trên các loại mẫu UTVH khác nhau

Ở Việt Nam, chỉ tìm thấy được công trình nghiên cứu của Lê Thanh Hà và cộng sự (2012), công trình nghiên cứu về “Khảo sát đặc điểm phân tử của gen

LMP-1 của virus Epstein-Barr và liên quan methyl hóa của gen RASSF1A trên bệnh

nhân ung thư vòm họng ở Việt Nam”, được đăng trên Tạp chí Y học thực hành, số 849/850, trang 128-133 vào năm 2012 Kết quả của công trình này xác định được 12 mẫu (chiếm 80%) có sự methyl hóa tại các đảo CpG thuộc vùng promoter của

gen RASSF1A trong 15 mẫu bệnh phẩm UTVH [1]

1.3.2 Vị trí, tên gọi và cấu trúc gen RASS1A trên NST

RASSF1A có tên gọi đầy đủ là Ras association domain family 1 isoform A,

được gọi với các tên khác như: 123F2, NORE2A, RAD32, REH3P21, định vị tại vị

trí 21.3 trên nhánh ngắn của nhiễm sắc thể số 3 thuộc bộ gen người (hình 1.8) [ 63, 62]

Hình 1.8 Vị trí gen RASSF1A trên nhiễm sắc thể số 3 [62]

Gen RASSF1 có độ dài 11151 bp, có 8 exon, tạo ra 8 vùng phiên mã khác nhau và được đặt tên từ RASSF1A đến RASSF1H thông qua việc sử dụng các

promoter khác nhau và sự ghép nối xen kẽ của các exon [2, 18] Hai isoform chính

của gen RASSF1 là RASSF1A và RASSF1C được sao chép từ 2 vùng promoter ở các

đảo CpG riêng lẻ [15, 18, 26] Trong đó, RASSF1A có các exon 1α, 2αβ, 3, 4, 5 và 6, mã

hóa cho một chuỗi polypeptide ngắn với 340 amino acid với trọng lượng phân tử khoảng 39 kDa (hình 1.9) [15, 26, 34]

Hình 1.9 A: Bản đồ của gen RASSF1 [57]

; B: Cấu trúc phân tử protein RASSF1A[18]

Chú thích hình A: Hình vuông màu xám: exon 1α, hình chữ nhật màu xanh lá: exon 1β, hình chữ nhật màu xanh dương: exon 2αβ, hình chữ nhật màu vàng: exon 2γ, các hình chữ nhật màu nâu: exon 3, 4, 5 và 6 Các mũi tên là những vị trí bắt đầu sự

phiên mã Các CpG: vị trí của các đảo CpG RASSF1A và RASSF1B lần lượt bắt đầu từ exon 1α và exon 1β Exon thứ hai (exon 2αβ) là exon chung của cả RASSF1A và

RASSF1B Exon 2γ là exon đầu tiên của RASSF1C và chỉ hiện diện ở RASSF1C

Chú thích hình B: C1: conserved region 1 DAG: diacylglycerol/phorbol ester binding domain – domain gắn ester diacylglycerol/phorbol ATM: ATM–kinase consensus phosphorylation sequence ; RA: RalGDS/AF6 Ras association domain – domain liên kết Ras RalGDS/AF6 SARAH: Sav/RASSF/Hpo interaction Domain – domain tương tác với Sav/RASSF/Hpo

1.3.3 Vai trò và chức năng của gen RASSF1A

Trong tế bào bình thường, gen RASSF1A là một gen ức chế khối u, nó mã

hóa tạo ra protein RASSF1A, có khả năng điều chỉnh một loạt các chức năng tế bào cần thiết cho sự kiểm soát phát triển bình thường như điều hòa các vi ống, duy trì sự ổn định của bộ gen, điều hòa chu kì tế bào và quá trình nguyên phân, điều hòa apoptosis, tính di động và sự xâm lấn của tế bào, …(hình 1.10) [4, 18, 34, 41,51]

Hình 1.10 cho thấy, RASSF1A gây ra apoptosis thông qua sự tương tác của nó với Ras, với yếu tố tác động Ras (NORE1), với CNK1, kinase tiền apoptosis (MST1) và với yếu tố điều biến của apoptosis-1 (MAP-1) (K-Ras hoạt hóa, RASSF1A và MAP-1 hợp lực để hoạt hóa Bax và sự chết của tế bào) RASSF1A điều hóa quá trình tăng sinh thông qua sự tương tác của nó với những vị ống và Cdc20 (bằng cách ức chế phức hợp APC–Cdc20 và làm thoái biến các cyclin A, cyclin B), tương tác với những protein 1B liên kết với vi ống (MAP1B), tương tác với Aurora-A (làm phosphoryl hóa RASSF1A) và C19ORF5 (sự tương tác giữa C19ORF5 – RASSF1A tại trung thể đã được biết là cần thiết cho sự kiểm soát chính xác phức hợp APC–Cdc20 trong suốt quá trình phân bào), tương tác với yếu tố phiên mã p120E4F (RASSF1A gây ra sự ngưng chu kì tế bào tại pha G1 và sự kìm hãm pha S là nhờ sự thúc đẩy p120E4F) và ức chế sự tích lũy cyclin D1 [51] RASSF1A ức chế sự hoạt động phụ thuộc vào yếu tố tăng trưởng biểu bì của Erk thông qua PMCA4b [15, 51] Tóm lại, tất cả các hoạt động trên đều hỗ trợ cho vai trò ức chế khối u của RASSF1A [51]

Protein RASSF1A điều hòa sự chết theo chương trình của tế bào (apoptosis- programmed cell death)

RASSF1A gây ra sự chết theo chương trình của tế bào thông qua sự tương tác của nó với Ras, với NORE1, với CNK1, MST1 và MAP-1[15, 51] Do RASSF1A và NORE1 đã tương tác với kinase tiền apoptosis (MST1) để hình thành phức hợp NORE1/RASSF1A - MST1 và để liên kết với những protein kìm hãm RAS, gây ra sự chết theo chương trình của tế bào (hình 1.10) [15, 51] Do đó, RASSF1A và NORE1 đáp ứng như các mô đun cảm ứng để xác định tín hiệu tiền apoptosis được khởi nguồn thông qua con đường Ras [51] Bên cạnh đó, RASSF1A tương tác với CNK1 thông qua việc liên kết với các domain CRIC và PDZ của CDK1và thúc đẩy RASSF1A gây ra sự chết của tế bào CNK1 có chức năng ngăn cản sự phát triển của những dòng tế bào ung thư đang phân chia và khởi đầu sự chết theo chương trình của tế bào thông qua con đường MST1 hoặc MST2 [15], từ đó dẫn tới kìm hãm sự

phát triển của khối u Hơn nữa, CNK1 cũng tham gia vào con đường tiền apoptosis thông qua sự tương tác của nó với phức hợp RASSF1A – MST1 [15]

RASSF1A cũng có thể điều hòa sự chết theo chương trình của tế bào thông qua con đường tín hiệu của thụ thể chết Những thụ chết đã hoạt hóa gây biến đổi cấu hình Bax, giải phóng cytochrome c và gây ra sự chết của tế bào [3, 51] Bax là một thành viên của họ protein Bcl2 có khả năng điều hòa apoptosis RASSF1A được biết là thành phần cần thiết cho thụ thể chết biến đổi cấu hình Bax và gây ra sự chết theo chương trình của tế bào [3, 51] Sự kích thích của yếu tố hoại tử khối u α (TNFα) hoặc TRAIL đều dẫn đến sự gắn bổ sung RASSF1A và MAP-1 vào các phức hợp thụ thể và thúc đẩy sự hình thành phức hợp giữa RASSF1A và MAP-1 Bình thường, MAP-1 bị kìm hãm bởi sự tương tác nội phân tử Tuy nhiên, việc gắn RASSF1A vào MAP-1 làm giảm sự kìm hãm trên, dẫn đến MAP-1có thể gắn vào Bax Sau đó, K -Ras ở dạng hoạt động, RASSF1A và MAP-1 hợp lực để hoạt hóa Bax và gây ra sự chết của tế bào (hình 1.11) [51]

Hình1.11 RASSF1A điều hòa apoptosis thông qua con đường tín hiệu thụ thể chết [24]

Hình 1.11 cho biết: Sự chết của tế bào do thụ thể chết gây ra (thông qua sự kích thích của TNFα) có thể dẫn đến sự bổ sung của phức hợp protein để hoạt hóa Bax và thúc đẩy apoptosis Cơ bản, RASSF1A là phức hợp liên kết với 14-3-3 thông qua sự phosphoryl hóa GS3K-β để mà ngăn cản sự bổ sung không mong muốn của RASSF1A vào thụ thể chết và làm mất kiểm soát sự kích thích của Bax và apoptosis Một khi, mà kích thích của thụ thể chết được tiếp nhận (TNFα), phức hợp TNFR1/MOAP-1/RASSF1A thúc đẩy “sự mở” cấu hình của MOAP-1để liên kết với Bax Điều này làm thay đổi cấu hình Bax và bổ sung vào ty thể để bắt đầu sự chết của tế bào Theo sao, giải phóng RASSF1A khỏi phức hợp TNFR1/MOAP-1, sau khi được giải phóng, RASSF1A có thế tái liên kết với 14-3-3 để ngăn cản sự khích thích liên tục của quá trình chết của tế bào [24]

RASSF1A điều hòa vi ống

RASSF1A định vị vào vi ống và thúc đẩy sự ổn định của vi ống Trong suốt kì trung gian, RASSF1A định vị vào vi ống của bào chất Trong suốt kì đầu, nó định vị vào trung thể Trong suốt kì giữa và kì sau, nó được định vị vào cả vi ống và thoi phân cực [18] Động học của vi ống có thể được điều hòa thông qua một loạt các protein liên kết với vi ống, chúng liên kết trực tiếp với tubulin Trong đó, 3 protein sau: MAP1B, C19ORF5 và MAP4 là thành phần liên kết trực tiếp của RASSF1A (hình 1.10) Do đó, RASSF1A có thể liên kết với vi ống thông qua MAPs MAP1B có khả năng thúc đẩy sự polyme hóa tubulin và bảo vệ vi ống chống lại các tác nhân khử polyme hóa do nocodazole gây ra [14, 18] Còn C19ORF5 thúc đẩy sự polyme hóa vi ống và ngược lại, MAP4 ngăn cản sự khử polyme hóa của vi ống Qua đây, cho thấy RASSF1A có ảnh hưởng sâu sắc đến cân bằng động học của vi ống [18]

Mặt khác, do RASSF1A có thể liên kết với α, γ và β tubulin và các protein liên kết vi ống (MAPs) [18, 19] Các liên kết này có chức năng duy trì sự ổn định của tubulin và cho phép vi ống thực hiện các vai trò của nó trong suốt quá trình phân bào, để cho phép sự phân tách của các nhiễm sắc tử chị em diễn ra [19]

Protein RASSF1A điều hòa chu kì tế bào

Sự mất điều hòa của chu kì tế bào là một yêu cần thiết cho quá trình hình thành khối u Trong tế bào bình thường, chu kì tế bào được kiểm soát chặt chẽ thông qua một số phức hợp protein- hoạt động của chúng cần thiết để tế bào vượt qua các điểm kiểm soát đặc hiệu [51] RASSF1A điều hòa chu kì tế bào thông qua sự ngưng chu kì tế bào ở pha G1, pha G2/M, điều hòa diễn tiến phân bào thông qua sự điều hòa phức hợp xúc tiến kì sau - anaphase promoting complex, viết tắt là APC và sự tích lũy cyclin A, B và D1[51]

RASSF1A có khả năng tác động vào sự chuyển tiếp pha G1 thông qua sự tương tác trực tiếp của nó với p120E4F

, p120E4F là một yếu tố phiên mã, tương tác với protein Rb (retinoblastoma- ung thư võng mạc), p14ARF, p53 và nó liên quan đến sự kiểm soát việc ngưng chu kì tế bào ở gần giai đoạn chuyển tiếp pha G1 [51] Sự ngưng chu kì tế bào ở pha G1 và sự ức chế pha S được đẩy mạnh bởi p120E4F khi có sự hiện diện của RASSF1A [15] Do RASSF1A thúc đẩy khả năng của p120E4F để loại bỏ cyclin A2 và hợp lực với p120E4F để làm ngưng chu kì tế bào [18] Tuy nhiên, vai trò điều hòa cylin A2 của RASSF1A là một quá trình phức tạp, tại vì RASSF1A chỉ có khả năng làm tăng nồng độ protein cyclin A2 trong một số trường hợp [18] Mặt khác, do p120E4F có khả năng điều hòa âm tính sự phiên mã của cyclin A2, có nghĩa là sự biểu hiện của p120 E4F dẫn đến sự ức chế phiên mã của gen Cyclin A,

điều này có liên quan đến sự ngưng chu kì tế bào tại pha G1[14, 18, 20] Tại vì, cyclin A đóng vai trò thiết yếu trong quá trình chuyển sang pha S Quá trình tích lũy protein cyclin A và mRNA cyclin A tại điểm kết thúc của pha G1 là cần thiết cho quá trình đi vào pha S và sự sao chép DNA[20] Mặt khác, RASSF1A có khả năng ức chế sự tích lũy protein cyclin D1 thông qua việc ức chế dịch mã mRNA của gen

Cyclin D1, dẫn đến làm ngưng chu kì tế bào tại pha G1 [51]

RASSF1A có liên quan đến việc kiểm soát làm ngưng chu kì tế bào trong giai đoạn kì đầu muộn (prometaphase) Do chức năng của RASSF1A phụ thuộc vào Emi1 (early mitotic inhibitor 1)- một chất ức chế hoạt tính phức hợp APC-Cd20 để

ngăn cản sự thoái biến của các cyclin phân bào trong pha M [15, 45], vì thế RASSF1A hoạt động ở giai đoạn kì đầu muộn, trước sự hoạt động của điểm kiểm soát thoi phân bào và sau sự phá hủy Emi1 để ngăn cản sự thoái biến của các cyclin phân bào và làm trì hoãn quá trình phân bào [15]

Việc làm ngưng chu kì tế bào trong giai đoạn kì đầu muộn có liên quan đến sự tương tác trực tiếp của RASSF1A với Cdc20 Cdc20 là một yếu tố điều hòa chu kì tế bào cần thiết cho việc hoàn thành quá trình nguyên phân[18]

Cdc20 gắn và hoạt hóa hoạt tính ligase ubiquitin của phân tử APC Điều này thúc đẩy ubiquitin hóa và sự thoái biến của cyclin A, cyclin B, dẫn đến tế bào không đi vào kì sau và không phân bào tiếp [18] Khi Cdc20 tương tác với RASSF1A thì sẽ làm mất khả năng hoạt hóa APC của Cdc20, sự ổn định của các cyclin A, cyclin B làm “ khóa” quá trình phân bào và theo sau là sự thoái biến của chúng (hình 1.12) [18] Hơn nữa, RASSF1A liên kết với Cdc20 và định vị trên thoi phân bào trong suốt giai đoạn kì đầu muộn, do đó ức chế khả năng của RASSF1A để thúc đẩy sự thoái biến của các cyclin phân bào (đáng chú ý là cyclin A) Điều này cho thấy, vai trò của RASSF1A trong sự điều hòa APC là độc lập với các điểm khiểm soát phụ thuộc Mad2 và các phức hợp ức chế Emi1-Cdc20 (hình 1.12) [45] Sử dụng RNA can thiệp làm suy yếu RASSF1A thì sẽ thúc đẩy quá trình phân bào [45]

Hình 1.12 Sự ức chế hoạt động của APC/C trong suốt chu kì tế bào [37]

Chú thích:

(a) Từ pha S cho đến kì đầu, Emi1 ức chế APC/C bằng cách gắn vào Cdc20

(b) Trong suốt thời kì đầu muộn, RASSF1A liên kết với Cdc20 và ức chế APC/C Tại điểm kết thúc thời kì đầu muộn, sự ức chế này ngưng lại và khởi đầu sự thoái biến cyclin A

(c) Trong suốt giai đoạn cuối của kì đầu muộn, điểm kiểm soát thoi vô sắc bắt đầu hoạt động Lúc này, tại tâm động, sự phophosryl hóa và sự gắn Mad2 vào Cdc20 sẽ ngăn cản Cdc20 gắn vào APC/C, ngoài ra, xu hướng phổ biển đó là sự thoái biến cyclin A

(d) Cyclin B vẫn duy trì ổn định miễn là điểm kiểm soát thoi vô sắc hoạt động APC/C sẽ bắt đầu phophosryl hóa nhiều phức hợp Các nhiễm sắc thể bắt đầu sắp xếp và điểm kiểm soát thoi vô sắc bị bất hoạt Kết quả, Cdc20 không xảy ra sự phophosryl hóa sẽ gắn vào APC/C và ức chế kì sau bao gồm sự thoái biến securin và cyclin B Dòng màu xanh dương và màu đỏ lần lượt cho biết những giai đoạn ổn định của cyclin A và cyclin B, những đường chấm chấm biểu thị sự thoái biến của chúng

Vai trò RASSF1A trong kiểm soát tính di động và sự xâm lấn của tế bào

Khả năng điều hòa động học tubulin của RASSF1A cho phép nó kiểm soát tính di động và sự xâm lấn của tế bào [18] Theo Dallol A và cộng sự (2005), sự biểu hiện vượt mức của RASSF1A kìm hãm sự di chuyển của tế bào và làm biến đổi hình thái của tế bào Khi RASSF1A mất sự biểu hiện thì làm giảm sự kết dính giữa các tế bào Theo Donninger M K và cộng sự (2007), sự tái biểu hiện của RASSF1A, có thể làm suy yếu cả tính di động và sự xâm lấn của những dòng tế bào ung thư phổi, do đó, sự mất chức năng RASSF1A có thể góp phần vào giai đoạn đầu của quá trình tạo u

RASSF1A điều hòa sửa chữa DNA gián tiếp thông qua XPA [17]

RASSF1A có vai trò quan trọng trong sự đáp ứng lại DNA sai hỏng (DDR DNA damage response) theo apoptosis Ngoài việc điều hòa DDR, RASSF1A còn đóng vai trò quan trọng trong quá trình sửa chữa DNA của chính nó RASSF1A điều hòa protein sửa chữa DNA quan trọng XPA XPA cần đến RASSF1A để sử dụng hoàn toàn hoạt tính sửa chữa DNA của mình, nếu thiếu RASSF1A, làm suy yếu hoạt tính sửa chữa DNA của nó Hơn nữa, biến thể đa hình đơn nucleotic của RASSF1A liên quan đến ung thư, cho thấy sự liên kết khác nhau với XPA và ức chế việc sửa chữa DNA Sự tương tác của XPA với các thành phần của phức hợp sửa chữa như protein tái bản A - RPA, được kiểm soát bởi chu kì động học acetyl hóa/ khử acetyl hóa RASSF1A và các biến thể đa hình đơn nucleotic khác của nó điều hòa sự acetyl hóa của protein XPA, biến thể đa hình đơn nucleotic khác ổn định vượt mức trong phức hợp XPA-RPA70 Do đó, theo Donninger H và cộng sự (2015) nhận ra hai chức năng mới của RASSF1A là kiểm soát việc sửa chữa DNA và sự acetyl hóa protein RASSF1A điều chỉnh cả hai quá trình DDR theo apoptois và sửa chữa DNA, nó có vai trò quan trọng và không dự đoán trước được trong cái cân thăng bằng giữa sửa chữa và cái chết sau khi DNA sai hỏng Đây là một cơ chế giúp ức chế sự hình thành khối u

-1.3.4 Sự im lặng của gen RASSF1A và ung thư

Sự methyl hóa vượt mức tại đảo CpG trong vùng promoter gen RASSF1A

làm im lặng sự biểu hiện của gen trong nhiều loại ung thư Sự im lặng gen

RASSF1A trong ung thư chủ yếu do 2 nguyên nhân sau: (1) sự methyl hóa DNA ở

vùng promoter của gen RASSF1A, (2) những đột biến gen RASSF1A [51]

Sự bất hoạt

của gen RASSF1A có liên quan đến sự phát triển của hơn 40 loại ung thư khác nhau,

trong đó có ung thư biểu mô vòm họng [41]

Nguyên nhân phổ biến nhất của sự mất

chức năng gen RASSF1A là sự im lặng quá trình phiên mã thông qua sự methyl hóa

vượt mức ở promoter [51] Sự bất hoạt của RASSF1A có sự liên kết với một số giai

đoạn tiến triển của khối u và tiên lượng sớm [15] Hơn nữa, sự bất hoạt gen RASSF1A

có mối tương quan với sự di căn của hạch bạch huyết và giai đoạn khối u trong ung

thư vòm họng [50] Ở các tế bào ung thư, gen RASSF1A bị methyl hóa vượt mức tại vùng promoter làm quá trình phiên mã gen RASSF1A im lặng, dẫn đến làm mất

chức năng điều hòa các con đường tín hiệu và sự tạo u

Sự im lặng gen RASSF1A cần đến protein HOXB3 [41] HOXB3 làm im lặng

RASSF1A thông qua con đường liên quan trực tiếp đến việc gắn DNMT3B vào

promoter của RASSF1A Theo Palakurthy R K và cộng sự (2009), HOXB3 gắn vào gen DNA Methyltransferase (DNMT3B) và làm tăng sự biểu hiện của gen này Sau đó, DNMT3B được bổ sung vào vùng promoter của RASSF1A, dẫn đến sự methyl hóa vượt mức và làm im lặng sự biểu hiện của gen RASSF1A DNMT3B được bổ

sung rất dễ dàng thông qua sự tương tác với phức hợp chất kìm hãm Polycom 2

(POL2) và MYC, hai phức hợp này đã được gắn vào promoter của RASSF1A (hình

1.13) [41] Ngược lại, nếu “khóa” MYC thông qua sự tác động của các RNA can thiệp (RNAi), dẫn đến làm giảm sự bổ sung DNTM3B và EZH2 vào promoter của

gen RASSF1A, cũng như giải phóng sự biểu hiện của gen RASSF1A [41]

Hình 1.13 Sự im lặng của gen RASSF1A gián tiếp qua HOXB3 [41]

Chú thích: EZH2 là một enzyme methyl hóa histone, nó methyl hóa histone H3 trên lysine 27 (H3K27), MYC là một protein gây ung thư (oncoprotein), có chức năng như là một chất kìm hãm sự phiên mã và có khả năng tương tác trực tiếp với DNA methyltransferase, PRC2: phức hợp chất kìm hãm Polycom 2

Bên cạnh đó, sự mất biểu hiện gen RASSF1A cũng có thể là do các đột biến soma của nó, nhưng rất ít Các đột biến này làm suy yếu chức năng của RASSF1A,

như đột biến A133S hoặc S131F không thể làm ngưng chu kì tế bào bằng cách ngăn chặn sự tích lũy cyclin D1 [24, 51] Đột biến S131F làm giảm sự phosphoryl, dẫn đến làm yếu khả năng ức chế sự tăng sinh tế bào Các đột biến C65R và R257Q làm giảm khả năng liên kết với các vi ống [24, 51]

1.3.5 Sự methyl hóa RASSF1A là một dấu chứng sinh học của ung thư

Sự methyl hóa gen RASSF1A được xem như là một dấu chứng sinh học lý

tưởng cho bệnh ung thư vì ba lí do chủ yếu: (1) sự methyl hóa xảy ra trong nhiều loại khối u khác nhau (2) tần số methyl hóa luôn ở trong khoảng trung bình đến cao, do đó cung cấp thông tin khá chính xác cho chẩn đoán.(3) sự methyl hóa gen

RASSF1A ít có xảy ra ở các mô bình thường, nên nó là một dấu chứng sinh học có

độ đặc hiệu cao [26, 51] Vì vậy, nó được sử dụng như một dấu chứng chẩn đoán ung thư có tiềm năng

1.4 PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN SỰ METHYL HÓA DNA 1.4.1 Quá trình xử lý DNA bằng sodium bisulfite

Việc đánh giá sự methyl hóa DNA được tiến hành với bước đầu tiên là biến đổi bisulfite DNA bộ gen Biến đổi bisulfite là phản ứng của DNA với sodium bisulfite được dùng để chuyển đổi tất cả cytosine không bị methyl hóa thành uracil Quá trình biến đổi bisulfite DNA diễn ra qua 3 giai đoạn sau (hình 1.14)[60]

uracil-Mặt khác, các 5mC không bị biến đổi sau khi phản ứng bisulfite kết thúc [60]

Hình 1.14 Quá trình biến đổi bisulfite của DNA[60]

Hiện nay, có rất nhiều phương pháp xác định tình trạng methyl hóa DNA dựa trên cơ sở biến đổi bisulfite DNA như: MSP (methylation-specific PCR), MMSP (Multiplex Methylation Specific PCR), Real – time Quantitative PCR, COBRA (Combined bisulfite restriction analysis), … Trong các phương pháp này, phương pháp MSP là phương pháp được lựa chọn phổ biến nhất

1.4.2 Phương pháp MSP (methylation-specific PCR)

Theo Herman J G và cộng sự (1996), MSP là một phương pháp đánh giá nhanh tính trạng methyl hóa của hầu hết các vị trí CpG trong một đảo CpG Phương pháp này được thực hiện theo thứ thự sau: khởi đầu là sự biến đổi DNA bằng muối bisulfite, sau khi xử lý DNA với muối bisulfite, tất cả các cytosine không bị methyl hóa sẽ biến đổi thành uracil, còn các cytosine bị methyl hóa vẫn giữ nguyên, không thay đổi Tiếp theo, thực hiện khuếch đại DNA đã xử lý với hai cặp mồi đặc hiệu cho DNA bị methyl hóa và DNA không bị methyl hóa (hình 1.15) [25]

Độ nhạy của kỹ thuật này cho phép định tính sự methyl hóa của các DNA thu nhận không chỉ ở các mẫu mô tươi đông lạnh, máu ngoại vị, tủy xương hay dịch cơ thể mà cả các mẫu đúc paraffin [23] MSP là một phương pháp nhanh, có hiệu quả, không đòi hỏi các chất cảm ứng phóng xạ và có thể phân tích một số lượng lớn các mẫu lâm sàng [25] Hơn nữa, phương pháp MSP cho phép xác định một bản sao gen bị methyl hóa trong số 1000 bản sao gen không bị methyl hóa [25, 39] Vì thế, MSP vẫn được sử dụng phổ biến nhất

Hình 1.15 Phương pháp MSP [60]

2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 VẬT LIỆU

2.1.1 Mẫu thí nghiêm

Nghiên cứu sử dụng 10 mẫu thí nghiệm thu nhận từ Bệnh viện Chợ Rẫy vào ngày 28 tháng 1 năm 2016 và lưu giữ tại phòng thí nghiệm Sinh Học Phân Tử, khoa Công Nghệ Sinh Học, ĐH Mở TP HCM Trong 10 mẫu thí nghiệm bao gồm 8 mẫu mô (được kí hiệu lần lượt là T1-T8) và 2 mẫu dịch phết (được kí hiệu là S1, S2) Tám mẫu mô đã được chẩn đoán là bị UTVH và hai mẫu dịch phết được chẩn đoán không bị UTVH (mẫu lành) theo chẩn đoán của bác sĩ Bệnh viện Chợ Rẫy Các mẫu trên được bảo quản trong dung dịch PBS khi đưa về phòng thí nghiệm được lưu giữ ở nhiệt độ - 200C đến khi sử dụng

2.1.2 Các phần mềm và chương trình sử dụng trong nghiên cứu Khai thác dữ liệu trên trang web: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

Thu nhận trình tự gen khảo sát trên web: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/ Phần mềm trực tuyến Methprimer: http://www.urogene.org/methprimer/

được dùng để xác định trình tự gen cần khảo sát có đảo CpG hay không

Phần mềm trực tuyến TFBIND: http://tfbind.hgc.jp/ được dùng để xác định vị trí nhận biết của các yếu tố phiên mã

Đánh giá các thông số vật lý của mồi bằng phần mềm trực tuyến IDT:

Phần mềm AnnHyb-4.944, phiên bản năm 2012 được dùng để kiểm tra lại khả năng bắt cặp của cặp mồi tham khảo trên trình tự gen cần khảo sát, xác định vị trí bắt cặp của mồi, đồng thời xác định kích thước sản phẩm khuếch đại

Phần mềm trực tuyến Blast: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi được dùng để kiểm tra độ đặc hiệu của mồi với gen đích