khảo sát sự ảnh hưởng của các nguyên liệu tự nhiên từ thực vật đối với quy trình nuôi trồng nấm cordyceps militaris chay

Cordyceps militaris CHAY

KHẢO SÁT SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC NGUYÊN LIỆU TỰ NHIÊN TỪ THỰC VẬT ĐỐI VỚI QUY TRÌNH NUÔI TRỒNG nấm

Cordyceps militaris CHAY

Ký tên

(Ghi rõ họ và tên)

Giảng viên hướng dẫn:

Học viên thực hiện: Lớp: Ngày sinh: Nơi sinh: Tên đề tài:

Ý kiến của giáo viên hướng dẫn về việc cho phép học viên được bảo vệ khóa luận trước

sinh học Trong suốt bốn năm học qua, bản thân em thực sự cảm kích quý thầy cô đã cho em kiến thức, bản lĩnh, tinh thần làm việc đầy khoa học và trách nhiệm

Xin cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Mở Tp Hồ Chí Minh, Giám đốc cơ sở 3 Bình Dương và Ban chủ nhiệm khoa Công Nghệ Sinh Học đã tạo môi trường học tập và thực tập thuận lợi cho em trong suốt thời gian vừa qua

Đặc biệt xin gửi lời cảm ơn chân thành đến cô Thạc sĩ Nguyễn Thị Phương Khanh là người cho bản thân em rất nhiều kiến thức quý báu Trong suốt thời gian thực tập, em đã được cô chỉ dẫn tận tình, giúp em nỗ lực hơn trong việc học tập và hoàn thành thật tốt thực tập tốt nghiệp Một lần nữa em xin cảm ơn cô rất nhiều

Xin cảm ơn anh Nguyễn Hoàng Minh đã cho em mượn phòng và các thiết bị để em có thể hoàn thành thật tốt thực tập tốt nghiệp của mình

Xin cảm ơn anh chị trong phòng nấm và tất cả những người bạn k17 đã cùng học tập, chia sẻ kiến thức, giúp đỡ khó khăn trong suốt quá trình học tập và thực tập tốt nghiệp

Xin cảm ơn bố mẹ đã chăm sóc, luôn bên cạnh và động viên con rất nhiều

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

PHẦN I TỔNG QUAN 3

1.1 Giới thiệu về nấm Cordyceps militaris 3

1.2Đặc điểm sinh trưởng 3

1.4.3 Tảo xoắn Spirulina platensis 8

1.5 Một số hợp chất có hoạt tính sinh học thu nhận từ Cordyceps militaris 9

1.5.1 Acid amin 10

1.5.2 Adenosine và cordycepin 10

1.5.3 Polysaccharide 10

1.5.4 Acid béo 11

1.6 Giá trị dược liệu của nấm Cordyceps militaris 11

1.7 Đặc điểm hình thái của quả thể nấm Cordyceps militaris 14

1.8 Chu trình sống của nấm Cordyceps 15

1.9Các nghiên cứu trong nước 16

2.1Địa điểm và thời gian thí nghiệm 18

2.2Vật liệu 18

2.3Dụng cụ, hóa chất và thiết bị 18

PHẦN III PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

3.1Nôi dung thực hiện 19

3.2Các phương thực hiện 19

3.2.1 Quy trình thực hiện thí nghiệm 19

3.2.2 Phương pháp chuẩn bị môi trường nuôi cấy 20

3.2.3 Phương pháp thu chỉ tiêu trọng lượng quả thể nấm Cordyceps militaris 21

3.2.4 Phương pháp xác định hàm lượng Protein Lowry 21

3.2.5 Phương pháp xác định % Nitơ Kjeldahl 22

3.2.6 Phương pháp đo năng suất sinh học BE% 22

3.2.7 Phương pháp xử lý số liệu 22

3.3Nôi dung khảo sát 23

3.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của rong biển đến năng suất quả thể nấm Cordyceps militaris nuôi trên môi trường gạo lứt 23

3.3.2 Thí nghiệm 2: Tối ưu hàm lượng rong biển Wakame bổ sung vào môi trường nuôi quả thể nấm Cordyceps militaris trên giá thể gạo lứt 25

3.3.3 Thí nghiệm 3: Tối ưu hàm lượng tảo xoắn Spirulina platensis bổ sung vào môi trường nuôi quả thể nấm Cordyceps militaris trên giá thể gạo lứt 27

PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31

4.1Kết quả thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của rong biển đến năng suất quả thể nấm Cordyceps militaris nuôi trên môi trường gạo lứt 31

4.2Kết quả thí nghiệm 2: Tối ưu hàm lượng rong biển Wakame bổ sung vào môi trường nuôi quả thể nấm Cordyceps militaris trên giá thể gạo lứt 35

4.3 Kết quả thí nghiệm 3: Tối ưu hàm lượng tảo xoắn Spirulina platensis bổ sung vào môi trường nuôi quả thể nấm Cordyceps militaris trên giá thể gạo lứt………… 39

4.4 Kết quả thí nghiệm 4: Kết hợp rong biển Wakame và tảo soắn Spirulia platensis bổ sung vào môi trường nuôi nấm Cordyceps militaris 43

PHẦN V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48

5.1Kết luận 48

5.2Kiến nghị 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO 49

PHỤ LỤC 54

Bảng 1.1 Thành phần dinh dưỡng có trong 100g gạo lứt theo Bộ Y Tế viện dinh

dưỡng (Bảng thành phần thực phẩm Việt Nam) 5

Bảng 1.2 Thành phần dinh dưỡng của rong biển 7

Bảng 1.3 Thành phần dinh dưỡng có trong 100g tảo xoắn Spirulina theo Công ty JAPAN ALGAE – Nhật Bản 9

Bảng 1.4 Thành phần acid béo của Cordyceps militaris (Hur, 2008) 11

Hình 1.2 Tảo Spirulina platensis nhập khẩu từ Nhật được mua tại địa chỉ số 63

Yên Đỗ, phường 1, quận Bình Thạnh, Tp.Hồ Chí Minh 8

Hình 1.3 Nấm Cordyceps militaris và mặt cắt dọc quả thể chứa các bào tử (Christian et al., 1837) 14

Hình 1.4 Sự hình thành nấm Cordyceps sp trong tự nhiên 15

Hình 3.1 Sơ đồ quy trình thực hiện thí nghiệm 19

Hình 3.2 Sơ đồ tiến hành thí nghiệm 1 23

Hình 3.3 Sơ đồ tiến hành thí nghiệm 2 25

Hình 3.4 Sơ đồ tiến hành thí nghiệm 3 27

Hình 3.5 Sơ đồ tiến hành thí nghiệm 4 29

Hình 4.1 Nghiệm thức A0 bổ sung 12% bột đậu nành (ĐC) vào môi trường nuôi Cordyceps militaris 31

Hình 4.2 Nghiệm thức A1 bổ sung 3,7% rong Wakame vào môi trường nuôi Cordyceps militaris 31

Hình 4.3 Nghiệm thức A2 bổ sung 12% rong Mơ vào môi trường nuôi Cordyceps militaris 32

Hình 4.4 Nghiệm thưc A3 bổ sung 6% rong Sụn vào môi trường nuôi Cordyceps militaris 32

Hình 4.5 Nghiệm thức T0 bổ sung 3,7% rong biển Wakame vào môi trường nuôi Cordyceps militaris 35

Hình 4.7 Nghiệm thức T2 bổ sung 4,5% rong biển Wakame vào môi trường nuôi

Hình 4.15 Nghiệm thức H1 bổ sung 3,7% rong biển Wakame vào môi trường

nuôi Cordyceps militaris 43

Hình 4.16 Nghiệm thức H2 bổ sung 3% rong biển Wakame và 0,6% tảo xoắn

Spirulina platensis vào môi trường nuôi Cordyceps militaris 43

Hình 4.17 Nghiệm thức H3 bổ sung 2,2% rong biển Wakame và 1,2% tảo xoắn

Spirulina platensis vào môi trường nuôi Cordyceps militaris 44

Hình 4.19 Nghiệm thức H5 bổ sung 0,7% rong biển Wakame và 2,4% tảo xoắn

Spirulina platensis vào môi trường nuôi Cordyceps militaris 45

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay, trong chi Cordyceps có hai loài là Cordyceps militaris và Cordyceps sinensis đang được nghiên cứu và sản xuất do có nhiều giá trị dược liệu và giá trị kinh

tế cao [21] Theo Li vs cs (2006), Stone (2008), Zhang vs cs (2012) cho thấy nấm

Cordyceps sinensis là một loài nấm dược liệu quý hiếm, chủ yếu được thu hái trong tự

nhiên và có vùng phân bố rất hạn chế, chưa được nuôi trồng tạo quả thể thành công trên môi trường nhân tạo, do đó sản lượng nấm không đủ đáp ứng được nhu cầu thị trường

[19] [29] [34] Theo Li vs cs (1995), Dong vs cs (2012) cho thấy, loài Cordyceps militaris

là một loài nấm ký sinh trên côn trùng có giá trị dược liệu, chứa các hợp chất tương tự

như của nấm Cordyceps sinensis, có thể nuôi trồng dễ dàng trên môi trường nhân tạo

[10] [18] Do đó, để đáp ứng nhu cầu của thị trường trong và ngoài nước, việc nghiên

cứu và ứng dụng quy trình nuôi trồng sản xuất nấm Cordyceps militaris tại Việt Nam là

một vấn đề cần thiết

ngành nấm túi Ascomycota, lớp Sordariomycetes, bộ Hypocreales, họ Clavicipitaceae

và gồm có hơn 400 loài đã được tìm thấy và mô tả, trong số đó có khoảng 36 loài đã được nuôi trồng quả thể trong điều kiện nhân tạo [4] Trong số những loài này, chỉ có

loài Cordyceps militaris đã được nuôi trồng ở quy mô công nghiệp, do có thời gian sản

xuất ngắn và chứa nhiều hợp chất dược liệu có dược tính [19] Adenosine và cordycepin

là hai hợp chất có dươc tính cao của nấm Cordyceps militaris Adenosine chiếm 0,18%

trong quả thể và 0,06% trong sinh khối nấm Đối với hợp chất cordycepin, trong quả thể có hàm lượng cao gấp 3 lần so với sinh khối (0,97% so với 0,36%).[4]

Theo Phạm Quang Thu vs cs (2011) trong y học cổ truyền của Trung Quốc, nấm

Cordyceps militaris được dùng để điều trị thành công các chứng rối loạn lipit máu, viêm

phế quản mãn tính, hen phế quản, viêm thận mãn tính, suy thận, rối loạn nhịp tim, cao huyết áp, viêm mũi dị ứng, viêm gan B mãn tính và thiểu khả năng sinh dục Với giá trị

của nấm nhằm nhân nuôi hệ sợi trong nuôi cấy thuần khiết là vô cùng quan trọng, đây là cơ sở để bảo tồn được nguồn gen quý và gây trồng quả thể trong giá thể nhân tạo.[6]

Nuôi trồng nấm Cordyceps militaris trải qua nhiều giai đoạn khác nhau Giai đoạn

nhân giống được xem là giai đoạn quan trọng vì đây là giai đoạn phát triển của các bào tử nấm, giống nấm sau khi phân lập sẽ được nuôi trong môi trường dinh dưỡng, ở giai

đoạn này các ống bào tử của nấm Cordyceps militaris sẽ dần phát triển tạo nên các tế

bào nấm non, sau đó được cấy sang môi trường giá môi để được lan tơ và phát triển

thành quả thể nấm hoàn chỉnh Trong môi trường nuôi cấy nấm Cordyrceps militaris nhu

cầu hàm lượng nitơ tương đối thấp Nếu hàm lượng nitơ quá cao sẽ làm chậm quá trình sinh trưởng hệ sợi và quá trình biệt hóa hình thành quả thể.[12]

Hợp chất tự nhiên như rong biển và tảo xoắn Spirulina platensis là nguồn nguyên

liệu rất phổ biến mà lại rất giàu khoáng chất như magie, canxi, đồng, kali, selen, kẽm, ốt, sắt; cung cấp vitamin A, B, C, E và K và chứa rất thấp các chất béo Rong biển và tảo xoắn Spirulina platensis cũng chứa nhiều chất chống oxy hóa, protein thực vật, chất xơ, axit béo omega-3 và tất cả các axit amin quan trọng cần thiết cho cơ thể con người

i-Trong rong biển và tảo xoắn Spirulina platensis có các thành phần dinh dưỡng như

protein (N), khoáng, đều là nguồn dinh dưỡng phù hợp trong quy trình nuôi trồng nấm

Cordyceps militaris Việc thay thế nhộng bằng hợp chất tự nhiên là rất cần thiết, đáp ứng

được nhu cầu cho người ăn chay nhạy cảm với mùi tanh của nhộng Xuất phát từ tình hình thực tế đó chúng tôi quyết định thực hiện đề tài “Khảo sát sự ảnh hưởng của các

nguyên liệu tự nhiên từ thực vật đối với quy trình nuôi trồng nấm Cordyceps militaris

chay”

PHẦN I TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu về nấm Cordyceps militaris

Giới nấm Fungi Phân giới Dikarya Ngành Ascomycota

Phân ngành Pezizomycetidae Lớp Sordariomycetes

Phân lớp Hypocreomycetidae Bộ Hypocreales

Họ Cordycipitaceae

Chi Cordyceps Hình 1.1 Nấm Cordyceps militaris

Loài Cordyceps militaris

1.2 Đặc điểm sinh trưởng

Theo Gao vs cs (2000) thì nhiệt độ môi trường có ảnh hưởng lớn đến việc tạo quả

cho sự sinh trưởng sinh khối nấm và năng suất quả thể Tuy nhiên, quá trình này sẽ giảm

độ môi trường khi trồng nấm Cordycep militaris

Theo Gao vs cs (2000) thì cường độ ánh sáng cũng ảnh hưởng lớn đến quá trình nuôi cấy tạo quả thể nấm Trong điều kiên che tối, việc tạo quả thể bi ức chế Các nghiên cứu cho thấy cường độ ánh sáng tối ưu cho sinh trưởng của nấm có thể dao động tùy

chủng nấm, tuy nhiên từ 500 - 1000 lux được xem là điều kiên thích hợp nhất [12] Trong

phòng nuôi nấm Cordycep militaris cần thiết kế các chế độ chiếu sáng phù hợp với quá

trình sinh trưởng của nấm giống ngoài tự nhiên

Độ thoáng khı́ tốt kı́ch thích sự sinh trưởng của tơ nấm và tổng sinh khối nấm Khoảng ẩm đô thích hợp cho nấm dao đông từ 70 – 90%, tương đương với độ ẩm không khí trong tự nhiên sẽ phù hơp cho việc tạo quả thể Khi đô ẩm thấp sẽ làm môi trường khô nhanh hạn chế sự phát triển của tơ nấm cũng như quả thể Do đó, trong phòng nấm cần bổ sung ẩm bằng máy phun ẩm với nguồn nước sạch khuẩn.[4]

1.3 Dinh dưỡng nuôi trồng

Gạo lứt là cơ chất tốt nhất cung cấp hàm lượng Cacbon trong muôi trường dinh

dưỡng nuôi trồng nấm Cordyceps militaris, hàm lượng gạo lứt và hàm lượng nước trong

môi trường nuôi cũng ảnh hưởng đến chiều cao quả thể và trọng lượng tươi nấm/chai nuôi.[3]

Nitơ cùng là thành phần dinh dưỡng không thiểu việc bổ sung nhộng tằm vào môi

trường gạo lứt nhằm tạo quả thể C militaris đã được chứng minh là tốt [3] Tuy nhiên, hầu hết các dòng C militaris yêu cầu hàm lượng đạm tương đối thấp, ở nồng độ đạm

cao có thể ức chế sự hình thành quả thể (Gao et al 2000) nên năng suất nấm nuôi trên côn trùng thường thấp hơn trên ngũ cốc.[12]

1.4 Thành phần dinh dưỡng

Trong môi trường nuôi trồng nấm Cordyrceps militaris, gạo là thành phần chính

Trong thành phần của gạo lứt có chứa rất nhiều dinh dưỡng gồm chất tinh bột, chất béo, chất đạm, chất xơ cùng các vitamin như B1, B2, B3, B6; các axit như paraaminobenzoic (PABA) pantothenic (vitamin B5), folic (vitamin M), phytic, các nguyên tổ vi lượng

như canxi, selen, glutathion (GSH), sắt, magie, kali và natri

Bảng 1.1 Thành phần dinh dưỡng có trong 100g gạo lứt theo Bộ Y Tế viện dinh dưỡng (Bảng thành phần thực phẩm Việt Nam)

1.4.2 Rong biển

Giới thiệu chung về rong biển

❖ Phân loại và phân bố của rong biển trên thế giới

Dựa vào thành phần cấu tạo, đặc điểm hình thái và màu sắc, rong biển có thể được chia thành 3 ngành rong chính:

1 Ngành rong nâu (Phaeophyta) 2 Ngành rong đỏ (Rhodophyta) 3 Ngành rong lục (Chlorophyta)

Trong số 03 ngành rong trên, rong nâu là ngành rong có trữ lượng lớn nhất và phân bố đa dạng nhất với hơn 1800 loài đã được phân loại Trên thế giới hiện nay chỉ riêng các loài rong thuộc họ Sargassaseae, bộ Fucales đã phân loại được khoảng hơn 400 loài.[5]

❖ Phân loại và phân bố các loài rong nâu ở Việt Nam

Theo Phạm Đức Thịnh vs cs (2015) ở Việt Nam đến nay có khoảng 147 loài rong nâu đã được phân loại, trong đó các loài rong thuộc chi Sargassum có trữ lượng lớn nhất với khoảng 68 loài phân bố dọc ven biển Việt Nam và sản lượng ước tính trên 10.000 tấn khô/năm Theo điều tra tới năm 2011 có 39 loài rong nâu thuộc chi Sargassum phân bố ở vùng biển Khánh Hòa, tập trung nhiều nhất và có trữ lượng lớn nhất là ở vịnh Nha Trang với 21 loài phổ biến và sản lượng ước tính gần 4.800 tấn khô/năm.[5]

Thành phần hóa học có trong rong biển

Rong biển có chứa đa dạng các thành phần hoá học, chúng đều là các thành phần rất có giá trị về mặt dinh dưỡng cũng như dược liệu bao gồm: các axít amin, các axít béo nhiều nối đôi, các vitamin và khoáng chất, polyphenol, các hợp chất chứa iốt, laminaran, alginat và fucoidan với tiềm năng ứng dụng rất lớn để làm dược liệu.[5]

Bảng 1.2 Thành phần dinh dưỡng của rong biển Nghành

rong biển Khoáng Protein Glucid

Muối khoáng

Rong Wakame [24]

Ngành rong Nâu (Phaeophyta)

Rong Sụn [1]

Ngành rong Đỏ

Rong Mơ [2]

Ngành rong Nâu (Phaeophyta)

1.4.3 Tảo xoắn Spirulina platensis

Hình 1.2 Tảo Spirulina platensis nhập khẩu từ Nhật được mua tại địa chỉ số 63

Yên Đỗ, phường 1, quận Bình Thạnh, Tp.Hồ Chí Minh

Theo giáo sư Nguyễn Lân Dũng thì khi nói đến tảo xoắn Spirulina chắc nhiều

người đều đã biết Loài đang được đưa vào sản xuất hiện nay là loài Spirulina platensis

Thực ra đây không phải là một sinh vật thuộc Tảo (Algae) vì Tảo thuộc nhóm Sinh vật

có nhân thật (Eukaryotes) Spirulina thuộc Vi khuẩn lam (Cyanobacteria), chúng thuộc nhóm Sinh vật có nhân sơ hay nhân nguyên thủy (Prokaryotes) Những nghiên cứu mới nhất cho biết chúng thuộc chi Arthrospira Tên khoa học hiện nay của loài này là Arthrospira platensis, thuộc bộ Oscilatoriales Vì chúng là nhóm vi sinh vật hình xoắn không thấy được bằng mắt thường lại có màu xanh lục nên mọi người vẫn quen gọi là

tảo xoắn Spirulina Tảo Spirulina platensis là thực phẩm bổ sung có chứa 60-70%

protein, nhiều hơn bất kỳ loại thực phẩm khác như thịt và cá Ngoài protein thì tảo xoắn còn chứa rất nhiêu thành phần quan trong như vitamin, beta carotene, vitamin nhóm B, vitamin E, khoáng chất vi lượng thiết yếu và gamma linolenic acid (GLA)

Bảng 1.3 Thành phần dinh dưỡng có trong 100g tảo xoắn Spirulina theo Công ty

JAPAN ALGAE – Nhật Bản

1.5 Một số hợp chất có hoạt tính sinh học thu nhận từ Cordyceps militaris

C.militaris cho thấy loài nấm này chứa các thành phần như protein chiếm 40,69%; các

loại vitamin: vitamin A (34,7 mg/gam), vitamin B1 (13,0 mg/gam), vitamin B6 (62,2 mg/gam), vitamin B12 (70,3 mg/gam), vitamin B3 (42,9 mg/gam); các nguyên tố khoáng: Se (0,44 ppm), Zn (130,0 ppm), Cu (29,15 ppm); hợp chất hóa học và nhóm hợp chất quan trọng: cordycepin (1,52%), cordycepic acid (11,8%), polychaccaride (30%) [27]

Adenosine và cordycepin là hai hợp chất quan trọng có dược tính cao trong nấm

Cordyceps militaris Adenosine chiếm 0,18% trong quả thể và 0,06% trong sinh khối

nấm Đối với hợp chất cordycepin, trong quả thể có hàm lượng cao gấp 3 lần so với sinh khối (0,97% so với 0,36%).[4]

Các polysaccharide CPS-1 và CPS-2 đươc tách chiết từ nấm Cordyceps militaris

cho thấy chúng có thành phần từ các đơn phân là các đường monosaccharide, mannose và galactose [4] Kết quả nghiên cứu cho thấy hai loai polysaccharide này có khả năng phục hồi các tổn thương gan do ethanol, và tác dụng này tăng lên khi tăng liều dùng chiết xuất Yan et al., 2008 cho rằng tác dụng này có thể do chức năng kháng oxy hóa của các polysaccharide từ nấm.[31]

1.5.4 Acid béo

Theo Hur (2008) quả thể nấm Cordyceps militaris chứa nhiều acid béo không no,

chiếm 70% tổng số acid béo, trong đó lương acid linoleic chiếm đến 61,3% trong quả thể và 21,5% trong sinh khối Lương ̣ acid béo no chủ yếu là acid palmitic, chiếm 24,5% trong quả thể và 33,0% trong sinh khối (Bảng 1.1).[13]

Bảng 1.4 Thành phần acid béo của Cordyceps militaris (Hur, 2008)

1.6 Giá trị dược liệu của nấm Cordyceps militaris

Các hợp chất dược liệu

Trong nấm Cordyceps militaris có rất nhiều các hợp chất dược liệu được ứng

dụng trong điều trị và nâng cao sức khỏe con người Trong tự nhiên nấm Cordyceps militaris rất khan hiếm Do đó loài nấm này có giá trị kinh tế cao và việc sản xuất ở quy mô lớn các chiết xuất từ nấm phục vụ nghiên cứu và điều trị bệnh từ Cordyceps militaris

hiện đang là một vấn đề cấp thiết

Các hợp chất chống ung thư: Theo Shonkor vs cs (2010) hợp chất cordycepin

(3′-deoxyadenosine) từ nấm cho thấy có hoạt tính kháng vi sinh vật, kháng ung thư, ngừa di căn, điều hòa miễn dịch.[28]

hợp chất CM-hs-CPS2 chứa trong dịch chiết nấm C.militaris có tính kháng oxy hóa, hoạt

Hạn chế vius cúm: Theo Yuko vs cs (2007) cho thấy acidic polysaccharide (APS) tách chiết từ nấm Cordyceps militaris trồng trên đậu nành nảy mầm có khả năng ứng

dụng trong điều trị cúm A Chất này góp phần điều hòa hoạt động miễn dịch của các đại thực bào.[33]

Kháng khuẩn kháng nấm và kháng ung thư: Theo Young-Joon và cs (2000) hợp chất cordycepin còn cho thấy khả năng kháng vi khuẩn Clostridium Các hợp chất dẫn

xuất từ nấm được mong đợi ứng dụng trong việc điều trị các bệnh nhiễm khuẩn đường ruột [32] Theo Seulmee vs cs (2009) cho thấy cordycepin còn ngăn sự biểu hiện của gen T2D chịu trách nhiệm điều hòa bệnh tiểu đường thông qua viêc ức chế các đáp ứng phản ứng viêm phụ thuộc NF-κB, do đó được hy vọng sẽ ứng dụng được như một chất điều hòa miễn dịch dùng trong điều trị các bệnh về miễn dịch.[26]

Tan huyết khối: Thoe Jae-Sung vs cs (2006) cho thấy enzyme tiêu sợi huyết tách chiết từ nấm Cordyceps militaris có hoạt tính gắn fibrin, và do đó xúc tiến việc phân hủy

fibrin Enzyme này có khả năng sử dụng trong điều trị tan huyết khối tương tự như các

enzym fibrinolytic mạnh khác như nattokinase và enzyme chiết từ giun đất Khi enzyme này có thể sản xuất ở quy mô lớn sẽ là một giải pháp thay thế hữu hiệu cho các enzym fibrinolytic giá thành cao hiện đang được sử dụng cho bệnh tim lão hóa ở người.[14]

Tı́nh kháng viêm: Theo Wol vs cs (2010) các đại thực bào được xử lý với nồng độ khác nhau của CMWE (dịch chiết từ quả thể nấm Cordyceps militaris) làm giảm đáng

kể LPS, TNF-α và IL-6 và mức độ giảm theo nồng độ của dich chiết Những ̣ kết quả này cho thấy rằng CMWE có tác dụng ức chế mạnh đến viêc sản xuất các chất trung gian gây viêm của tế bào.[30]

Các ứng dụng trên lâm sàng của nấm Cordyceps militaris: Mặc dù nấm Cordyceps sinensis được sử dụng rộng rãi hơn Cordyceps militaris, tuy nhiên các ứng dụng lâm sàng của chúng cũng khá tương tự nhau Các chiết xuất từ nấm Cordyceps militaris có

thể được sử dụng trong các trường hợp suy giảm chức năng phổi, ho có đờm, chóng mặt [9][25]

1.7 Đặc điểm hình thái của quả thể nấm Cordyceps militaris

Hình 1.3 Nấm Cordyceps militaris và mặt cắt dọc quả thể chứa các bào tử

(Christian et al., 1837)

Theo Paul vs cs (2008) thì nấm Cordyceps militaris là loài nấm ký sinh trên bướm

và sâu bướm, quả thể có màu cam, chiều dài 8-10 cm Đầu quả thể nấm có các đốm màu cam sáng Quả thể nấm nhô lên từ xác ấu trùng hoặc nhộng, mặt cắt ngang quả thể có màu nhạt, rỗng ở giữa Các nang bào tử dài từ 300 - 510 micro mét, bề rộng 4 micro mét Các bào tử nang hình sợi, không màu và phân đoạn, kích thước 3.5-6 × 1-1.5 micro mét Các bào tử nang này trong điều kiện nghèo dinh dưỡng sẽ đứt ra và nảy chồi tạo các bào tử thứ cấp Nấm này có phân bố rộng, ở Bắc Mỹ, châu Âu và châu Á.[23]

1.8 Chu trình sống của nấm Cordyceps

Hình 1.4 Sự hình thành nấm Cordyceps sp trong tự nhiên

1 Bướm 2 Sâu bướm 3 Bào tử nấm xâm nhiễm vào sâu trưởng thành

4 Nấm Cosdyceps militaris (Nguồn: http://anchiphuong.com)

Giống như hầu hết các loài Cordyceps khác, C.militaris là một loài nấm ký sinh

trên côn trùng và ấu trùng của côn trùng Loài này chủ yếu lây nhiễm ở giai đoạn nhộng của các loài bướm khác nhau, rồi nhân lên trong cơ thể ký chủ vào mùa đông Bào tử nấm phát tán trong gió xuống đất dı́nh vào bên ngoài ký chủ nhộng, sau đó từ bào tử hình thành các ống nảy mầm có các thể bám Các ống này tiết ra các enzyme như lipase, chitinase, protease làm tan vỏ ngoài của ký chủ và xâm nhập vào bên trong cơ thể Sau đó hê ̣sợi nấm hút dinh dưỡng và sinh trưởng mạnh mẽ chiếm toàn bộ cơ thể và gây bệnh cho ký chủ Đến cuối hè hoặc thu các ký chủ bị bệnh sẽ ngoi lên và chết cách mặt đất khoảng 2cm, gặp nhiệt độ thích hợp và ánh nắng kích thích sự hình thành quả thể nhô lên khỏi mặt đất rồi phát tán bào tử vào không khí [15][16]

1.9 Các nghiên cứu trong nước

Nguyễn Ngọc Trai (2017), Báo cáo tổng kết đề tài nghiên cứu khoa học cấp

trường, Bước đầu nghiên cứu quy trình nuôi đông trùng hạ thảo (Cordyceps militaris) có nguồn gốc từ Nhật Bản tại Trà Vinh, tr 17-18

Nghiên cứu hình thành và phát triển của quả thể nấm Cordyceps militaris Thí

Thí nghiệm thực hiện bổ sung dinh dưỡng có thành phần hàm lượng D-glucose khác nhau, chỉ tiêu đánh giá số lượng quả thể/keo quả thể cũng cho thấy ảnh hưởng của là D-glucose rất lớn Xét về tỷ lệ keo nuôi có nấm hình thành quả thể, ở nghiêm thức 1 (môi trường không bổ sung glucose) và nghiêm thức 4 (30 g/l) chỉ 16 quả thể/keo Nghiệm thức bổ sung 10 g/l là 26 quả thể/keo, nghiệm thức 20 g/l là 21,6 quả thể/keo Kết quả cho thấy khi bổ sung hàm lượng đường D-glucose ≥20 g/l thì ức chế sự hình

thành qua thể nấm Cordyceps militaris

1.10 Các nghiên cứu ngoài nước

Daniel L Purich and Herbert J Fromm (1972), Activation of Brain Hexokinase by Magnesium Ions and by Magnesium Ion-Adenosine Triphosphate Complex, Printed

in Great Britain

Cho biết ở phản ứng 1 của quá trình đường phân là sự vận chuyển của 1 ATP đến glucose để tạo thành glucose-6-phosphat (G6P) quá trình được xúc tác bởi enzyme hexokinase Hexokinase là enzym không đặc hiệu, có trong tất cả các loại tế bào, xúc tác

sự phosphoryl hóa của D-glucose, D-mannose, D-fructose và hoạt động xúc tác của

PHẦN II VẬT LIỆU

2.1 Địa điểm và thời gian thí nghiệm

- Thời gian thực hiện: 1/2020 – 6/2020

- Địa điểm thực hiện: Cơ sở 3, 68 Lê Thị Trung phường Phú Lợi thành phố Thủ Dầu Một tỉnh Bình Dương

2.2 Vật liệu

Vật liệu hóa chất sử dụng trong thí nghiệm

- Giống Cordyceps militaris lỏng được cung cấp tại cơ sở 3

- Khoai tây: Chọn những củ không nảy mầm, sạch bệnh, không chầy xước, cung cấp tại Đà Lạt

- Gạo lứt

- Rong biển khảo sát

- Tảo xoắn Spirulina platensis

2.3 Dụng cụ, hóa chất và thiết bị

- Nồi nấu, đĩa petri, đồng hồ, hũ thủy tinh 500 ml, đèn cồn, giấy lọc, cán dao số 3, dao mổ số 12, khăn sạch, bật lửa, erlen 250 ml, becker 250 ml và 1000 ml, phễu lọc, đũa thủy tinh, ống đong 1000 ml, bình định mức 1000 ml,…

- Máy lắc tròn, bếp gas, nồi hấp khử trùng, máy đo pH, cân phân tích (OHAUS), máy sấy, máy chụp ảnh, đồng hồ,…

- Hộp nhựa L-621 (Ø 120 x 66,5 mm), xi-lanh (20 cc)

- Hóa chất: Đường D-glucose, Kalidyhydro phosphate (KH2PO4.3H2O), Magie

PHẦN III PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Nôi dung thực hiện

Khảo sát sự ảnh hưởng của các nguyên liệu tự nhiên từ thực vật đối với quy trình

nuôi trồng nấm Cordyceps militaris chay

3.2 Các phương thực hiện

Hình 3.1 Sơ đồ quy trình thực hiện thí nghiệm

Để thu được năng suất nấm cần khảo sát trong nghiên cứu đề tài, tôi tiến hành cấy chuyền từ giống lỏng sang các môi trường rắn (với thành phần (khảo sát), gạo lứt dịch

atm, đem bảo quản nơi thoáng mát, khô ráo để tiện dùng cho việc cấy chuyền Từ những chai giống lỏng ban đầu, hút 10 ml giống cho vào các hộp nhựa chứa môi trường dinh

bề mặt thì chuyển sang nuôi sáng ở cường độ ánh sáng từ 500 -1000 lux, nhiệt độ 18 –

Gạo lứt 45 g/hộp

Tảo xoắn Spirulina platensis

Dịch chiết khoai tây: cân 200g khoai tây bổ sung 1000ml nước cất đun sôi trong 20 phút sau đó lọc thu dịch chiết, bổ sung thêm:

Hóa chất

Đường D-glucose 0,005% Đường saccarozo 0,015%

Vitamin B1 1viên pH: 6,0 – 6,5 [4]

Gạo lứt và hợp chất tự nhiên (rong biển và tảo) cần trộn đều với nhau sau đó thêm dịch chiết khoai tây đạt ẩm độ 60 – 65% Giá thể sau phối trộn được hấp khử

3.2.3 Phương pháp thu chỉ tiêu trọng lượng quả thể nấm Cordyceps militaris

Cân trọng lượng tươi trong từng hộp: Cân khối lượng đĩa nhựa M1, cắt quả thể nấm sát đế rồi bỏ lên đĩa nhựa đem đi cân M2

M0 = M2 – M1 M0: Khối lượng tươi

M1: Khối lượng đĩa nhựa M2: Khối lượng cả nấm lẫn đĩa

Cân trọng lượng khô trong từng hộp: Lấy khối lượng tươi M0 của từng hộp mang

⮚ Xây dựng đường chuẩn

Hút 0,4ml dung dịch protein có nồng độ khác nhau từ trong ống nghiệm vừa pha ở trên theo thứ tự từ 1-6 vào 7 ống nghiệm sạch khác (gồm 2 ống Không và 5 ống từ 2-6) Thêm vào đó 2ml dung dịch C Lắc đều và để yên ở nhiệt độ phòng trong 5 phút Sau đó thêm 0,2ml thuốc thử Folin, lắc đều trong 5-10 phút, thêm nước cất cho đủ 5ml, đem đo mật độ quang ở bước sóng 360nm

Vẽ đồ thị biểu diễn sự biến thiên mật độ quang (∆OD) theo nồng độ protein chuẩn (µg/ml)

⮚ Xác định hàm lượng protein trong mẫu

Hút 0,4ml dung dịch protein cần phân tích, thêm 2ml dung dịch C, lắc đều để yên ở nhiệt độ phòng trong 5 phút Sau đó thêm 2ml thuốc thử Folin, lắc đều trong 5 - 10 phút Thêm nước cất cho đủ 5ml Đem đo mật độ quang ở bước song 750nm Nên làm 3 ống nghiệm để lấy trung bình, pha loãng mẫu nếu màu vượt ngoài đường chuẩn Từ đường chuẩn suy ra hàm lượng protein cần phân tích

3.2.5 Phương pháp xác định % Nitơ Kjeldahl

Tính % Nitơ khi đã xác định được % Protein từ phường pháp Lowry của nguyên liệu cần tìm

% Protein = F ∗ %N

F là hệ số chuyển đổi F đậu nành: 5,71

F rong biển và tảo biển: 6,25

Năng suất sinh học BE được tính theo công thức sau:

BE = 𝑲𝒉ố𝒊 𝒍ượ𝒏𝒈 𝒒𝒖𝒂̉ 𝒕𝒉ê ̉𝒌𝒉ố

Theo dõi chỉ tiêu về trọng lượng quả thể và số liệu được xử lý thống kê trên: Phần mềm Stagraphis plus 3.0

Phầm mềm Excel

3.3 Nôi dung khảo sát

nấm Cordyceps militaris nuôi trên môi trường gạo lứt

Mục đích: Chọn được loài rong biển phù hợp cho sự phát triện của quả thể nấm

Môi trường 1: 12% bột đậu nành (đối chứng)

Môi trường 2: 3,7% rong

Wakame Môi trường 3: 12% rong MơMôi trường 4: 8,8% rong Sụn

3.3.1.2 Bố trí thí nghiệm

Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm 1

3.3.1.3 Chỉ tiêu theo dõi thí nghiệm

- Năng suất: trọng lượng tươi (g), trọng lượng khô (g) - Đánh giá năng suất sinh học (%)

STT KÝ HIỆU THỨC NGHIỆM KHỐI LƯỢNG ( %) %NITO

3.3.2 Thí nghiệm 2: Tối ưu hàm lượng rong biển Wakame bổ sung vào môi trường nuôi quả thể nấm Cordyceps militaris trên giá thể gạo lứt

Mục đích: Xác định hàm lượng rong biển Wakame tối ưu để bổ sung vào môi

trường nuôi nấm Cordyceps militaris

Bố trí thí nghiệm theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 5 nghiệm thức, 3 lần lặp lại với mỗi lần 15 hộp

3.3.2.1 Sơ đồ thí nghiệm

Hình 3.3 Sơ đồ tiến hành thí nghiệm 2

Môi trường 1: 3,7% (đối chứng)Môi trường 2:

5,2%

Môi trường 3: 4,5%

Môi trường 4: 3%

Môi trường 5: 2,2%

Cấy chuyền

Cấy chuyền