khảo sát tính chất biểu hiện của microrna 155 và ebna 1 trên bệnh nhân ung thư vòm họng ở việt nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - ∞0∞ -

ĐÀO THỊ TRÀ MY

KHẢO SÁT TÍNH CHẤT BIỂU HIỆN

CỦA microRNA-155 VÀ EBNA-1 TRÊN

BỆNH NHÂN UNG THƯ VÒM HỌNG Ở VIỆT NAM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

TP HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - ∞0∞ -

ĐÀO THỊ TRÀ MY

KHẢO SÁT TÍNH CHẤT BIỂU HIỆN

CỦA microRNA-155 VÀ EBNA-1 TRÊN

BỆNH NHÂN UNG THƯ VÒM HỌNG Ở VIỆT NAM

I

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨAVIỆT NAM

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Độc lập – Tự do – Hạnh phúcKHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

GIẤY XÁC NHẬN

Tôi tên là: Đào Thị Trà My

Chuyên ngành: Y Dược – Khoa Công nghệ sinh học Mã sinh viên: 1853010097 Tôi đồng ý cung cấp toàn văn thông tin khóa luận tốt nghiệp hợp lệ về bản quyền cho Thư viện Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh Thư viện Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh sẽ kết nối toàn văn thông tin khóa luận tốt nghiệp vào hệ thống thông tin khoa học của Sở Khoa học và Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh

Ký tên

Ngày sinh: 25/01/2000 Nơi sinh: Đắk Lắk

II

Ý KIẾN CHO PHÉP BẢO VỆ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỦA GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN

Giảng viên hướng dẫn: TS Lao Đức Thuận

Học viên thực hiện: Đào Thị Trà My Lớp: DH18YD01 Ngày sinh: 25/01/2000 Nơi sinh: Đắk Lắk Tên đề tài: KHẢO SÁT TÍNH CHẤT BIỂU HIỆN CỦA microRNA-155 VÀ

EBNA-1 TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƯ VÒM HỌNG TẠI VIỆT NAM

Ý kiến của giáo viên hướng dẫn về việc cho phép sinh viên được bảo vệ khóa luận trước Hội đồng:

III

LỜI CẢM ƠN

Trong thời gian qua, em xin chân thành cảm ơn nhà trường và Ban Lãnh đạo Khoa đã hỗ trợ và tạo điều kiện thuận lợi để em làm khoá luận tốt nghiệp Trước tiên em xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến các thầy, cô giáo bộ môn của Khoa Công nghệ sinh học, Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh đã hỗ trợ, giúp đỡ và giảng dạy những kiến thức cốt lõi trong bốn năm học vừa qua để giờ em đã có thể thực hiện tốt khoá luận tốt nghiệp một cách tốt nhất

Để hoàn thành khoá luận tốt nghiệp này, em xin gửi lời cảm ơn đặc biệt đến Thầy - Tiến sĩ Lao Đức Thuận, người đã trực tiếp quan tâm hướng dẫn, giúp đỡ, tận tâm giảng dạy và truyền đạt những kiến thức, kinh nghiệm quý báu cho em, không chỉ các buổi học tập tại trường mà còn dành thời gian ngoại khoá để truyền đạt vốn kiến thức quý báu cho chúng em Cảm ơn những lời chia sẻ tâm huyết của thầy, em thật sự rất biết ơn

Bên cạnh đó, không thể không nhắc đến các bạn thành viên của phòng Sinh học phân tử, khoa Công nghệ Sinh học, Trường đại học Mở thành phố Hồ Chí Minh Em xin cảm ơn Thạc sĩ Thiều Hồng Huệ đã chỉ dẫn, góp ý tận tình và những người bạn Vũ Lâm Thông, Nguyễn Thành Đạt và các bạn trong phòng Sinh học phân tử đã nhiệt tình giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập cũng như khi em thực hiện và hoàn chỉnh khoá luận tốt nghiệp này

Một lần nữa, em xin trân trọng cảm ơn sự quan tâm giúp đỡ của các thầy, cô, anh, chị, bạn bè và gia đình đã luôn hỗ trợ và đứng sau là một động lực to lớn giúp em tự tin trong quá trình hoàn thành khoá luận tốt nghiệp này Với kiến thức hạn chế và không có nhiều kinh nghiệm nên khó tránh khỏi những thiếu sót Do đó, em rất mong nhận được sự góp ý của các thầy, cô để em có điều kiện hoàn thiện hơn kiến thức của mình

Em xin chân thành cảm ơn!

1 TỔNG QUAN VỀ UNG THƯ 4

1.1 Khái niệm về ung thư 4

1.2 Tình hình ung thư trên thế giới và Việt Nam 4

2 TỔNG QUAN VỀ UNG THƯ VÒM HỌNG 5

2.1 Sơ lược về ung thư vòm họng 5

2.2 Tình hình ung thư vòm họng trên thế giới và Việt Nam 6

2.3 Bệnh nguyên 7

3 MicroRNA (miRNA) 8

3.1 Quá trình sinh tổng hợp miRNA 8

3.2 Cơ chế điều hoà của miRNA 9

3.3 Sự biểu hiện miRNA-155 trong nhiều loại ung thư khác nhau 10

3.4 miRNA-155 biểu hiện trong ung thư vòm họng 12

4 EPSTEIN-BARR VIRUS 13

5 GENE EBNA-1 (Epstein-Barr Nuclear Antigene-1) 15

6 CHỨNG NỘI 18

6.1 Chứng nội (Internal Control) 18

6.2 U6 small nuclear RNA 2 (U6 snRNA) 18

7 PHƯƠNG PHÁP PCR VÀ RT-PCR 19

7.1 Polymerase Chain Reaction (PCR) 19

7.2 Reverse Transcription – Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) 20

PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

1.4 Quy trình nghiên cứu thực nghiệm 25

2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1 Khai thác cơ sở dữ liệu 26

2.2 Quy trình thực nghiệm 28

2.3 Phân tích thống kê 33

PHẦN III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 35

1 KẾT QUẢ KHẢO SÁT CƠ SỞ DỮ LIỆU 36

1.1 Kết quả thu nhận dữ liệu từ các công trình nghiên cứu liên quan đến miRNA-155 và bệnh UTVH 36

1.2 Kết quả trích xuất dữ liệu từ các công trình nghiên cứu phù hợp tiêu chí chọn lọc 37

1.3 Kết quả khảo sát mồi 40

1.4 Chu trình nhiệt tham khảo 49

2 KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM 50

2.1 Kết quả khuếch đại trình tự miRNA-155 50

2.2 Kết quả khuếch đại trình tự chứng nội U6 51

2.3 Kết quả khuếch đại trình tự EBNA-1 51

2.4 Kết quả khuếch đại trình tự chứng nội Beta-actin 52

3 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH THỐNG KÊ 53

VI

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1 1 Tỷ lệ ca mắc mới (incidence) và tỷ lệ tử vong (mortality) do ung thư trên

cả hai giới tính của từng khu vực trên thế giới 4

Hình 1 2 Vị trí giải phẫu của ung thư vòm họng 5

Hình 1 3 Bản đồ về tỷ lệ ung thư vòm họng trên thế giới (Globocan, 2020) 6

Hình 1 4 Con đường sinh tổng hợp của miRNAs 8

Hình 1 5 Sự bắt giữa miRNA và mạch mRNA đích 10

Hình 1 6 Cấu trúc hệ gene của EBV 14

Hình 1 7 Cấu trúc của Protein EBNA-1 16

Hình 1 8 Cấu trúc của 1 oriP 17

Hình 1 9 Cấu trúc của USP7 18

Hình 1 10 Nguyên tắc của phương pháp PCR 19

Hình 1 11 Nguyên tắc của phương pháp RT-PCR 20

Hình 2.1 Sơ đồ quy trình thực nghiệm 25

Hình 2.2 Sơ đồ mô tả quy trình chọn lọc công trình nghiên cứu 27

Hình 2.3 Chu trình nhiệt của phản ứng Reverse Transcriptase PCR 32

Hình 3 1 Sơ đồ quy trình chọn lọc công trình nghiên cứu 36

Hình 3 2 Kết quả khảo sát Annhyb của cặp mồi EBNA1-F và EBNA1-R 43

Hình 3 3 Kết quả khảo sát Annhyb của cặp mồi U6-F và U6-R 44

Hình 3 4 Kết quả khảo sát Annhyb của cặp mồi Beta-F và Beta-R 45

Hình 3 5 Kết quả bắt cặp của trình tự mồi EBNA-1-F-R với CSDL 46

Hình 3 6 Kết quả bắt cặp của trình tự mồi U6-F-R với CSDL 46

Hình 3 7 Kết quả bắt cặp của trình tự mồi Beta-actin với CSDL 46

VII

Hình 3 8 Hình sắp gióng cột trình tự mồi EBNA-1-F, R với trình tự trong CSDL có độ tương đồng cao nhất 47Hình 3 9 Hình sắp gióng cột trình tự mồi U6-F, R với trình tự trong CSDL có độ tương đồng cao nhất 48Hình 3 10 Hình sắp gióng cột trình tự mồi Beta-actin-F, R với trình tự trong CSDL có độ tương đồng cao nhất 49Hình 3 11 Chu trình nhiệt chung của U6, EBNA-1, beta-actin cho phản ứng Realtime PCR 49

Hình 3 12 Chu trình nhiệt phản ứng khuếch đại sự biểu hiện của miRNA-155 50

Hình 3 13 Sự biểu hiện của miRNA-155 được phát hiện trên các mẫu đại diện 50

Hình 3 14 Sự biểu hiện của chứng nội U6 được phát hiện trên các mẫu đại diện 51

Hình 3 15 Sự biểu hiện của EBNA-1 được phát hiện trên các mẫu đại diện 52

Hình 3 16 Sự biểu hiện của EBNA-1 được phát hiện trên các mẫu đại diện 52

Hình 3 17 Giá trị trung bình chu kỳ ngưỡng của miRNA-155 (A), U6 (B) trong mẫu bệnh và mẫu lành 55Hình 3 18 Giá trị trung bình chu kỳ ngưỡng của EBNA-1 (A) và Beta-actin (B) trong mẫu bệnh và mẫu lành 56Hình 3 19 Sự biểu hiện của miR-155 (A) và EBNA-1 (B) trong mẫu bệnh và mẫu lành 57

VIII

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1 1 Sự biểu hiện của miRNA-155 trong nhiều loại ung thư khác nhau 11

Bảng 2 1 Mẫu bảng ghi nhận trích xuất dữ liệu từ công bố trên thế giới 28

Bảng 2 2 Thành phần và thể tích các hóa chất cho quá trình chuyển đổi miRNA thành cDNA 32

Bảng 2 3 Thành phần phản ứng định lượng cho miRNA 33

Bảng 2 4 Thành phần phản ứng Realtime PCR 33

Bảng 3 1 Đặc điểm bộ dữ liệu nghiên cứu liên quan đến miRNA-21, miRNA-144, miRNA-155, miRNA-214 với bệnh UTVH 37

Bảng 3 2 Các thông số vật lý của các cặp mồi 40

Bảng 3 3 Sự biểu hiện dương tính của miRNA-155 lên các mẫu khảo sát 50

Bảng 3 4 Sự biểu hiện dương tính của chứng nội U6 lên các mẫu khảo sát 51

Bảng 3 5 Sự biểu hiện dương tính của EBNA-1 lên các mẫu khảo sát 51

Bảng 3 6 Sự biểu hiện dương tính của chứng nội Beta-actin lên các mẫu khảo sát 52

Bảng 3 7 Bảng kết quả phân tích thống kê sự biểu hiện của miRNA-155 và 1 53

EBNA-Bảng 3 8 Giá trị trung bình Ct của các mẫu sinh thiết mô UTVH và mẫu lành cùng với giá trị 2-ΔΔCt trong đánh giá biểu hiện của miRNA-155 và EBNA-1 so với chứng nội U6snRNA và Beta-actin 57

IX

DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT

miRNA: microRNA EBV: Epstein–Barr virus UTVH: Ung thư vòm họng

EBNA-1: Epstein-Barr Nuclear Antigen-1 BARTs: BamHI-A Right-ward Transcripts Pri-miRNA: Primary miRNA

Pre-miRNA: Precursor miRNA

DGCR8: Digeorge syndrome critical region 8 RAN-GTP: RAs-related Nuclear – GTP pathway RISC: RNA-induced silencing complex

PTEN: Phosphatase and tensin homolog RNA: Ribonucleic acid

UBQLN1: Ubiquilin-1

ZDHHC2: Zinc Finger DHHC2-Type Palmitoyltransferase 2 NF-kB: Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B SOCS1: Suppressor Of Cytokine Signaling 1

RhoA: ras homolog family member A

PDK1: Pyruvate dehydrogenase lipoamide kinase isozyme 1 STAT3: signal transducer and activator of transcription 3 SOCS6: Suppressor Of Cytokine Signaling 6

JMJD1A: Jumonji domain-containing 1A BACH1: BTB domain and CNC homolog 1

BCAT1: branched chain amino acid transaminase 1 DNA: Deoxyribonucleic acid

LCL: dòng tế bào lymphoblastoid bị nhiễm trùng vĩnh viễn EBER: Epstein-Barr virus-encoded small RNAs

USP7: USP7 binding sites FR: family of repeats

X

U6 snRNA: U6 small nuclear RNA NFκB: Nuclear factor kappa B PCR: Polymerase Chain Reaction PI3-K: phosphatidylinositol 3-kinase cDNA: Complementary DNA

qRT-PCR: Quantitative reverse transcription PCR

RT-PCR: Reverse Transcription – Polymerase Chain Reaction FBXW7: F-Box And WD Repeat Domain Containing 7

WHO: Tổ chức Y tế Thế giới WHO

LCL: dòng tế bào lymphoblastoid bị nhiễm trùng vĩnh viễn

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ung thư vòm họng (UTVH) là một khối u ác tính ở người, nó thường phát triển phổ biến ở vùng đầu, cổ và không có các triệu chứng cụ thể ở giai đoạn đầu nên việc phát hiện sớm rất khó khăn Việc lựa chọn phát triển các dấu chứng sinh học và chuẩn đoán sớm bệnh ung thư nói chung, UTVH nói riêng là việc mà các nhà khoa học, bác sĩ trên thế giới đã và đang quan tâm Trong đó, nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới đã khẳng định rằng sự biểu hiện của miRNA là một đặc điểm đặc trưng cho sự hình thành khối u Sự biểu hiện quá mức của miRNA có vai trò như các gene ức chế khối u, điều hoà làm giảm các protein có hoạt tính sinh ung thư Ngoài ra, miRNA hoạt động như oncogenes, ức chế các hoạt động của các gene ức chế khối u dẫn tới quá trình tăng sinh, hình thành mạch máu và sự xâm lấn

Sự biểu hiện mạnh mẽ của miR-155 được quan sát trong các tế bào khối u ung thư vòm họng, trong khi miR-155 có biểu hiện yếu trong các mẫu biểu mô vòm họng bình thường, nó có vai trò kép trong sự hình thành khối u của người và có chức năng như là chất sinh ung thư hoặc ức chế khối u ác tính ở người Bên cạnh đó, nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới đã báo cáo rằng sự xâm nhiễm của Epstein-Barr virus (EBV) liên quan đến 90% trường hợp mắc bệnh UTVH Điều đáng nhấn mạnh là các công trình đều khẳng định nhiễm EBV là căn nguyên dẫn đến ung thư vòm họng và sự hiện diện của EBV là một dấu chứng sinh học, xuất hiện sớm, mang tính tiên lượng bệnh cho ung thư vòm họng Sự hiện diện của EBV ở giai đoạn đầu dưới dạng tiềm tan và chỉ biểu hiện bệnh khi các gene virus chuyển sang trạng thái hoạt động (dạng

tan), trong đó, virus được kích hoạt một số gene như EBNA-1 (Epstein-Barr Nuclear

Antigen-1) mã hoá cho protein làm chúng nhân lên, nhiễm và tiến triển thành ung thư, khi người bệnh bị nhiễm sẽ gây đột biến đổi mô, phát triển thành khối u ác tính

Do đó, tính chất biểu hiện của miR-155 và EBNA-1 có thể là dấu hiệu đặc trưng, dấu

chứng sinh học của bệnh ung thư vòm họng ở giai đoạn sớm

Hiện nay trên thế giới, có nhiều đề tài nghiên cứu về vấn đề này phần lớn tập trung tại khu vực Châu Á, đặc biệt là ở miền Nam Trung Quốc Ở Việt Nam, theo thống kê của Globacan (2020), trường hợp mắc bệnh và tử vong hằng năm của ung thư vòm họng tại Việt Nam lần lượt là 6.040 ca, chiếm tỉ lệ 3.3% (đứng thứ chín) và

3.706 chiếm tỉ lệ 3.0% (đứng thứ bảy) Tuy nhiên vẫn chưa có nhiều công trình nghiên

cứu về miRNA-155 và EBNA-1 trên bệnh nhân UTVH ở Việt Nam Do đó, việc triển khai đề tài "KHẢO SÁT TÍNH CHẤT BIỂU HIỆN CỦA microRNA-155 VÀ EBNA-

1 TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƯ VÒM HỌNG Ở VIỆT NAM" với mong muốn

thiết lập cơ sở dữ liệu phân tử, xây dựng quy trình phát hiện sự biểu hiện của

microRNA-155 và EBNA-1 nhằm phát triển nhanh chóng khả năng ứng dụng chúng

vào tiên lượng hay chuẩn đoán sớm cho bệnh nhận ung thư vòm họng trên cộng đồng người Việt Nam

PHẦN I: TỔNG QUAN

1 TỔNG QUAN VỀ UNG THƯ

1.1 Khái niệm về ung thư

Ung thư là một nhóm bệnh được phát hiện ở hầu hết các cơ quan hoặc mô của cơ thể khi các tế bào của chúng phân chia một cách mất kiểm soát Các tế bào ung thư có khả năng di chuyển, xâm lấn đến các cơ quan khác (National Cancer Institute) Ung thư được bắt nguồn dựa trên sự phân loại của tế bào phân chia bất thường như: Ung thư biểu mô (Carcinoma): ung thư được bắt nguồn trong da hay các mô lót phủ trong các cơ quan của cơ thể, chẳng hạn như ung thư cổ tử cung, ung thư da, ung thư vòm họng, ung thư gan,… (National Cancer Institute); Ung thư mô liên kết (Sarcoma): đây là loại ung thư hiếm gặp, bắt nguồn từ xương, sụn, mạch máu hay các mô liên kết khác (Bartel và cs, 2004); Bệnh bạch cầu (Leukemia): ung thư bắt nguồn từ trong mô máu như tủy xương, sản xuất lượng lớn các tế bào máu bất thường (Barber và cs, 2005); Ung thư hệ thần kinh: ung thư bắt nguồn từ trong các mô hệ thần kinh, não và tủy sống (Bartel và cs, 2009) U lympho bào, tủy (Lymphoma): ung thư bắt nguồn từ các tế bào thuộc hệ miễn dịch của cơ thể (Benson và cs, 2008)

1.2 Tình hình ung thư trên thế giới và Việt Nam

Theo thống kê của cơ quan GBD (Global Burden of Diseases, Injuries, and Risk Factors Study), năm 2020, số ca mắc ung thư trên toàn cầu đã tăng lên 19,3 triệu ca

Hình 1.1 Tỷ lệ ca mắc mới (incidence) và tỷ lệ tử vong (mortality) do ung thư trên

cả hai giới tính của từng khu vực trên thế giới

trong đó (phụ nữ chiếm hơn 9,2 triệu ca, nam giới chiếm hơn 10 triệu ca) và 10 triệu ca tử vong do ung thư vào năm 2020 (Globocan, 2020) Ung thư vú đại diện cho 1 trong 4 bệnh ung thư được chẩn đoán ở phụ nữ trên toàn cầu Ung thư đại thực tràng, phổi, cổ tử cung và tuyến giáp cũng phổ biến ở phụ nữ Ungqq thư phổi và ung thư tuyến tiền liệt là những bệnh phổ biến nhất ở nam giới, chiếm gần một phần ba tổng số ca ung thư ở nam giới (Globocan, 2020) Đến nay, số lượng ca ung thư trên thế giới ngày càng gia tăng và trở thành một vấn đề cấp thiết toàn cầu Tại Việt Nam, theo thống kê của Bộ Y Tế và Tổ chức Y tế Thế giới (World Health Organization, WHO), mỗi năm Việt Nam có khoảng 180.000 ca mắc mới và trên 120.000 trường hợp tử vong do ung thư (Globocan, 2020)

2 TỔNG QUAN VỀ UNG THƯ VÒM HỌNG

2.1 Sơ lược về ung thư vòm họng

Ung thư vòm họng là một khối u phát triển từ biểu mô niêm mạc bao phủ bề mặt mũi họng thường phổ biến ở Nam Trung Quốc, Đông Nam Á và Bắc Phi, trong khi nó rất hiếm ở các nơi khác trên thế giới (Yang và cs, 2015) Ung thư vòm họng thường có tính xâm lấn cao ở giai đoạn cuối Do vị trí của khối u và không có các triệu chứng cụ thể nên việc phát hiện sớm rất khó khăn (Chou và cs, 2008) Việc lựa chọn phát triển các dấu chứng sinh học sớm sẽ giúp cứu sống bệnh nhân, nên ở đây việc khảo sát một số biểu hiện của các miRNA trên bệnh nhân ung thư vòm họng để chẩn đoán và phát hiện sớm ung thư vòm họng

Hình 1.2 Vị trí giải phẫu của ung thư vòm họng

Vị trí phổ biến nhất của ung thư là ở vòm họng phần trên cùng của hầu, nằm sau khoang mũi (khoang mũi sau) Khối u lan rộng phía trước vào khoang mũi, phía dưới vào vòm họng, phía trên vào hộp sọ Khi lan vào nền sọ sẽ dẫn đến chèn ép các dây thần kinh sọ não Bệnh nhân ung thư vòm họng thường có các triệu chứng biểu hiện phổ biến nhất là nổi cục ở cổ; triệu chứng ở mũi (chảy máu mũi, nước mũi có dính máu hoặc tắc nghẽn mũi); triệu chứng ở tai (tai bị tắc một bên, nghe kém hoặc ù tai); triệu chứng ở họng được ghi nhận là khạc ra máu (MacFarlane và cs, 2010)

2.2 Tình hình ung thư vòm họng trên thế giới và Việt Nam

Theo nghiên cứu của (Yap và cs, 2007), nhóm nghiên cứu nhận thấy rằng ung thư vòm họng là dạng ung thư hiếm trên thế giới Tuy nhiên, ung thư vòm họng lại rất phổ biến tại Trung Quốc, Đông Nam Á (đặc biệt là Việt Nam), Châu Phi, Canada, Alaska và Greenland Eskimos Theo thống kê của cơ quan nghiên cứu ung thư Quốc tế (International Agency for Research on Cancer, IARC), năm 2020, số lượng ca mắc bệnh ung thư vòm họng và tử vong lần lượt là 133.354 và 80.008 trường hợp (Globocan, 2020) Ở Việt Nam, ung thư vòm họng là loại ung thư đứng đầu trong các loại ung thư vùng đầu cổ với tỷ lệ mắc bệnh ung thư vòm họng tính đến năm 2020 là 5,3% và tỷ lệ tử vong hằng năm 3,3% (Globocan, 2020) Ngoài ra, tỷ lệ ca mắc mới

Hình 1.3 Bản đồ về tỷ lệ ung thư vòm họng trên thế giới (Globocan, 2020)

ở nam giới và nữ giới ở Việt Nam lần lượt là 8,1% và 2,8%, gấp khoảng 2,89 lần ở nam giới so với nữ giới (Globocan, 2020)

2.3 Bệnh nguyên

Ba nguyên nhân chính gây nên ung thư vòm họng, bao gồm: (1) sự xâm nhiễm của EBV (Epstein-Barr Virus); (2) yếu tố di truyền, hiện tượng epigenetics; (3) yếu tố môi trường (Zeng và cs, 2010)

Epstein-Barr Virus là một loại herpesvirus hiện diện ở hơn 90% người trưởng thành trên toàn thế giới, có tính chất mạn tính hoặc nhiễm cấp thời Nghiên cứu của (Chou và cs, 2008), cho thấy có khoảng trên 95% các mô ung thư có dương tính với EBV Sự hiện diện của EBV ở giai đoạn đầu dưới dạng tiềm tan và chỉ biểu hiện bệnh

khi các gene virus (EBNA-1, LMP, BARTs,…) chuyển sang trạng thái hoạt động (dạng

tan) nhằm giúp chúng nhân lên và gây nhiễm Lúc này, chúng sẽ gây biến đổi mô, tế bào của cơ thể, phát triển thành khối u ác tính (Chou và cs, 2008)

Các hiện tượng epigenetics có vai trò rất quan trọng trong việc hình thành và phát triển ung thư (Shenouda và cs, 2009) Hiện tượng epigenetics bao gồm các quá trình: methyl hóa, biến đổi protein histon và miRNA (Shenouda và cs, 2009) Trong đó, miRNA điều hòa biểu hiện gene bằng cách gắn vào vùng 3'-UTR của các mRNA đích (target mRNA) của chúng, kết quả là sự ức chế hoặc giảm chức năng của mRNA đích, được chứng minh là có liên quan đến một loạt các quá trình sinh học như tế bào phân chia, gia tăng, phân biệt, apoptosis, di căn, phản ứng stress, (Bartel và cs, 2009)

Yếu tố môi trường cũng được nhiều công trình nghiên cứu chứng minh có vai trò trong việc hình thành khối u vòm họng Điển hình, sự khác biệt về khu vực địa lý, thói quen sinh hoạt,… dẫn đến ung thư vòm họng tại các khu vực khác nhau trên thế giới Theo (Yu và cs, 2002) các món ăn truyền thống của miền Nam Trung Quốc, chẳng hạn như món cá muối của Quảng Đông và các thực phẩm bảo quản chứa chất dễ bay hơi nitrosamine là yếu tố gây ung thư vòm họng (Mimi và cs, 2002) Các yếu tố khác bao gồm hút thuốc, bụi và các hợp chất hoá học như là formaldehyde cũng

được cho là có liên quan đến ung thư vòm họng (Huang và cs, 2018; Zeng và cs, 2010)

3 MicroRNA (miRNA)

3.1 Quá trình sinh tổng hợp miRNA

MicroRNA (miRNA) là một họ các phân tử RNA không mã hoá, nó có chiều dài 19 – 25 nucleotide Tham gia vào quá trình điều hòa sau phiên mã, sự biểu hiện gene ở tế bào eukaryote (Huang và cs, 2018; Lee và cs, 2003; Zen và cs, 2012) Theo ước tính, gene mã hóa cho miRNA chiếm khoảng 1 – 5% bộ gene người và tham gia sự điều hòa ít nhất 30% tổng lượng miRNA (Jiang và cs, 2015; Zen và cs, 2012) miRNAs được phát hiện vào năm 1993 bởi Ambros et al., có tên là miRNA lin-4 trên loài Caenorhabditis elegans, hơn 20.000 phân tử miRNA được phát hiện trên 193 loài khác nhau và trong đó gần 1.000 miRNA được phát hiện ở người Toàn bộ thông tin về miRNA được lưu trữ trên cơ sở dữ liệu miRbase (http://www.mirbase.org/)

Hình 1 4 Con đường sinh tổng hợp của miRNAs

Quá trình sinh tổng hợp miRNA bao gồm các sự kiện xảy ra trong nhân và sau đó xảy ra trong tế bào chất (Khoo và cs, 2013; Kim và cs, 2009) Ở giai đoạn trong nhân, các gene mã hóa cho miRNA hay các vùng intron mã hóa (coding intron) được phiên mã bởi RNA polymerase II tạo thành phân tử miRNA sơ cấp (primary miRNA, pri-miRNA) Về cấu trúc, phân tử pri- miRNA chứa một đến hai cấu trúc kẹp tóc

(Khoo và cs, 2013) Các phân tử pri-miRNA đầu 5’ được gắn mũ chụp và đầu 3’ có cấu trúc dạng poly (A) (Zen và cs, 2012)

Sau đó các phân tử pri-miRNA được biến đổi thành phân tử pre-miRNA (precursor miRNA) với cấu trúc thứ cấp có chiều dài khoảng 70 nucleotide với đầu 5’ phosphate và 3’ nhô ra 2 nucleotide (Khoo và cs, 2013; Lee và cs, 2003) Quá trình biến đổi này cần thiết phải có sự hỗ trợ của phân tử Drosha (Khoo và cs, 2013; Lao và cs, 2019) Drosha chỉ thể hiện hoạt tính phân cắt khi hình thành phức hợp với một phân tử protein dsRBD có tên là Pasha (trong Drosophila) hay DGCR8 (trong động vật có vú), để phân cắt pri- miRNA thành pre-miRNA (Khoo và cs, 2013; Lao và cs, 2019; Lee và cs, 2003)

Phân tử pre-miRNA được tạo thành, đầu 3’ có 2 nucleotide nhô ra, sẽ được phân tử exportin-5 nhận diện và vận chuyển ra khỏi nhân, vào trong tế bào chất Ở giai đoạn xảy ra trong tế bào chất, pre-miRNA biến đổi tiếp theo thông qua con đường RAN-GTP (RAs-related Nuclear – GTP pathway) (Okada và cs, 2009; Plieskatt và cs, 2014) Khi đi vào trong tế bào chất, pre-miRNA tiếp tục bị cắt bởi phân tử Dicer có tạo thành miRNA dạng mạch đôi có chiều dài khoảng 18 - 25bp (Mimi và cs, 2002) Tiếp theo, phân tử miRNA mạch đôi được tháo xoắn, một trong hai mạch sẽ bị phân hủy nhanh chóng, mạch còn lại chính là miRNA trưởng thành (Cifuentes và cs, 2010; Filipowicz và cs, 2008)

3.2 Cơ chế điều hoà của miRNA

Trong ung thư, cơ chế phân tử của miRNA đóng vai trò ở hai trạng thái: vai trò sinh ung (oncogenic miRNA) và vai trò ức chế khối u (tumor suppressor miRNA) Nếu một miR được biểu hiện dư và ức chế quá trình tổng hợp một hoặc nhiều protein ức chế khối u đó là các miR gây ung thư (oncogenic miR) Nếu một miR được biểu hiện thiếu và ức chế sự tổng hợp một hay nhiều protein gây ung thư đó là miR ức chế khối u (tumor suppressor miR) (Sun và cs, 2013; Zen và cs, 2012)

Các phân tử miRNA tham gia vào quá trình điều hoà âm sự biểu hiện gene bằng gắn vào đầu 3’ vùng không dịch mã (3’UTR) của mRNA, làm cho mRNA bị phân huỷ hoặc sự dịch mã xảy ra trên phân tử mRNA này bị khoá (Zeng và cs, 2010)

Hình 1 5 Sự bắt giữa miRNA và mạch mRNA đích

Giai đoạn đầu tiên, miRNA trưởng thành gắn kết với protein Ago (là nhân tố khởi đầu dịch mã 2C2 – eIF2C2 ở eukaryote) và phức hợp RISC để tạo thành phức hợp miRNA-RISC (RNA-induced silencing complex) (Lao và cs, 2021) Phức hợp miRNA-RISC gắn lên vùng 3’UTR của mRNA thông qua sự bắt cặp bổ sung của các base giữa mRNA với trình tự trên mạch dẫn (guide strand) của phân tử miRNA theo nguyên tắc bổ sung (Sun và cs, 2013) Sự nhận diện này phụ thuộc rất nhiều vào sự bắt cặp bổ sung của base giữa vùng “seed” (vùng trung tâm) trên phân tử miRNA (Filipowicz và cs, 2008; Lao và cs, 2021) Vùng “trung tâm” là vùng trình tự nằm ở đầu 5’ phân tử miRNA có kích thước 2-7 nucleotide (Filipowicz và cs, 2008; Jiang và cs, 2015; Sun và cs, 2013)

Sự bắt cặp giữa các cặp base giữa vùng “trung tâm” với vùng trình tự trên mRNA có thể trùng khớp hoàn toàn hoặc không trùng khớp hoàn toàn và quyết định tính ổn định tương tác giữa miRNA với mRNA (Lao và cs, 2021; Zou và cs, 2019) Một phân tử miRNA có khả năng điều hoà nhiều trình tự mRNA đích (Lao và cs, 2021)

3.3 Sự biểu hiện miRNA-155 trong nhiều loại ung thư khác nhau

Cho đến nay, nhiều nghiên cứu đã chứng minh biểu hiện của miRNA là một đặc điểm đặc trưng cho sự hình thành khối u Sự biểu hiện quá mức của miRNA có vai trò như các gene ức chế khối u, điều hoà làm giảm các protein có hoạt tính sinh ung

thư Ngoài ra, miRNA hoạt động như oncogenes, ức chế các hoạt động của các gene ức chế khối u dẫn tới quá trình tăng sinh, hình thành mạch máu và sự xâm lấn (Shenouda và cs, 2009; Zhang và cs, 2007) Trong đó, có nhiều nghiên cứu chứng minh miRNA-155 có liên quan đến các loại ung thư ở người, bao gồm ung thư vòm họng (Faraoni và cs, 2009, Yang và cs, 2015; Zou và cs, 2019), ung thư biểu mô tuyến giáp (Faraoni và cs, 2009; Xue và cs, 2016), ung thư ruột kết (Faraoni và cs, 2009), ung thư cổ tử cung (Faraoni và cs, 2009, Wang và cs, 2016), ung thư biểu mô tuyến tụy (Faraoni và cs, 2009; Huang và cs, 2018), ung thư phổi (Faraoni và cs, 2009, Wang và cs, 2018),… (bảng 1.1) Nó có vai trò kép trong sự hình thành khối u của người: có chức năng như là chất sinh ung thư hoặc ức chế khối u ở các khối u ác tính ở người

Bảng 1 1 Sự biểu hiện của miRNA-155 trong nhiều loại ung thư khác nhau

Loại ung thư Sự biểu hiện /

vai trò Gene đích Con đường tín hiệu

Tài liệu tham khảo

Ung thư vòm họng

Tăng/ Oncogene

PTEN, UBQLN1, ZDHHC2

PI3K/AKT, NF-kB

(Faraoni và cs, 2009; Yang và cs, 2015; Zou và

2009)

Ung thư cổ tử cung

Giảm/ tumor

(Faraoni và cs, 2009; Wang và cs,

2018)

Ung thư phổi Tăng/ Oncogene

SOCS1, SOCS6, PTEN

(Faraoni và cs, 2009; Wang và cs,

2018)

3.4 miRNA-155 biểu hiện trong ung thư vòm họng

miRNA-155 do gene không mã hoá dài 65 nucleotide, có định vị trên nhiễm sắc thể số 21, vị trí bắt đầu từ 25.573.980 và kết thúc tại vị trí 25.574044 Sản phẩm pre-miR-155 dài 62 nucleotide; trong khi miRNA-155 trưởng thành dài 23 nucleotide Trình tự miR-155 không tương đồng với hầu hết các trình tự miRNA khác đã được công bố Ngoài ung thư vòm họng, miRNA-155 cũng được ghi nhận biểu hiện cao ở các loại ung thư khác như: ung thư biểu mô tuyến giáp, ung thư ruột kết, ung thư cổ tử cung, ung thư phổi (Faraoni và cs, 2009) Một số chức năng điển hình của miRNA-155 có thể ghi nhận như kháng apoptotic, di căn và xâm lấn trên nhiều khối u

miRNA-155 biểu hiện khác biệt có liên quan đến sự tiến triển của ung thư, thúc đẩy sự tăng sinh, ức chế chương trình chết của tế bào Theo Yang và cộng sự,

2015, miRNA-155 có thể làm điều hoà giảm trên gene UBQLN1 Thông qua việc giảm sự biểu hiện của gene UBQLN1, miRNA-155 có thể tăng cường khả năng sống

sót của tế bào ung thư vòm họng và thay đổi chu trình tế bào nhằm tăng khả năng

kháng phóng xạ Theo Du và cộng sự, 2011, sự điều hoà giảm của 2 gene JMJD1A và BACH1 dự đoán khả năng sống sót kém trong ung thư vòm họng và đây có thể

ứng dụng làm dấu chứng sinh học Theo Hui và cộng sự, 2017, trong ung thư vòm

họng ở các giai đoạn bệnh lý khác nhau và sự thiếu hụt BCAT1 làm giảm sự tăng sinh

tế bào khối u và giảm khả năng di chuyển và xâm lấn của tế bào Sự biểu hiện của miRNA-155 được chứng minh là biểu hiện dư trong các mẫu mô UTVH dương tính với EBV Sự biểu hiện mạnh mẽ của miRNA-155 được quan sát trong các tế bào khối u UTVH, trong khi miRNA-155 có biểu hiện yếu trong các mẫu biểu mô vòm họng bình thường (Thuận và cs, 2019; Du và cs, 2011)

EBV chứa bộ gene DNA sợi đôi, xoắn, mạch hở, có kích thước 170180 kb (Price và cs, 2014) EBV có hai dạng: (1) dạng vòng (episome) tồn tại trong tế bào khi virus chuẩn bị bước sang giai đoạn tan; (2) dạng mạch thẳng tồn tại trong tế bào sau khi bị xâm nhiễm (Fuentes-González và cs, 2013) EBV tồn tại dạng khối cầu bao gồm vỏ capsid, vỏ ngoài và bộ gene virus

Trong in vitro, tế bào lymphoblastoid bị nhiễm trùng vĩnh viễn (LCL) được

EBV chuyển đổi hiệu quả các tế bào B đang nghỉ ngơi thành các dòng (Tao và cs,

2006; Young và cs, 2004; Rickinson và cs, 2001) Các LCL được tạo ra do nhiễm

trùng tế bào lympho B in vitro mang nhiều bản sao DNA virus hình tròn, ngoại bào

(episomes) trong mỗi tế bào và biểu hiện bộ gene của virus, bao gồm 6 kháng nguyên

hạt nhân EBNAs (-1, -2, -3A, -3B, -3C, và -LP) và 3 protein màng tế bào tiềm ẩn

LMPs (-1, -2A và -2B) Ngoài các protein tiềm ẩn, LCL cũng cho thấy sự biểu hiện

đa dạng của các RNA nhỏ mã hóa EBV không được polyadenyl hóa (EBER) là

EBER1 và EBER2 và ba protein thuộc họ BARTs là RPMS1, A73, BARF0; những

protein này được thể hiện trong tất cả các dạng nhiễm EBV tiềm ẩn và chúng cũng là mục tiêu đáng chú ý để phát hiện EBV trong các khối u (Tao và cs, 2006; Young và cs, 2004, Rickinson và cs, 2001)

Các gene trong EBV đều có chức năng riêng và bổ trợ lẫn nhau Sáu gene mã

hóa cho protein kháng nguyên nhân EBNAs có liên quan đến quá trình xâm nhiễm

và nhân lên của EBV ở giai đoạn đầu Ngoài ra, sự phối hợp hoạt động của các kháng nguyên hạt nhân giúp kiểm soát biểu hiện gene của virus và vật chủ thông qua việc tương tác trực tiếp với các mạch điều khiển tế bào trong nhân; ba gene mã hóa cho

Hình 1 6 Cấu trúc hệ gene của EBV (Price, A M và cs, 2014)

protein màng LMPs chịu trách nhiệm cho việc kích hoạt và sống sót của tế bào B là

mô phỏng của các protein tín hiệu tế bào, liên quan đến chu trình tăng trưởng của EBV trong tế bào B và có thể kích thích tạo u, góp phần khiến u lành trở thành u ác tính; ngăn chặn quá trình apoptosis và sản sinh IL-10 (interleukin 10) là chức năng

của hai gene không mã hóa RNA EBER (Cohen và cs, 1991; Muray và cs, 2001) và ba protein thuộc họ BARTs liên quan đến đường truyền tín hiệu Notch, điều hòa lượng

Ca2+ trong tế bào (Al-Mozaini và cs, 2009; Brooks và cs, 1993; Smith và cs, 2000) Ở cơ thể người sau khi bị xâm nhiễm, EBV có 3 hướng tiến triển Hướng đầu tiên, EBV xâm nhập vào tế bào biểu mô, ở đây chúng tìm thấy các điều kiện thích ứng và bắt đầu nhân lên, tạo ra vô số vòng đời sau hoặc EBV có thể chuyển từ sơ nhiễm sang gây nhiễm thứ cấp bằng cách nhân lên mãnh liệt trong lympho B, sau đó giải phóng virus vào nước bọt, hoặc chuyển từ sơ nhiễm sang tàng nhiễm và tiến đến ung thư Hướng thứ hai, EBV gây sơ nhiễm và xâm nhập vào tế bào lympho B, tiếp đó thực hiện sự nhân lên: EBV sơ nhiễm sẽ tìm đến tế bào lympho B vùng họng để xâm nhập và nhân lên trong tế bào này Virus sẽ được giải phóng ra hàng loạt bằng cách dung giải tế bào, chúng xâm nhiễm vào quần thể lympho B và gây nhiễm thứ cấp, kết quả là một lượng virus EBV được giải phóng và có nhiều trong nước bọt Lúc này, EBV quay lại gây nhiễm cho tế bào biểu mô Hướng thứ ba, EBV tàng nhiễm và tiến triển thành ung thư khi có điều kiện: EBV thực hiện gây nhiễm bán sinh sản và tàng nhiễm trong tế bào lympho B, thực hiện quá trình chuyển đổi lympho B và biệt hóa, khiến chúng tăng sinh và tiến triển thành ung thư (Phúc và cs, 2008)

Hiện nay, nghiên cứu các gene của EBV được xem là mục tiêu nhắm đến để tìm ra các phương pháp sàng lọc, chẩn đoán cho bệnh nhân UTVH bằng phương pháp sinh học phân tử Hướng nghiên cứu hướng tới đa dạng như nghiên cứu đột biến, biểu hiện gene, tính đa hình,…và nhiều dạng khác, giúp cơ sở dữ liệu về EBV ngày càng đầy đủ và làm rõ ràng hơn mối quan hệ giữa EBV và UTVH

5 GENE EBNA-1 (Epstein-Barr Nuclear Antigene-1)

Epstein–Barr nuclear antigene 1 (EBNA-1) mã hóa cho kháng nguyên duy nhất

biểu hiện ở tất cả những dạng tiềm tan của EBV, trong các tế bào tăng sinh mà có

nguyên nhân liên quan tới nhiễm EBV (Frappier và cs, 2015).Trong các nghiên cứu

đều cho thấy việc EBNA có các vai trò liên quan tới quá trình sao chép và phân ly

nguyên phân của các đoạn EBV dẫn đến sự tồn tại ổn định của các đoạn gene EBV

trong giai đoạn phát triển của khối u EBNA-1 cũng kích hoạt phiên mã các gene EBV

tiềm tan khác, quan trọng đối với sự bất tử của tế bào Các chức năng này yêu cầu

liên kết EBNA-1 với các phần DNA cụ thể trên đoạn EBV latent origin of DNA

replication (oriP), oriP được xác định bằng cách sàng lọc các đoạn DNA EBV để có khả năng cho phép sao chép và duy trì ổn định plasmid trong tế bào người đã bị nhiễm EBV

Cấu trúc của một Protein EBNA-1 bao gồm các Domain: Vùng giàu Gly–Arg (Gly–Arg-rich regions), hai vùng lặp Gly–Ala (Gly–Ala repeat), Vùng gắn kết USP7

(USP7 binding sites) và vùng nhị hóa và gắn kết với DNA (DNA binding and

Hình 1 7 Cấu trúc của Protein EBNA-1

Trong đó vị trí của vùng gắn kết với USP7 ở vị trí từ amino acid thứ 442 cho tới amino acid 450 có tác dụng liên kết với gene USP7 một gene có chức năng ức chế

tăng trưởng tế bào và điều hòa apoptosis trên oriP và từ đó ức chế khả năng nhân đôi

của DNA (Holowaty và cs, 2003) EBNA-1 thực hiện chức năng nhân đôi qua việc

liên kết với một oriP (origin of plasmid) Các nghiên cứu sau đó cho thấy rằng protein

virus duy nhất cần thiết cho sự sao chép của plasmid oriP là EBNA-1 Cả hai đoạn

EBV và plasmid oriP đều được phát hiện sao chép một lần mỗi chu kỳ tế bào và khả năng sao chép DNA của oriP bắt nguồn từ cấu trúc

Một oriP bao gồm 2 phần chính đó là: the dyad symmetry (DS) element và the

family of repeats (FR) DS chứa bốn vị trí nhận dạng EBNA-1, hai trong số đó nằm

trong chuỗi DS 65 bp đầu tiên DS là nguồn gốc của sự sao chép trong oriP (Gahn và

cs, 1989) và đã được chứng minh là cần thiết để sao chép plasmid với sự hiện diện

của EBNA-1 Phần thứ 2 là family of repeats (FR) mỗi FR sẽ bao gồm 20 EBNA-1 binding site, với mỗi EBNA-1 binding site sẽ là một đoạn trình tự dài 30 bp chức năng

chính của FR là duy trì sự phiên mã của EBV (Hodin và cs, 2013)

Hình 1 8 Cấu trúc của 1 oriP

Trong khi EBNA-1 là protein EBV duy nhất tham gia vào quá trình sao chép

DNA ở pha tiềm tan thì nó thiếu bất kỳ hoạt động nào của enzyme, bao gồm cả DNA helicase thường được tìm thấy trong các loại Virus khác, việc này làm cho EBV phải dựa vào các protein tế bào vật chủ để tái tạo các episomes của nó

Các nghiên cứu sau này đã cho thấy chức năng của USP7 đến các protein như P53, MDM2 và EBNA-1 có chức năng điều hòa các Protein như P53, MDM2 và EBNA-1, phần đầu TRAF của USP7 có khả năng liên kết với cả 3 Protein P53, MDM2 và

EBNA-1 làm gia tăng sự ổn định của các Protein bằng cách loại bỏ các chuỗi

polyubiquitin thường báo hiệu sự suy thoái, tuy nhiên do ái lực của EBNA-1 lớn 2 Protein còn lại nên EBNA-1 thường xảy ra liên kết với USP7, điều này dẫn tới việc thiếu ổn định của Protein ức chế khối u P53 và MDM2 và làm khối u phát triển hơn so với các mẫu chứng ở các thực nghiệm có liên quan tới 3 Protein P53, MDM2 và

EBNA-1 (Frappier và cs, 2012)

Hình 1 9 Cấu trúc của USP7

6 CHỨNG NỘI

6.1 Chứng nội (Internal Control)

Housekeeping gene là một nhóm các gene thiết yếu để duy trì các chức năng cơ bản của tế bào, cần thiết cho sự tồn tại của một tế bào, bất kể vai trò cụ thể của nó trong mô và sinh vật cụ thể Chúng được thể hiện trong tất cả các tế bào của sinh vật trong điều kiện bình thường, không phân biệt loại mô, giai đoạn phát triển, trạng thái chu trình tế bào hoặc các tác động bên ngoài (Koonin và cs, 2000; Fraser và cs, 1995; Eisenberg và cs, 2013)

Housekeeping gene được sử dụng rộng rãi như là chứng nội cho các nghiên cứu thực nghiệm (northern blotting, western blotting, PCR, qPCR,…) (Thellin và cs, 1999) Nó thường được cho là có tính tương đối ổn định ở trong tất cả các loại tế bào của cơ thể và duy trì các chức năng cơ bản của tế bào (Lin và cs, 2012)

6.2 U6 small nuclear RNA 2 (U6 snRNA)

U6 snRNA là một small nuclear RNA (snRNA) không mã hóa, là thành phần của U6 snRNP (small nuclear ribonucleoprotein), là một nhóm các phân tử RNA nhỏ được tìm thấy trong “splicing speckles” và “Cajal bodies” trong nhân của tế bào eukaryote (Matera và cs, 2007) Theo Brow và cộng sự, 1988 trình tự chuỗi U6 snRNA là trình tự được bảo tồn cao nhất trên năm trình tự snRNA liên quan đến spliceosome, cho thấy snRNA U6 không thay đổi qua quá trình tiến hóa

Các chứng nội của phân tử RNA có biểu hiện cao và ổn định trong các mẫu nghiên cứu chủ yếu là 5S rRNA, 5,8S rRNA, 18S rRNA, U6 snRNA, U87scaRNA

Do đó, nhóm nghiên cứu chọn U6 snRNA là chứng nội trong qPCR (Copela và cs, 2008; Michael và cs, 2003; Hellwig và cs, 2008; Fok và cs, 2006)

7 PHƯƠNG PHÁP PCR VÀ RT-PCR

7.1 Polymerase Chain Reaction (PCR)

Polymerase Chain Reaction (PCR) là phương pháp tạo dòng DNA in vitro để

tổng hợp nhanh một đoạn DNA với độ nhạy rất cao Phương pháp PCR dựa trên hoạt động của DNA polymerase trong quá trình tổng hợp DNA mới từ mạch khuôn Enzyme DNA polymerase xúc tác phản ứng tổng hợp mạch DNA mới từ mạch khuôn với sự hiện diện của mồi chuyên biệt Đó là những đoạn oligonucleotide ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với DNA mạch khuôn Hai mồi bắt cặp bổ sung với hai đầu của trình tự DNA mạch khuôn: mồi xuôi (forward primer) và mồi ngược (reverse primer) DNA polymerase sẽ kéo dài đoạn trình tự giữa hai mồi để hình thành một mạch mới hoàn chỉnh (Saiki và cs, 1985; Vân, 2009)

Hình 1 10 Nguyên tắc của phương pháp PCR

Một phản ứng PCR là một chuỗi lặp lại liên tục của nhiều chu kì, mỗi chu kì gồm 3 giai đoạn: (1) Giai đoạn biến tính (denaturation): tách chuỗi DNA từ mạch đôi thành mạch đơn (2) Giai đoạn bắt cặp (annealing): mồi được bắt cặp với trình tự theo nguyên tắc bổ sung (3) Giai đoạn kéo dài (extension): tổng hợp chuỗi DNA mới, Sau n chu kỳ tạo được một lượng lớn bản sao 2n giống chuỗi DNA gốc (Saiki và cs, 1985)

7.2 Reverse Transcription – Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)

RT-PCR là phương pháp PCR mà trình tự nucleotide đích cần phải phát hiện là RNA Thực hiện được phương pháp này trước hết RNA đích phải được phiên mã ngược (RT, reverse transcription) thành cDNA, dùng PCR để khuếch đại trình tự đích trong cDNA bằng cặp mồi đặc hiệu hoặc ngẫu nhiên Enzyme được làm trong giai đoạn này là Reverse transcriptase, sử dụng mạch đơn RNA làm sợi khuôn để tổng hợp nên sợi DNA bổ sung (cDNA, complementary DNA), giai đoạn RT còn được gọi là giai đoạn tổng hợp cDNA Để enzyme reverse transcriptase có thể tổng hợp mạch đơn RNA từ sợi khuôn thành cDNA, cần phải có mồi (đặc hiệu hoặc ngẫu nhiên), tiếp đến mồi sẽ bắt cặp bổ sung trên sợi khuôn RNA để enzyme reverse trancriptase trượt trên mạch khuôn RNA và kéo dài được mạch cDNA (Haddad và cs, 2010)

Hình 1 11 Nguyên tắc của phương pháp RT-PCR

Để khuếch đại cDNA này, mồi được sử dụng trong giai đoạn RT có thể là mồi đặc hiệu cho trình tự RNA, mồi sẽ được thiết kế chuyên biệt cho trình tự RNA nhất định và khuếch đại được đoạn RNA mong muốn (Haddad và cs, 2010).

PHẦN II:

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1 VẬT LIỆU

1.1 Các trang web và phần mềm được sử dụng

Cơ sở dữ liệu NCBI (National Center for Biotechnology Information)

(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/): là một cơ sở dữ liệu về sinh học dùng cho việc khai thác thông tin

Cơ sở dữ liệu miRBase (https://mirbase.org/): là một cơ sở dữ liệu về sinh học lưu trữ các chú thích và trình tự các chuỗi microRNA công khai Mỗi một thành phần trong cơ sở dữ liệu miRBase đại diện cho một trình tự hairpin (trình tự cấu trúc kẹp tóc) dự đoán của một phiên mã, kèm theo các thông tin về vị trí và thứ tự của chuỗi miRNA trưởng thành

Phần mềm trực tuyến TargetScan 8.0 (http://www.targetscan.org/vert_80/): là một phần mềm nhằm dự đoán các vị trí bắt cặp bổ sung của miRNA trên phân tử mRNA đích

Pictar (http://www.pictar.mdc-berlin.ed/); miRTarBase

các phần mềm trực tuyến, nhằm dự đoán các trình tự đích (mRNA) của miRNA

Phần mềm Annhyb phiên bản 4.946 (Olivier Faird, 2012): là phần mềm dùng

thực hiện các thao tác xử lý trên các trình tự nucleotide, bao gồm các tính năng như đọc trình tự, chú thích trình tự, tìm kiếm và sắp xếp các trình tự oligonucleotide,…

Phần mềm Clustal X 2.0: là phần mềm dùng để so sánh nhiều trình tự nucleotide

hay amino acid, kết quả của việc so sánh này giúp cho người nghiên cứu có thể tìm ra các vùng bảo tồn hay biến động giữa các trình tự với nhau

Cơ sở dữ liệu miRDB (http://mirdb.org/): là một trang cơ sở dữ liệu trực tuyến cho dự đoán mục tiêu miRNA và các chức năng của chúng

1.2 Mẫu thí nghiệm

Mẫu bệnh phẩm lấy từ sinh thiết mô vòm họng được thu nhận từ các bệnh nhân đến khám và mẫu lành lấy từ dịch phết vòm họng thu nhận từ các tình nguyện viên

khỏe mạnh, không mắc bệnh ung thư vòm họng tại Bệnh viện Chợ Rẫy, Thành phố Hồ Chí Minh, được chẩn đoán là mắc bệnh ung thư vòm họng (Được sự cho phép của hội đồng y đức Bệnh viện Chợ Rẫy, Thành phố Hồ Chí Minh) Bộ mẫu gồm 10 mẫu mô được chẩn đoán chính xác bằng giải phẫu bệnh là ung thư vòm họng thông qua các phương pháp nhuộm Hematoxylin và Eosin (HE) Đồng thời, 10 mẫu ở dạng dịch phết được thu nhận và kiểm tra âm tính với kết quả nhuộm HE Các mẫu sau khi thu nhận được bảo quản trong dung dịch PBS (Phosphate Buffer Saline), dùng để đối chứng Bộ mẫu này được bảo quản trong dung dịch PBS, ở nhiệt độ thấp và chuyển về phòng thí nghiệm tiến hành các phương pháp thực hiện sau này

1.3 Dụng cụ - thiết bị - hóa chất

1.3.1 Dụng cụ

Các dụng cụ thông thường được sử dụng trong phòng thí nghiệm sinh học phân tử, bao gồm các dụng cụ chính như: kẹp lấy mẫu, đèn cồn, eppendorf, micro pipette, đầu tip, ống đong, erlen,…

1.3.2 Thiết bị

Máy vortex (Vortex ZX3, Velp Ý), máy ly tâm lạnh (Hettich Universal 320R, Đức), bộ điện di DNA (Biorad), tủ lạnh (LG), tủ đông (Sanyo), tủ ủ nhiệt (Multitemp III), cân kỹ thuật (Satorious, Đức), tủ hút khí độc (Ascent Max), máy quang phổ kế (Scanning UV/VIS), máy luân nhiệt (My-cycle Thermal, Biorad), lò vi sóng (Sharp), Máy realtime PCR MyGo Mini ITIS (Anh)

1.3.3 Hóa chất

1.3.3.1 Hóa chất sử dụng cho quy trình tách chiết DNA

Tris HCl, EDTA, SDS 10%, NaCl, ddH2O, Proteinase K, Phenol, Chloroform, Isoamylalcohol, NaOAc, Isopropanol, TE 1X

1.3.3.2 Hóa chất sử dụng cho quy trình tách chiết miRNA

Sử dụng bộ Kit tách miRNA mirVana™ miRNA Isolation Kit

1.3.3.3 Hóa chất sử dụng cho quy trình chuyển đổi mRNA thành cDNA

Sử dụng bộ Kit chuyển đổi SensiFAST™ cDNA Synthesis Kit, Master Mix (2X)

1.3.3.4 Hóa chất sử dụng cho quy trình Realtime PCR

SensiMix II Probe Mix (2X), mồi Taqman cho từng miRNA, nuclease-free water

1.4 Quy trình nghiên cứu thực nghiệm

Hình 2 1 Sơ đồ quy trình thực nghiệm

2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Khai thác cơ sở dữ liệu

2.1.1 Tiêu chuẩn thu nhận, chọn lọc, loại bỏ các công trình nghiên cứu khoa học đã công bố

Tiến hành tìm kiếm các thông tin về cấu trúc, cơ chế gây bệnh và tình trạng bệnh do miRNA-155 gây ra ung thư vòm họng được thu nhận trên các cơ sở dữ liệu, bao gồm: PUBMED, Google Scholar, NCBI, miRBase được cập nhật đến năm 2021 bằng một số từ khóa như: Nasopharyngeal carcinoma, microRNA, miRNA-155,…

Các công bố khoa học được chọn vào phân tích tổng hợp theo một số tiêu chuẩn như sau: (1) Nghiên cứu ca-chứng (case-control study)/ hoặc nghiên cứu đoàn hệ (cohort study) trong khảo sát sự biểu hiện của miRNA-155; (2) Mối quan hệ giữa tính chất biểu hiện của miRNA-155 khảo sát ở bệnh UTVH; (3) Các bài báo liên quan đến phương pháp phân tích, phát hiện sự biểu hiện của các miRNA khảo sát

Tiêu chí loại bỏ: các công bố khoa học không trình bày dưới ngôn ngữ Anh; các công bố chỉ có phần tóm tắt (abstract), các bài tổng quan (review), các bài thư gửi tạp chí (letter to editor), đều không được đưa vào dữ liệu thống kê

Hình 2 2 Sơ đồ mô tả quy trình chọn lọc công trình nghiên cứu

2.1.2 Trích xuất dữ liệu

Từ nguồn cơ sở dữ liệu đã khai thác, tiến hành trích xuất dữ liệu Dữ liệu trích xuất bao gồm: tác giả, năm xuất bản, chủng tộc, phương pháp phân tích sự biểu hiện, đặc điểm điều hoà Các dữ liệu được trích xuất được trình bày dưới dạng bảng 2.1

Bảng 2 1 Mẫu bảng ghi nhận trích xuất dữ liệu từ công bố trên thế giới

Công trình nghiên

cứu

Quốc gia

Chủng tộc

Phương pháp

Biểu hiện của miRNA

Gene đích

Đặc điểm

mẫu Tổng

mẫu

Mẫu biểu

hiện Tổng mẫu

Mẫu biểu hiện Biểu

hiện Số lượng

Biểu hiện

Số lượng

2.1.3 Khảo sát, đánh giá cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu

Các cặp mồi được sử dụng trong việc phát hiện sự biểu hiện của miRNA-155

và gene EBNA-1, chứng nội U6 và chứng nội beta-actin được nhóm nghiên cứu tiến

hành khảo sát đánh giá đặc tính, thông số vật lý, tính tương đồng, tính chuyên biệt,… bằng cách sử dụng các công cụ tin sinh học như: BLAST, IDT, Annhyb,… để kiểm tra kích thước sản phẩm dự đoán được khuếch đại

2.2 Quy trình thực nghiệm

Quy trình thực nghiệm tách chiết DNA virus bằng phương pháp Phenol/Chloroform được thực hiện theo các bước sau:

Bước 1: Ly giải tế bào

Trường hợp tách chiết DNA từ mẫu mô:

Dùng kéo (vô trùng) cắt một phần mô nhỏ (khối 1mm2), cho mẫu mô vào eppendorf sạch và cắt nhuyễn mẫu mô (càng nhỏ càng tốt) Thêm 100 μl dung dịch trữ mẫu vào eppendorf Vortex ống mẫu trong 10 phút Tiến hành ly tâm 13.000 vòng/phút trong 20 phút