nghiên cứu thử nghiệm dòng nấm kí sinh côn trùng beauveria sp và isaria fumosorosea bb v3 ứng dụng trong phòng trừ sinh học rệp sáp planococcus citri

Khảo sát hiệu lực gây chết của dịch chiết chủng nấm ký sinh côn trùng ở mậtđộ bào tử khác nhau đối với rệp sáp gây hại trong điều kiện phòng thí nghiệm.... Khảo sát hiệu lực gây chết của

- ∞0∞ -

NGUYỄN THIỆN MINH TÂM

NGHIÊN CỨU, THỬ NGHIỆM DÒNG NẤM KÍ SINH

CÔN TRÙNG Beauveria sp VÀ Isaria

fumosorosea Bb-V3 ỨNG DỤNG TRONG PHÒNG

TRỪ SINH HỌC RỆP SÁP Planococcus citri

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

TP HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - ∞0∞ -

NGUYỄN THIỆN MINH TÂM

NGHIÊN CỨU, THỬ NGHIỆM DÒNG NẤM KÍ SINH

CÔN TRÙNG Beauveria sp VÀ Isaria

fumosorosea Bb-V3 ỨNG DỤNG TRONG PHÒNG

TRỪ SINH HỌC RỆP SÁP Planococcus citri

Mã số sinh viên: 1853010154 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn: TS NGUYỄN NGỌC BẢO CHÂU

GIẤY XÁC NHẬN

Tôi tên là: Nguyễn Thiện Minh Tâm

Ngày sinh: 14/06/1997 Nơi sinh: Lâm ĐồngChuyên ngành: Nông nghiệp- Môi trường Mã sinh viên: 1853010154

Tôi đồng ý cung cấp toàn văn thông tin khóa luận tốt nghiệp hợp lệ về bảnquyền cho Thư viện Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh Thư viện TrườngĐại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh sẽ kết nối toàn văn thông tin khóa luận tốtnghiệp vào hệ thống thông tin khoa học của Sở Khoa học và Công nghệ Thành phố HồChí Minh.

Ký tên

Nguyễn Thiện Minh Tâm

CỦA GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN

Giảng viên hướng dẫn: TS Nguyễn Ngọc Bảo Châu

Học viên thực hiện: Nguyễn Thiện Minh tâm Lớp: DH18NN01

Tên đề tài: NGHIÊN CỨU, THỬ NGHIỆM DÒNG NẤM KÍ SINH CÔN TRÙNG

Beauveria sp VÀ Isaria fumosorosea Bb-V3 ỨNG DỤNG TRONG PHÒNG TRỪ

SINH HỌC RỆP SÁP Planococcus citri

Ý kiến của giáo viên hướng dẫn về việc cho phép sinh viên được bảo vệ khóa luận trước Hội đồng:

Sinh viên đã hoàn thành KLTN theo mục tiêu và chỉnh sửa KLTN theo góp ý của giảng viên và phản biện Giảng viên đồng ý cho sinh viên được bảo vệ khoá luận trước Hội đồng

Kết luận: Đạt Không đạt Xem xét lại

Thành phố Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2022

Người nhận xét

TS Nguyễn Ngọc Bảo Châu

LỜI CẢM ƠN

Trong thời gian thực hiện đề tài tại phòng thí nghiệm Động Vật Học- TrườngĐại học Mở Thành Phố Hồ Chí Minh đã để lại trong em nhiều kỉ niệm đẹp, kiếnthức và kinh nghiệm quý báu Để hoàn thành đề tài thực tập này, ngoài sự nỗ lựccủa bản thân em còn nhận được sự giúp đỡ, động viên, khích lệ của thầy cô, ngườithân, bạn bè trong suốt quá trình thực hiện đề tài.

Đầu tiên em xin chân thành cảm ơn các Thầy Cô giáo, cán bộ Khoa CôngNghệ Sinh Học- Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh đã giảng dạy vàhướng dẫn em hoàn thành chương trình học tập và nghiên cứu thực hiện đề tài.

Em xin chân thành tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cô Nguyễn Ngọc Bảo Châu làngười đã dẫn dắt, định hướng cho em những từ những bước đầu thực hiện đề tài, tậntâm và nhiệt tình hướng dẫn góp ý, động viên em trong suốt quá trình thực hiện đềtài.

Em cũng xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới cán bộ kĩ thuật viên phòng thínghiệm đã hướng dẫn, giúp đỡ về chuyên môn và tạo điều kiện về cơ sở vật chấtcho em trong quá trình thực hiện đề tài.

Và em xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành những người thân trong gia đình, bạnbè đã luôn động viên, khích lệ em trong suốt những năm tháng học tập rèn luyện tạiTrường cũng như thực hiện đề tài.

Em xin chân thành cảm ơn!

Tp Hồ Chí Minh, tháng 9 năm 2022Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thiện Minh Tâm

1.1.1 Phân bố và kí chủ của rệp sáp (P citri) 18

1.1.2 Tập tính sinh sống và gây hại của rệp sáp ( P citri) 18

1.1.3 Đặc điểm hình thái của rệp sáp ( P.citri) 19

1.1.4 Đặc điểm sinh sản của rệp sáp (P citri) 20

1.1.5 Vòng đời của rệp sáp (P.citri) 20

1.2 ĐẶC ĐIỂM CỦA NẤM KÍ SINH CÔN TRÙNG 22

1.2.1 Khái niệm nấm kí sinh côn trùng 22

1.2.2 Chu trình sống và lây nhiễm của nấm kí sinh côn trùng 23

1.3 TỔNG QUAN VỀ NẤM Beauveria sp 27

1.3.1 Phân bố và kí chủ của nấm Beauveria sp 27

1.3.2 Đặc điểm hình thái của nấm Beauveria sp 29

1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU NẤM KÍ SINH CÔN TRÙNG Beauveria sp 30

1.4.1 Ngoài nước: 30

1.4.2 Trong nước: 31

II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32

2.2.1 Nguồn rệp sáp: 33

2.2.2 Nấm kí sinh côn trùng sử dụng trong phòng thí nghiệm: 33

2.3 THIẾT BỊ, DỤNG CỤ, MÔI TRƯỜNG: 34

2.3.1 Thiết bị: 34

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu chính: 34

2.3.3 Môi trường, hóa chất và thuốc nhuộm: 34

2.4 PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN 35

2.4.1 Bố trí thí nghiệm 35

2.4.2 Nhân nuôi nguồn rệp sáp 35

2.4.3 Phương pháp định danh các dòng nấm kí sinh côn trùng vừa tìm được dựatrên hình thái và bằng kĩ thuật sinh học phân tử 36

2.4.4 Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng nấm Beauveria sp 39

2.4.4.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng đến sự phát triển của chủngnấm Beauveria sp 39

2.4.4.2 Khảo sát sự ảnh hưởng của pH lên sự phát triển của nấm kí sinh côn trùngBeauveria sp 40

2.4.4.3 Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên sự phát triển của nấm kísinh côn trùng Beauveria sp 41

2.4.5 Khảo sát hiệu lực gây chết của dịch chiết chủng nấm ký sinh côn trùng ở mậtđộ bào tử khác nhau đối với rệp sáp gây hại trong điều kiện phòng thí nghiệm 42

2.4.5.1 Khảo sát hiệu lực gây chết của dịch chiết chủng nấm Beauveria sp ở mậtđộ bào tử khác nhau đối với rệp sáp gây hại trong điều kiện phòng thí nghiệm 42

2.4.5.2 Khảo sát hiệu lực gây chết của dịch chiết chủng nấm Isaria fumosoroseaBb-V3 ở mật độ bào tử khác nhau đối với rệp sáp Planococcus ở quy mô phòng thínghiệm 44

III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 46

VÀ BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ 47

3.1.1 Mô tả đặc điểm hình thái chủng nấm ký sinh côn trùng Beauveria sp 47

3.1.2 Kết quả hỗ trợ đinh danh chủng nấm kí sinh côn trùng Beauveria sp bằngphương pháp sinh học phân tử: 49

3.2 TIẾN HÀNH GIỮ CHỦNG NẤM Beauveria sp TẠI PHÒNG THÍ NGHIỆM543.3 NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CHỦNG NẤM Beauveria sp 543.4 Khảo sát hiệu lực gây chết của dịch chiết chủng nấm ký sinh côn trùng ở mậtđộ bào tử khác nhau đối với rệp sáp gây hại trong điều kiện phòng thí nghiệm 60

NSKCNgày sau khi cấy

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.4.4.1.Bảng thành phần môi trường thạch 40

Bảng 3.3.3 đường kính khuẩn lạc của Beauveria sp trên 6 loại môi trường pH sau

6,8,10,12 ngày sau nuôi cấy 58

Biểu đồ 3.4.1 Khảo sát hiệu lực gây chết của dịch chiết chủng nấm Beauveria sp ởmật độ bào tử khác nhau đối với rệp sáp Planococcus citri gây hại trong điều kiện

phòng thí nghiệm 60

Biểu đồ 3.4.2 Khảo sát hiệu lực gây chết của dịch chiết chủng nấm Isaria

fumosorosea Bb-V3 ở mật độ bào tử khác nhau đối với rệp sáp Planococcus citri ở

quy mô phòng thí nghiệm 62

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1.2 Hình ảnh rệp sáp đang kí sinh gây hại trên cây trồng 19

Hình 1.1.3 Hình ảnh bên ngoài của rệp sáp (nguồn Internet) 19

Hình 1.1.5 Hình ảnh rệp sáp qua các giai đoạn tuổi từ mới nở cho đến trưởngthành 21

Hình 1.2.2 Chu trình xâm nhiễm của nấm kí sinh côn trùng 23

( Đinh Trang Thơ, 2015) 23

Hình 1.2.2.1 Cơ chế xâm nhiễm của nấm kí sinh côn trùng 25

(Thomas, Read, 2007) 25

Hình 1.3.1 Hình ảnh chụp thực tế nấm kí sinh tại Lâm Đồng 28

Hình 1.3.2 Bào tử trần và cuống nấm bạch cương 30

(chụp ở mức phóng đại 1000 lần) 30

Hình 2.2.2 Vị trí lấy mấu nấm kí sinh 33

Hình 2.4.2 Hình ảnh nhân nuôi lấy rệp sáp Planococcus citri từ chuối 36

Hình 2.4.3 Phản ứng PCR 37

Hình 2.4.5.1 Ảnh bố trí thí nghiệm hiệu lực gây chết của dịch chiết chủng nấmBeauveria sp tiêu diệt rệp sáp Planococcus citri trong điều kiện phòng thínghiệm 43

Hình 2.4.5.2 Ảnh bố trí thí nghiệm hiệu lực gây chết của dịch chiết chủng nấmIsaria fumosorosea Bb-V3 tiêu diệt rệp sáp Planococcus citri trong điều kiệnphòng thí nghiệm 45

Hình 3.1.1.2 Kích thước vi thể bề ngang (A) và bề dọc (B) của chủng nấm trênmôi trường PDA sau 12 ngày nuôi cấy 48

Hình 3.1.1.3 Hình ảnh đại thể mặt trước (A) và mặt ngang (B) của chủng nấmtrên môi trường PDA sau 12 ngày nuôi cấy 49

Hình 3.1.2.1 Phổ điện di DNA của chủng nấm ký sinh côn trùng Beauveria sp 49

Hình 3.3.1 Đặc điểm khuẩn lạc của Beauveria sp trên môi trường thạch PDAsau 12 ngày nuôi cấy 56

Hình 3.3.3 Đường kính khuẩn lạc của Beauveria sp trên môi trường pH 6.0 sau

10 ngày nuôi cấy ở mặt trên (A) và mặt dưới (B) đĩa petri 59

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cây trồng nói chung và cây ăn trái nói riêng ở Việt Nam bị rất nhiều loàisâu hại tấn công Chẳng hạn, đến năm 2013, trên các loại cây ăn quả có múi ởnước ta đã ghi nhận được 265 loài chân đốt là sâu hại; trên cây nhãn, cây xoàitương ứng có 129 và 123 loài sâu hại,…(Phạm Văn Lầm, 2013) Trong đó, một

trong những loại gây hại cây ăn quả khá nghiêm trọng đó là rệp sáp (Planococcus

Sự gây hại do rệp sáp gây ra trên nhóm cây có múi (Citrus) đã được ghi

nhận tại nhiều nơi trên thế giới (Smith et al., 1970) và tại Việt Nam (Nguyễn ThịChắc và ctv., 2005) Trong những năm gần đây, rệp sáp phát triển mạnh, gây hạinghiêm trọng nhiều vùng sản xuất cà phê ở Tây Nguyên trong đó có tỉnh LâmĐồng, làm giảng đáng kể năng suất, chất lượng cà phê ( Phạm Thị vượng, 2008).

Để phòng trừ rệp sáp và các loại sâu hại khác trên rau và cây ăn quả, ngườinông dân chủ yếu dựa vào biện pháp sử dụng thuốc hóa học Thực tế cho thấy cácbiện pháp phun thuốc bảo vệ thực vật đem lại hiệu quả phòng trừ cao, giải quyếtnhanh những trận dịch lớn, sử dụng đơn giản, thuận tiện.Tuy nhiên việc lạm dụngthuốc hóa học vừa gây lãng phí trong sản xuất, làm tăng khả năng kháng thuốc vàhơn cả là việc quá lạm dụng sẽ tác động rất xấu đến môi trường xung quanh, gây ônhiễm môi trường đất, nước, không khí cũng như ảnh hưởng đến các sinh vậtxung quanh, kẻ thù tự nhiên của sâu hại bị thuốc hóa học tiêu diệt, phá vỡ cânbằng sinh học trong tự nhiên.

Trong những năm gần đây, nấm kí sinh côn trùng đã được phát triển ở nhiềuquốc gia xem như tác nhân phòng trừ sinh học côn trùng với hơn 100 sản phẩmthuốc trừ sâu vi sinh đã được thương mại hóa vào năm 2006 (Jaronski, 2010) Đitiên phong trong phòng trừ sinh học của nấm kí sinh côn trùng chủ yếu có 2 loài

B bassiana và M anisoplie Tuy nhiên, các nghiên cứu gần đây cho thấy các loài

nấm chi Isaria cũng có nhiều triển vọng để phòng trừ sâu hại nông nghiệp Hiệnnay, một số loài nấm chi Isaria được sử dụng trong phòng trừ sinh học cây trồngnhư I javanica, I fariosa, I fumosorosea Các loài nấm này được nghiên cứu vàứng dụng vào phòng trừ một số đối tượng sâu hại thuộc bộ Lepidoptera,

Hemiptera, Diptera, Cleoptera, Hymenoptera,…ở một số nước trên thế giới như

Trung Quốc, Hoa Kỳ, Brazil, Thái Lan và cho kết quả tốt.

Nấm kí sinh côn trùng chưa tạo ra tính kháng thuốc và có khả năng lâynhiễm trên nhiều loại sâu khác nhau, ngoài ra nấm kí sinh côn trùng không chỉtiêu diệt trực tiếp sâu hại vào thời kì phá hoại mà còn tích lũy trên đồng ruộngtruyền cho thế hệ tiếp theo (Lê Anh Tuấn, 2013) Từ đó cho thấy triển vọng sửdụng nấm kí sinh côn trùng có hoạt lực mạnh như là một chiến lược kiểm soátsâu bệnh hại thay thế Xuất phát từ lý do trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đềtài: “NGHIÊN CỨU, THỬ NGHIỆM DÒNG NẤM KÍ SINH CÔN TRÙNG

Beauveria sp VÀ Isaria fumosorosea Bb-V3 ỨNG DỤNG TRONG PHÒNG

TRỪ SINH HỌC RỆP SÁP Planococcus citri”.

❖ Mục tiêu:

− Định danh các dòng nấm kí sinh côn trùng vừa tìm được dựa trên hình thái vàbằng kĩ thuật sinh học phân tử.

− Nghiên cứu sự ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy lên sự phát triển của

chủng nấm kí sinh côn trùng Beauveria sp tốt nhất.

− Nghiên cứu khả năng kiểm soát côn trùng gây hại của dịch chiết từ chủng

nấm kí sinh côn trùng Beauveria sp và isaria fumosorosea Bb-V3

❖ Nội dung nghiên cứu:

− Phương pháp hỗ trợ định danh các dòng nấm kí sinh côn trùng vừa tìm đượcdựa trên hình thái và bằng kĩ thuật sinh học phân tử.

− Khảo sát sự ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng đến sự phát triển của chủng

nấm Beauveria sp.

− Khảo sát sự ảnh hưởng của pH lên sự phát triển của nấm kí sinh côn trùng

Beauveria sp.

− Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên sự phát triển của nấm kí

sinh côn trùng Beauveria sp.

− Khảo sát hiệu lực gây chết của dịch chiết chủng nấm Beauveria sp ở mật độbào tử khác nhau đối với rệp sáp Planococcus citri trong điều kiện phòng thí

nghiệm.

V3 ở mật độ bào tử khác nhau đối với rệp sáp Planococcus citri trong điều

I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1.TỔNG QUAN VỀ RỆP SÁP

Rệp sáp có tên khoa học làPlanococcus citri (rệp sáp trắng)

Bộ: HemipteraHọ: Pseudococcidae

Chi: PlannococcusLoài: P.citri

1.1.1 Phân bố và kí chủ của rệp sáp (P citri)

Cây ký chủ của nó không chỉ có các cây thuộc họ cam quýt mà còn gây hạichủ yếu trên các cây công nghiệp như cà phê (cà phê chè và cà phê vối, có thể lànchết cây non), ca cao, hồ tiêu, dừa, khóm và các cây khác như nho, chuối, xoài,gừng, tất cả loài hoa, rau… Nó được phát hiện trên 70 họ cây trồng khác nhau.

Rệp sáp Planococcus citri là một trong những loài rệp phổ biến nhất Phân bố

rộng khắp nơi trên thế giới, các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Chúng hiện diệnkhắp các nước trồng cà phê.

1.1.2 Tập tính sinh sống và gây hại của rệp sáp ( P citri)

Chúng sinh sống gây hại ở chùm quả, mặt dưới lá, nách lá, cành tiêu và ngaycả ở dưới rễ Chích hút nhựa làm chùm quả héo rụng non và tạo điều kiện, môitrường cho nấm muội phát triển làm đen vỏ quả, mặt lá, ảnh hưởng đến quang hợp.Rệp sáp có loài kiến cộng sinh bằng cách kiến đen tha rệp từ nơi này sang nơikhác, từ cây này sang cây khác mỗi khi chỗ rệp đang chích hút đã cạn kiệt nhựa.Ngược lại, trong chất bài tiết của rệp có chứa nhiều chất đường mật làm thức ăncho kiến Rệp sáp gây hại vùng rễ và tất cả các bộ phận của cây chủ yếu là tán lávà trái Khi rệp sáp tấn công vùng rễ, làm cho lá cây bị hại héo và vàng úa có thểnhầm với triệu chứng bị khô hạn Rễ đôi khi bị khảm một lớp mô nấm màu trắng

xanh và bị còi cọc Rệp sáp Planococcus citri có khả năng di chuyển hoạt động

tích cự trong suốt đời sống của chúng Con đực sống khoảng 27 ngày (từ khi nở

cho đến khi trưởng thành và chết), còn đối với con cái sống khoảng 115 ngày.Vòng đời (từ trứng cho đến khi đẻtrứng) biến thiên từ 20 đến 44 ngày.

1.1.3 Đặc điểm hình thái của rệp sáp ( P.citri)

Hình 1.1.3 Hình ảnh bên ngoài của rệp sáp (nguồn Internet)

Hình 1.1.2 Hình ảnh rệp sáp đang kí sinh gây hại trên cây trồng

Rệp sáp có hình oval (hình bầu dục), thuôn dài Con cái trưởng thành dàikhoảng 2,5 - 4mm, chiều ngang khoảng 0,7-3 mm Mình có nhiều sợi sáp màutrắng Nếu gạt lớp bột sáp ra cơ thể có màu vàng nhạt Rệp cái không có cánh, rệpđực nhỏ hơn có cánh, không có sáp, mắt đen to, râu và chân có nhiều lông ngắn,miệng thoái hóa, không ăn chỉ giữ nhiệm vụ giao phối.

Trứng hình bầu dục nhỏ màu trắng trong, trứng được đẻ thành bọc, trong bọccác trứng xếp chồng lên nhau, phía ngoài bọc có lớp sáp bông trắng bao phủ Rệpsáp hại dứa thường đẻ trứng ở phía chân các lá già, cổ rễ sát thân cây.

Rệp non lúc mới nở có màu xám, nhỏ bằng con mạt, sau lần lột xác thứ nhấtchuyển sang màu hồng nhạt, chưa có sáp trắng bao phủ, hoạt động nhanh nhẹn.Sau nở khoảng 7 - 1 ngày gần đuôi hình thành hai tua áp dài, sau đó các tua khácdần dần hình thành, trên cơ thể bắt đầu có áp trắng bao phủ và từ đó chúng dichuyển chậm chạp và thường tìm các nơi kín đáo để sinh sống.

Rệp sáp ít di chuyển phần lớn nhờ các loài kiến tha đi.

1.1.4 Đặc điểm sinh sản của rệp sáp (P citri)

Rệp sáp sinh sản rất nhanh, có thể sinh sản theo kiểu đơn tính và lưỡng tính.Con đực có thêm giai đoạn tiền nhộng và nhộng Rệp cái đẻ trứng thành từng ổ,một con cái đẻ khoảng 300 - 400 trứng, tỷ lệ nở của trứng khá cao khoảng 80%trở lên Rệp sáp đẻ trứng sớm, sau khi nở khoảng 20 - 25 ngày (tuổi 3) là rệp sápbắt đầu đẻ trứng, từ khi bắt đầu đẻ đến lúc ngưng đẻ và chết là khoảng 20 - 30ngày.

1.1.5 Vòng đời của rệp sáp (P.citri)

Con đực sống khoảng 27 ngày (từ khi nở cho đến khi trưởng thành và chết),còn đối với con cái sống khoảng 115 ngày Vòng đời (từ trứng cho đến khi đẻtrứng) biến thiên từ 20 đến 44 ngày.

Hình 1.1.5 Hình ảnh rệp sáp qua các giai đoạn tuổi từ mới nở cho đến trưởng thành( ảnh chụp bằng kính hiển vi có gắn trắc vi thị kính được phóng x 2.5 lần)❖ Trứng: Trứng được đẻ thành lớp bao phủ bởi túi trứng bằng sợi sáp Trứngnở trong 2-10 ngày.

❖ Ấu trùng: Con rệp sáp đực có 4 giai đoạn ấu trùng gọi là sâu non (instar).Mỗi giai đoạn sâu non được phân biệt bởi sự thay lông Những báo cáo nghiêncứu rệp sáp trên lá cà phê nhận thấy giai đoạn sâu non tuổi 1 trải qua 7-14 ngày;trung bình 9,9 ngày; tuổi 2, 6-16 ngày, trung bình 8,7 ngày; tuổi 3, 2-3 ngày,trung bình 2,5 ngày; và tuổi 4, 1-6 ngày, trung bình 3 ngày Khoảng 4 ngày vàosâu non (instar) tuổi hai, một vết đen phát triển trên cơ thể côn trùng Hai ngàysau, sâu non bắt đầu xe sợi thành một kén quanh cơ thể nó Kén này được tiếptục xe làm tăng mật độ sợi cho đến khi rệp sáp trưởng thành có cánh mọc lênsau hai lần thay lông.

Con rệp sáp cái chỉ có 3 giai đoạn ấu trùng, ấu trùng tuổi 1 trải qua từ 7-17ngày, trung bình 11,5 ngày; tuổi 2, 5-13 ngày, trung bình 8,2 ngày; và tuổi 3, 5-14 ngày, trung bình 8,4 ngày (www.extento.hawaii.edu).

❖ Thành trùng: Rệp sáp đực sống trong 2-4 ngày sau khi thay lông giai đoạnấu trùng sau cùng Con cái sống trung bình 87,6 ngày khi trưởng thành và cóthể bắt đầu đẻ trứng 15-26 ngày trong thời gian trưởng thành của nó Con cáiđẻ từ 200-400 trứng, trung bình 300 trứng trong một vòng đời.

1.2 ĐẶC ĐIỂM CỦA NẤM KÍ SINH CÔN TRÙNG

1.2.1 Khái niệm nấm kí sinh côn trùng

Khái niêm “Nấm kí sinh côn trùng- Entomopathogenic fungi (EPF)” hay“nấm côn trùng- Insect fungi” được các nhà khoa học sử dụng như là thuật ngữđồng nghĩa, đề cập về nhóm nấm kí sinh gây bệnh cho côn trùng Nấm kí sinh côntrùng dùng để mô tả hiện tượng nhiễm vào kí chủ côn trùng khỏe mạnh gây bệnhvà sau đó giết chết côn trùng Trong khi đó, nấm kí sinh thứ phát chỉ có thể kí sinhtrên côn trùng đã bị suy yếu bởi một loại bệnh nào đó hoặc côn trùng bị thương

(Samson el al., 1988; Tzean el al., 1997).

Nấm kí sinh côn trùng được phân chia thành 4 nhóm chính:

1) Kí sinh trong tức là nấm kí sinh trong các nội quan, xoang cơ thể của côntrùng.

2) Kí sinh ngoài tức là nấm phát triển trên lớp cuticun vỏ cơ thể côn trùng vàgây nên bệnh hại cho côn trùng vật chủ.

3) Nấm mọc trên cơ thể côn trùng tức à những nấm đã được trưc tiếp hoặc giántiếp chứng minh chúng kí sinh trên côn trùng.

4) Cộng sinh có nghĩa là cả nấm và côn trùng cùng mang lại lợi ích cho nhautrong mối quan hệ cùng chung sống (Samson et al., 1988).

Nấm còn được chia ra thành nhóm ký sinh sơ cấp (Primery pathogen) vànhóm ký sinh thứ cấp (Secondery pathogen) (Pu và Li, 1996) Nấm ký sinh sơcấp thường nhiễm vào ký chủ côn trùng khoẻ mạnh, gây bệnh và sau đó giết chếtcôn trùng Trong khi đó, nấm ký sinh thứ cấp chỉ có thể ký sinh trên những côntrùng yếu hoặc bị thương Các mầm bệnh ký sinh trên côn trùng trưởng thànhhoặc côn trùng bị bệnh được gọi là ký sinh cơ hội hoặc ký sinh không chuyêntính, loại ký sinh này có thể nhiễm vào ký chủ thông qua sự xâm nhập qua lớpcuticun vỏ cơ thể côn trùng (Trần Ngọc Lân và cộng sự, 2008).

Như vậy, nấm ký sinh côn trùng (EPF) được dùng để mô tả hiện tượngnấm ký sinh trên hoặc trong ký chủ côn trùng Khái niệm này cũng được dùngcho nấm ký sinh trên nhện bởi vì nhện và côn trùng là 2 nhóm (lớp) trong mộtngành động vật chân khớp, chúng có cùng kiểu sinh thái ăn thực vật hoặc ăn thịtvà sinh sống chủ yếu trên cây (Trần Ngọc Lân và cộng sự, 2008).

1.2.2 Chu trình sống và lây nhiễm của nấm kí sinh côn trùng

Nấm ký sinh côn trùng có thể xâm nhiễm vào cơ thể côn trùng qua conđường hô hấp, tiêu hóa hoặc qua cơ quan sinh dục, nhưng phần lớn là qua lớp vỏcuticun của chúng- Tức là phải có sự tiếp xúc của bào tử nấm và bề mặt cơ thểvật chủ Bào tử nấm bám vào bề mặt cơ thể vật chủ, khi đủ điều kiện ẩm độ bàotử mọc mầm và xâm nhiễm vào bên trong cơ thể côn trùng qua lớp vỏ cuticun.Khi nấm xâm nhiễm vào bên trong, nấm mọc khắp cơ thể của côn trùng và sảnxuất các độc tố để tăng tốc độ giết côn trùng hoặc ngăn chặn sự cạnh tranh củacác loài vi sinh vật khác.

Cơ chế xâm nhiễm của nấm kí sinh côn trùng trải qua ba giai đoạn chính:⮚ Giai đoạn xâm nhập:

Giai đoạn xâm nhập được tính từ khi bào tử nấm mọc mầm đến lúc hoànthành việc xâm nhập vào trong xoang cơ thể côn trùng Bào tử nấm sau khi mọcmầm phát sinh mầm bệnh, nó giải phóng các enzyme ngoại bào tương ứng với cácthành phần chính của lớp vỏ cuticun của côn trùng để phân hủy lớp vỏ này nhưProtease, chitinase, aminopept, carboxypeptidase A, esterase, N -axetylglucosaminidase, cenlulase Các enzyme này được tạo ra một cách nhanhchóng, liên tục và với mức độ khác nhau giữa các loài và thậm chí ngay cả trongmột loài.

Hình 1.2.2 Chu trình xâm nhiễm của nấm kí sinh côn trùng( Đinh Trang Thơ, 2015)

Enzyme protease và chitinase hình thành trên cơ thể côn trùng, tham giaphân hủy lớp da côn trùng (cuticula) và lớp biểu bì (thành phần chính là protein).Lipase, cenlulase và các enzyme khác cũng là những enzyme có vai trò khôngkém phần quan trọng Nhưng quan trọng nhất là enzyme phân hủy protein(protease) và enzyme phân huỷ kitin (chitinase) của côn trùng Hai enzymenày có liên quan trực tiếp đến hiệu lực diệt côn trùng của nấm ký sinh côntrùng (Tạ Kim Chỉnh, 1994).

⮚ Giai đoạn phát triển của nấm trong cơ thể côn trùng:

Giai đoạn này được tính từ khi nấm hoàn thành quá trình xâm nhiễm vàocơ thể côn trùng cho đến khi côn trùng chết Đây là giai đoạn sống ký sinh củanấm Trong xoang cơ thể côn trùng nấm tiếp tục phát triển, hình thành rấtnhiều sợi nấm ngắn Khi hệ sợi nấm được hình thành trong cơ thể, nó phân tánkhắp cơ thể theo dịch máu, phá hủy các tế bào máu và làm giảm tốc độ lưuthông máu Toàn bộ các bộ phận nội quan bị xâm nhập Nấm thường xâm nhậpvào khí quản làm suy yếu hô hấp Hoạt động của côn trùng trở nên chậm chạpvà phản ứng kém với các tác nhân kích thích bên ngoài Kết quả là vật chủ mấtkhả năng kiểm soát hoạt động sống và dẫn đến chết (Phạm Văn Lầm, 2000).⮚ Giai đoạn sinh trưởng của nấm sau khi vật chủ chết

Đây là giai đoạn sống hoại sinh của nấm ký sinh Xác côn trùng chết lànguồn dinh dưỡng có giá trị cho các vi sinh vật Thông thường, các bộ phận bêntrong cơ thể côn trùng sẽ bị phân hủy bởi vi khuẩn hoại sinh Trên bề mặt ngoài

của cơ thể côn trùng, các nấm hoại sinh như Aspergillus spp., Penicillium spp và

Fusarium spp định cư ở lớp biểu bì và cạnh tranh với vi khuẩn ở bên trong cơ

thể côn trùng Do nấm côn trùng có khả năng sản xuất ra các chất có hoạt tínhnhư thuốc kháng sinh ức chế hoạt động của vi khuẩn và nấm hoại sinh khác nênchúng có thể cạnh tranh với các sinh vật này để tồn tại và phát triển, làm cho xácvật chủ không bị phân hủy.

Sau khi nấm côn trùng đã sử dụng cạn kiệt nguồn dinh dưỡng bên trong cơthể côn trùng, nó chuyển sang giai đoạn hình thành bào tử.

Ở giai đoạn xâm nhiễm vào bên trong cơ thể côn trùng, nấm sử dụng cácenzyme ngoại bào để phân hủy lớp vỏ cuticun Khác với giai đoạn này, ở giai

đoạn nấm đâm xuyên, mọc thành sợi ra bên ngoài nó sử dụng toàn bộ tác động cơhọc Sau đó các bào tử được hình thành trên lớp sợi nấm ở bề mặt cơ thể vật chủ.Nhiều côn trùng bị bao bọc toàn bộ bên ngoài bởi hệ sợi nấm và các bào tử, vìvậy mà rất khó hoặc không thể xác định các vật chủ.

Đặc điểm cơ thể côn trùng bị chết do nấm côn trùng không bao giờ bị thối,nhũn mà thường vẫn giữ nguyên hình dạng như khi còn sống Toàn bộ bên trongcơ thể sâu chết chứa đầy sợi nấm Sau đó, các sợi nấm này mọc ra ngoài qua vỏcơ thể và bao phủ toàn bộ bề mặt ngoài của cơ thể sâu Đây là đặc điểm rất đặctrưng để phân biệt sâu chết do nấm côn trùng với sâu chết do virus, vi khuẩn gâybệnh (Trần Ngọc Lân và cộng sự, 2008).

Thomas M B., Read A F., (2007) đã đưa ra sơ đồ xâm nhiễm của nấm kýsinh côn trùng vào cơ thể vật chủ.

Theo Thomas M B., Read A F., (2007) chu kỳ phát triển của nấm ký sinh

côn trùng, như nấm Beaueria bassiana và Metarhizium anisopliae gồm các giai

đoạn: Bào tử đính tiếp xúc với tầng cuticun của lớp vỏ vật chủ Bào tử nảy mầmvà sinh sản hình thành vòi và giác bám (cấu trúc cơ quan xâm nhập).

Hình 1.2.2.1 Cơ chế xâm nhiễm của nấm kí sinh côn trùng(Thomas, Read, 2007)

Sự xâm nhập của bào tử đính là sự tổ hợp của sức ép cơ học và sự tác độngcủa enzyme phân giải tầng cuticun Quá trình sinh trưởng bên trong xoang máucơ thể vật chủ và sự sinh sản của bào tử đính làm vật chủ chết Tầng cuticun củavỏ cơ thể vật chủ là tầng chống chịu đầu tiên trong việc bảo vệ chống lại sự xâmnhiễm của nấm và nó có vai trò quyết định tính chuyên hóa đặc hiệu của nấm.Nếu nấm phá vỡ được tầng cuticun thì sự xâm nhiễm thành công, sau đó phụthuộc vào khả năng chiến thắng được phản ứng miễn dịch bẩm sinh ở côn trùngcủa nấm.

Các loài côn trùng có thể phản ứng lại sự xâm nhiễm này của nấm bằng cảhai phương thức là tế bào và thể dịch Sự hình thành hoạt động miễn dịch càngsớm ở điểm phân giải bào tử đính trong suốt quá trình xâm nhập Các loài nấmnói chung đều có hai phương thức để chiến thắng các phản ứng tự vệ của vật chủ:Sự phát triển của các dạng sinh trưởng giai đoạn tiềm ẩn là sự ngụy trang hữuhiệu từ các phản ứng tự vệ của côn trùng và sự sản xuất ra các chất miễn dịchphân hóa thuận nghịch của bộ phận ức chế hệ thống bảo vệ.

Nấm ký sinh thường để lại những dấu hiệu trên cơ thể vật chủ hay làm chotập tính sống của chúng bị thay đổi Những cá thể sâu hại bị nhiễm nấm thường cócác vệt chấm đen xuất hiện trên bề mặt, có thể tại nơi bào tử nấm bám vào và mọc

mầm xâm nhiễm vào bên trong cơ thể vật chủ Nơi xâm nhập của nấm Beauveria

bassiana thường có vệt chấm đen hình dạng bất định Khi bị bệnh do nấm, sâu hại

ngừng hoạt động khoảng 2 đến 3 ngày trước thời điểm phát triển hoàn toàn của

nấm ở trong cơ thể vật chủ Nếu bị bệnh do nấm Beauveria bassiana thì sâu hại

sẽ ngừng hoạt động khoảng 7 ngày trước khi chết Những cá thể sâu hại bị nhiễmbệnh nấm côn trùng thường có màu hồng nhạt Một số loài nấm có thể làm chosâu bệnh trở nên có màu vàng nhạt, xanh lá cây hoặc nâu Cơ thể sâu bị bệnh trở

nên hóa cứng Một số loài Cordyceps ký sinh có thể ảnh hưởng đến hành vi củavật chủ sâu bọ Cordyceps unilateralis gây bệnh trên kiến và khiến chúng leo lên

cây rồi bám ở đó trước khi chết, đảm bảo phân phối tối đa bào tử từ quả thể mọcra ngoài cơ thể côn trùng đã chết (Phạm Văn Lầm, 2000).

1.3 TỔNG QUAN VỀ NẤM Beauveria sp.

Lớp: Deuteromycetes.Bộ: Moniliales.

Họ: Moniliaceae.

Chi: Beauveria.

Chi Beauveria thường được chia thành 3 loài: Beauveria bassiana,

Beauveria brongniarti, Beauveria alba, trong đó 2 loài đầu là tác nhân gây bệnh

côn trùng (Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hương Giang, 1997).

Ở Việt nam người ta gọi chi này là nấm Bạch Cương vì nấm có màu trắng,trên thế giới rất nhiều nước như Liên Xô cũ, Mỹ, Anh đã sản xuất với tên thươngmại là Beauverin, Việt Nam: Beauverit Trong chi này có 3 loài chính có khả

năng diệt sâu Beauveria bassiana, B tenella, B brongniartii Trong 3 loài nấm đóthì nấm B bassiana chiếm 80-90 % tỉ lệ kí sinh trên côn trùng hại cây trồng nông

và lâm nghiệp.

1.3.1 Phân bố và kí chủ của nấm Beauveria sp.

Nấm Bạch cương ( Beauveria bassiana) là một loài nấm ký sinh phổ biếnđối với nhiều loài côn trùng Các chế phẩm từ nấm B bassiana đã được biết đến

và sử dụng rộng rãi để phòng trừ sinh học trong nông, lâm nghiệp Nhiều chủngnấm được nhân sinh khối và sản xuất thuốc trừ sâu sinh học ở nhiều quốc gia.Loài nấm này đã được phát hiện sống nội sinh tự nhiên với rất nhiều loài thực vật.

Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng nấm Bạch cương (B bassiana) có thể sống nội

sinh nhân tạo với một số loài thực vật Khi gây nhiễm, sợi nấm xâm nhiễm, lantruyền và sống trong mô của thực vật Cho đến ngày nay, nấm Bạch cương đãđược ghi nhận sống nội sinh nhân tạo trên các loài cây như: Ngô, Khoai tây, Càchua, Ca cao, Bông, Lúa mỳ và Chuối.

Nấm Beauveria Bassiana phân bố rộng khắp Giống như hầu hết các loại

nấm diệt sâu khác, khi rơi vào một nơi nào đó chúng đều đó khả năng trở thànhthành viên trong sinh quần nơi đó và tự sinh sôi nảy nở tăng lên Vì là vật ký sinhchuyên hóa rộng nên nấm này có khả năng tồn tại khi thiếu vật chủ chính Khảnăng nhiềm thành công của nấm đối với côn trùng là khá lớn vì chúng có nhiềucách xâm nhập khác nhau: qua lớp cutin, qua đường tiêu hóa, qua đường hô hấp

và qua lõ của thân Ngoài ra nấm Beauveria Bassiana còn có khả năng tồn tại

trong điều kiện môi trường không tồn tại dưới dạng giả hạch nấm Có thể sử dụng

Beauveria Bassiana trong thực tiễn nông nghiệp vì: Chúng có thể phát triển trên

môi trường dinh dưỡng, có thể được chế tạo ở dạng chế phẩm sinh học, và tiêudiệt một lượng không nhiều các sinh vật có ích.

Nấm Beauveria Bassiana có khả năng phát tán rộng trong thiên nhiên thông

qua hoạt động phóng bào từ bằng cơ học (Chúng có khả năng bắn bào tử gấphàng nghìn lần kích thước của chúng), lan truyền nhờ dòng nước, không khí vàcôn trùng.

Ở nước ta nấm Bạch cương đã và đang được sử dụng trong phòng trừ Sâuróm thông và một số loài sâu tơ trong nông nghiệp, các sản phẩm từ chúng ngàycàng được phát triển thương mại hóa và có tên trong danh sách các chế phẩm sinhhọc phòng trừ sâu trong nông lâm nghiệp Nhưng phần lớn được sử dụng dướidạng bột hoặc dạng dung dịch để phun trực tiếp lên côn trùng và những vị trí màsâu di chuyển qua Phương pháp này không mang lại hiệu quả cao đối với những

Hình 1.3.1 Hình ảnh chụp thực tế nấm kí sinh tại Lâm Đồng

loài côn trùng gây hại sống trong thân cây, vì khả năng tiếp xúc của nấm với cácloài này rất thấp Với loài Ong đen (L invasa) vị trí gây hại là ngọn, cuống vàgân lá bạch đàn, pha trứng, sâu non và nhộng sống trong mô của cây chủ nên việcsử dụng thuốc hóa học và sinh học trong phòng trừ sẽ gặp nhiều khó khăn Khicác loài nấm ký sinh côn trùng sống nội sinh, tạo ra các hợp chất hóa học, tăngcường khả năng kháng sâu hại của cây chủ.

1.3.2 Đặc điểm hình thái của nấm Beauveria sp.

Nấm bạch cương Beauveria Bassiana có màu trắng nên người ta thường gọi

là nấm trắng hay nấm bạch cương Trên môi trường thạch đĩa hoặc thạch nghiêng,nấm bạch cương có sợi màu trắng đế màu crem có pha một chút màu đỏ, da cam,đôi khi pha một ít màu lục, có thể tiết vào môi trường sắc tố màu vang, màu đỏ

nhạt hoặc màu xanh da trời Nấm Beauveria bassiana sinh ra những bào tử đơn

bào, không màu, hình cầu hoặc hình trứng, đường kính từ 1-4 µm, các giá bào tửtrần thường tạo thành các nhánh ở phần ngọn hoặc trực tiếp tạo thành nhánh củagiá, phần ngọn của bào tử có dạng cuống hình ziczac không đều, nhưng là mấudạng răng nhỏ phát sinh bởi sự kéo dài của gốc ghép Phần gốc của tế bào sinhbào tử trần hình chai (kích thước 2,5- 3,5 x 3 – 6 µm), khi thời gian nuôi cấy kéodài, trong môi trường những bào tử trần sinh ra sẽ mảnh và kết chặt hơn mấynhau (Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hương Giang, 1997).

1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU NẤM KÍ SINH CÔN TRÙNG

1.4.1 Ngoài nước:

Hiện nay, đã có trên 700 loài nấm được phát hiện có liên quan đến các bệnhtrên côn trùng (Pu and Li, 1996), chúng chủ yếu nằm trong 2 lớp làHyphomycetes (Deuteromycotina) và Entomophthorales (Zygomycotina) (Feng,1988a).

Với những tiềm năng cho việc ứng dụng phòng trừ sâu hại rất lớn, tuy nhiênvới chỉ một số rất ít loài được nghiên cứu và phát triển cho việc phòng trừ sâu hại.Trong vài thập kỷ qua, với sự gia tăng số lượng đăng ký thương mại hóa trên toànthế giới về các loài nấm côn trùng thuộc lớp Hyphomycetes với nhiều dạng khác

nhau, các loài nấm chủ yếu là: Beauveria bassiana, B Brongniartii, Metarhizium

anisopliae, Nomuraea rileyi, Paecilomyces fumosoroseus và Verticillium lecanii.

Các chế phẩm này được sử dụng để phòng trừ phổ rộng trên các loài sâu hại nhưbộ cánh màng, cánh cứng, cánh vảy, cánh thẳng và hai cánh (shah and Goettel,1999).

Các công nghệ được nghiên cứu như lên men, tạo dạng và sử dụng các tácnhân nấm rất hoàn hảo trên khắp thế giới và được xuất bản bởi rất nhiều các tácgiả như Burges, 1998; Caudwell and Gatehouse, 1996; Cliquet and Jackson, 1997;

Hình 1.3.2 Bào tử trần và cuống nấm bạch cương(chụp ở mức phóng đại 1000 lần)

Ibrahim et al., 1999; Jackson et al., 1997; Kleespies and Zimmermann, 1998;Lacey and Kaya, 2000; Wraight and Carruthers, 1999.

1.4.2 Trong nước:

Vấn đề nghiên cứu các chủng nấm gây bệnh cho côn trùng đã được các nhàkhoa học ở một số trường Đại học và Viện nghiên cứu bắt đầu thực hiện từ nhữngnăm 70 của thế kỷ 20 Năm 1975, Tạ Kim Chỉnh và cs đã thu thập mẫu bệnh sâu

róm thông Dendrolimus ponctatus và xác định là do loài nấm trắng Beauveria gâyra Nguyễn Thị Lộc và cs ở Viện Lúa Đồng bằng sông Cửu Long, 2004 đã sửdụng chế phẩm nấm xanh M anisopliae để phòng trừ bọ cánh cứng Brontispa

longissima hại dừa và rầy nâu hại lúa.

Trịnh Văn Hạnh và cs viện Khoa học Thủy lợi đã hoàn thành một dự án sảnxuất thử nghiệm nấm Metarhizium để phòng trừ mối hại đê đập (2003- 2005),Phạm Văn Nhạ (2013) đã nghiên cứu ứng dụng chế phẩm nấm Metarhizium

anisopliae và nấm Beauveria basiana phòng chống rệp sáp hại ca phê tại Tây

Nguyên Từ năm 1992, Phạm Thị Thùy và cs (1995, 1997, 2000) đã phân lập,nuôi cấy và thử nghiệm các chủng nấm bệnh thuộc 3 loài B bassiana, M.

anisopliae và M flavoride để phòng trừ cho một số loài sâu hại cây nông, lâm

nghiệp.

II.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU:

Đề tài được thực hiện từ tháng 6/2022- 8/2022 tại phòng thí nghiệm Độngvật học và phòng thí nghiệm Công nghệ Vi sinh Trường Đại học Mở Tp HCM,cơ sở 3 Bình Dương số 68 Lê Thị Trung, phường Phú Lợi, thành phố Thủ Dầu Một,tỉnh Bình Dương.

2.2 VẬT LIỆU

2.2.1 Nguồn rệp sáp:

Thu thập nguồn rệp sáp từ các vườn chuối tại Dầu Tiếng và vườn nathuộc thành phố Thủ Dầu Một, Bình Dương đem về phòng thí nghiệm Độngvật học, khoa công nghệ sinh học, trường Đại học Mở Thành Phố Hồ Chí Minh,cơ sở 3 Bình Dương Việc xác định loài rệp sáp hại cây ăn quả được dựa vàotài liệu của tác giả Nguyễn Viết Tùng "Giáo trình Côn trùng đại cương."Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội (2006).

2.2.2 Nấm kí sinh côn trùng sử dụng trong phòng thí nghiệm:

Nguồn nấm kí sinh côn trùng được phân lập từ mẫu côn trùng bị nhiễm nấmkí sinh ngoài tự nhiên gồm mẫu tằm bị nấm kí sinh tấn công tại vườn dâu huyệnBảo Lâm , tỉnh Lâm Đồng.

Hình 2.2.2 Vị trí lấy mấu nấm kí sinh

Mẫu nấm kí sinh sinh côn trùng Beauveria sp sau khi phân lập và làm thuần

sẽ tiến hành giữ giống tại phòng thí nghiệm Động vật học.

Sau đó các thí nghiệm được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Động vật học,Khoa Công nghệ sinh học, Trường Đại học Mở, cơ sở 3 Bình Dương.

2.3 THIẾT BỊ, DỤNG CỤ, MÔI TRƯỜNG:

2.3.1 Thiết bị:

- Mẫu nấm kí sinh côn trùng Beauveria sp đã được phân lập.

- Đối tượng thử nghiệm: rệp sáp (Planococcus citri)

- Hóa chất: cồn 700, cồn 960, D-Glucose, NaCl, dung dịch, pepton, cao nấmmen,

- Các nguyên liệu để phun dịch chiết nấm: nước, bình phun 1 lít, - Môi trường: Potato Dextrose Agar (PDA), SDAY, SDAY1,

- Các thiết bị và dụng cụ: tủ cấy vô trùng, đĩa petri, kính hiển vi huỳnhquang, ống nghiệm, que cấy, nồi hấp, tủ lạnh, tủ đông, cân điện tử, hộp nuôi rệpsáp,chai trung tính Schott, bình tam giác,…

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu chính:

- Quá trình nghiên cứu sử dụng các phương pháp như thống kê, so sánh,khảo sát, quan sát,

- Giữ nấm kí sinh côn trùng Beauveria sp đã được định danh hình thái vàSHPT chủng nấm Beauveria sp.

- Khảo sát các loại môi trường để chọn ra môi trường tối ưu nhất nuôi cấy

chủng nấm Beauveria sp kí sinh côn trùng

- Tiến hành thu mẫu rệp sáp tại các vườn cây ăn trái trong khu vực TỉnhBình Dương.

2.3.3 Môi trường, hóa chất và thuốc nhuộm:

Môi trường: Môi trường Potato Dextrose Agar (PDA)

Thuốc nhuộm: Thuốc nhuộm Lactophenol Control blue (LPCB)

Hóa chất: Nacl, đường Glucose, cồn 96, cồn 70, , pepton, cao nấm men.

2.4 PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN

2.4.1 Bố trí thí nghiệm

−Chủng nấm Beauveria sp đã phân lập & giữ chủng

−Nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh học của chủng nấm Beauveria sp.

−Phương pháp hỗ trợ định danh các dòng nấm kí sinh côn trùng vừa tìmđược dựa trên hình thái và bằng kĩ thuật sinh học phân tử.

−Khảo sát sự ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng đến sự phát triển của chủng

nấm Beauveria sp.

−Khảo sát sự ảnh hưởng của pH lên sự phát triển của nấm kí sinh côn trùng

Beauveria sp.

−Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên sự phát triển của nấm kí

sinh côn trùng Beauveria sp.

−Khảo sát hiệu lực gây chết của dịch chiết chủng nấm Beauveria sp ở mậtđộ bào tử khác nhau đối với rệp sáp Planococcus citri trong điều kiện phòng thí

−Khảo sát hiệu lực gây chết của dịch chiết chủng nấm Isaria fumosoroseaBb-V3 ở mật độ bào tử khác nhau đối với rệp sáp Planococcus citri trong điều

kiện phòng thí nghiệm.

−Khảo sát hiệu lực gây chết của 2 dịch chiết chủng nấm Isaria

fumosorosea Bb-V3 Và Beauveria spp ở mật độ bào tử khác nhau đối với rệp

sáp Planococcus citri trong điều kiện phòng thí nghiệm.

2.4.2 Nhân nuôi nguồn rệp sáp

Thu nhập mẫu như: rau, cây ăn trái,…có dấu hiệu bị rệp sáp Planococcus

citri đem về phòng thí nghiệm Động vật học, khoa công nghệ sinh hoc, trườngĐại học Mở Thành Phố Hồ Chí Minh, cơ sở 3 Bình Dương sẽ được tiến hànhnhân nuôi bằng cách thả cho rệp kí sinh trên trái bí đỏ bỏ vào các hộp nhựa cóđục lỗ Rệp sẽ bám vào vỏ ngoài của trái bí đỏ , rệp sẽ trải qua các vòng đời vàbắt đầu sinh sản, trong quá trình nhân nuôi rệp cần theo dõi vệ sinh hộp đựng vàbí sạch sẽ tránh để nhiễm nấm mốc làm chết rệp Tiến hành quan sát sự phát triển

hại cây ăn quả được dựa vào tài liệu Cục Bảo vệ thực vật- Bộ Nông nghiệp vàphát triển nông thôn.

2.4.3 Phương pháp định danh các dòng nấm kí sinh côn trùng vừa tìm được dựatrên hình thái và bằng kĩ thuật sinh học phân tử.

⮚ Mô tả đặc điểm hình thái chủng nấm kí sinh côn trùng Beauveria sp.

−Quan sát nấm trên vật chủ−Cấu trúc sinh bào tử−Bào tử đính

−Khuẩn lạc trên môi trường PDA.⮚ Tách chiết DNA

DNA của nấm kí sinh côn trùng được tách chiết theo hướng dẫn của bộ KIT:GeneJET Plant Genomic DNA Purification Mini Kit.

Phản ứng PCR được thực hiện với tổng thể tích phản ứng là 25µl với cácthành phần: 12 µl Master mix, 2µl DNA, 1,2µl mồi xuôi, 1,2µl mồi ngược và8,6µl nước cất Cho vào máy PCR và chỉnh thời gian, nhiệt độ theo chu kì nhưhình 2.4.3 sau:

⮚ Điện di gel chứa sản phẩm PCR.

Sản phẩm DNA của nấm kí sinh côn trùng sau khi đã khuếch đại bằng phảnứng PCR sẽ tiếp tục được phân tích bằng điện di trên gel agarose 1% Sau khiđiện di trên gel agarose.

Cách tiến hành:

− Chuẩn bị gel agarose 1%.

− Chạy điện di trên gel agarose: đặt khuân gel vào bể điện di TAE buffer 1Xcho ngập giếng, load vào mỗi giếng 6µl DNA đã được trộn với 1µl loading buffer.Load 6µl thang chuẩn vào giếng còn lại Bật nguồn điện cho thiết bị chạy ở 70Vtrong 40 phút Sau đó tắt nguồn điện, lấy khuân gel ra khỏi thiết bị điện di vàchụp hình gel.

−Chụp hình gel đã chạy điện di.

⮚ Giải trình tự DNA và xây dựng cây phát sinh loài

- Sử dụng chương trình BLAST và CLUSTAL để so sánh trình tự DNA củanấm với trình tự các đoạn DNA của bộ gen của các loài nấm có trong ngân hànggen (NCBI) và vẽ cây phả hệ để định danh vi nấm Xây dựng cây phát sinh loàibằng phần mềm MEGA X.

- Tiến hành giữ chủng nấm kí sinh côn trùng Beauveria sp và quan sát các

đặc điểm hình thái của chủng nấm

Hình 2.4.3 Phản ứng PCR

- Phương pháp dựng cây bằng phương pháp: Neighbor-Joining, MaximumParsimony và Maximum Likelihood

⮚ Cách giữ chủng nấm:- Chuẩn bi 0.5 kg lúa- Ngâm nước 6-8h- Hấp cách thủy trong 3h

- Trộn 8g D-glucose + 100ml nước cất- Chia đều vào các bình serrum nhỏ- Hấp khử trùng 121C /atm/20p- Để 24-48h

- Cấy nấm Beauveria sp thuần chủng

- Bảo quản ở điều kiện tối, nhiệt độ phòng

- Các bước giữ giống chủng nấm Beauveria sp.

Ghi nhận các đặc điểm của nấm kí sinh côn trùng như sau:- Mặt dưới đĩa petri

- Mặt trên đĩa petri

⮚ Quan sát trên kính hiển vi :

Cách thực hiện: lấy một lame kính sạch, trong, đã sấy khô Cắt một khunggiấy lọc hình vuông cạnh 2cm và có độ dày của cạnh khung là 0.3cm Đặt khunggiấy lên giữa lam kính rồi bơm dịch môi trường PDA bán lỏng (khoảng 10µ) lênlam kính vào giữa khung giấy Tiếp đến cấy nấm vào giữa môi trường đã được

bơm vào (cấy đơn bào tử hay cấy đầu sợi nấm) Đậy lamen lên và đặt lên thanhchữ U trong buồng ấm ở đây sử dụng địa petri bên trong có chứa bông gòn ẩmbên trên có đặt thnah chữ U bằng sắt) Để trong hai ngày, sau đó lấy lam kính ra,bỏ khung giấy lọc, tiến hành nhuộm bằng lactophenol và quan sát Quan sát đặcđiểm vi thể: dạng bào tử, tơ nấm, cuống bào tử ở vật kính ×40 Chụp ảnh khómnấm trên đĩa petri và vi thể nấm trên kính

2.4.4 Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng nấm Beauveria sp.

2.4.4.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng đến sự phát triển của

chủng nấm Beauveria sp.

Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 nghiệmthức gồm chủng nấm phân lập được và môi trường dinh dưỡng khác nhau SDAY,SDAY1, PDA Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, mỗi lần lặp lại là ba đĩa nấm.- Điều kiện: nhiệt độ phòng, tối hoàn toàn.

- Chuẩn bị chủng nấm Beauveria sp thuần

- Cấy vào dĩa petri trên 3 môi trường ( SDAY, SDAY1, PDA )- Nuôi trong điều kiện tối, nhiệt độ phòng

- Nuôi trong môi trường có pH là 6.5

- Theo dõi nấm phát triển sau 6,8,10,12 ngày- Đo đường kính khuẩn lạc và ghi chép số liệu

Bảng 2.4.4.1.Bảng thành phần môi trường thạch

Thành phần Đơn vị tính

Công thức môi trường

Mục đích: Để đánh giá ảnh hưởng của pH lên sự sinh bào tử của nấm kí sinh

côn trùng Beauveria sp kết quả từ thí nghiệm 2.4.1.1, sau khi chọn được môi

trường nấm sinh trưởng và đạt bào tử tốt nhất thì sẽ sử dụng cho thí nghiệm này.

- Chuẩn bị chủng nấm Beauveria sp thuần

- Pha môi trường PDA vào 5 bình erlen- Điều chỉnh pH bằng máy đo pH- Pha môi trường PDA vào 5 bình erlen

- Đem hấp 121°C ( 1atm) trong 30 phút Để nguội đổ môi trường đĩa petri- Cấy vào đĩa petri có 5 mức dộ pH 5; 5,5; 6; 6,5; 7; 7,5.

- Nuôi ở điều kiện tối, nhiệt độ phòng

- Đo đường kính khuẩn lạc và ghi chép số liệu sau 12 ngày.

2.4.4.3 Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên sự phát triển của nấm

kí sinh côn trùng Beauveria sp.

Mục đích: để đánh giá ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên sự sinh bào tử

của nấm kí sinh côn trùng Beauveria sp Môi trường sủ dụng là môi trường tốt

nhất từ thí nghiệm 2.4.4.1 và pH tối ưu từ thí nghiệm 2.4.4.2

- Chuẩn bị chủng nấm Beauveria sp thuần

- Cấy nấm vào đĩa petri có môi trường tối ưu từ thí nghiệm 2.4.4.1 và pH tối ưuở thí nghiệm 2.4.4.2

- Nuôi trong điều kiện tối, nhiệt độ phòng

- Theo dõi sự phát triển của nấm sau 6, 8,10, 12 ngày.- Đo đường kính khuẩn lạc và đếm mật độ bào tử.- Ghi chép số liệu

Phương pháp chung cho cả 3 thí nghiệm trên:

Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi nghiệmthức được lặp lại 3 lần, mỗi lần lặp lại là bốn đĩa nấm, đĩa petri được hấp khửtrùng ở 1210C (1atm) trong 30 phút sau đó đi sấy khô và đổ môi trường PDA đãhấp sẵn.

Thu thập số liệu và thống kê bằng Microsoft EXCEL và các chỉ tiêu theo dõiđược so sánh bằng phương pháp phân tích phương sai một nhân tố (One-WayANOVA), sau đó so sánh LSD xử lý thống kê bằng phần mền STATGRAPHICSplus.

Chỉ tiêu theo dõi sự phát triển của nấm Beauveria sp.:

− Sau 6, 8, 10, 12 ngày nuôi cấy

− Tốc độ phát triển trung bình (mm/ngày): đo độ dài đường kính trên 2 trục củakhuẩn lạc sau các ngày nuôi cấy theo công thức ( Trịnh Xuân Thu và Lê TuấnAnh, 2016):

d=�� + ���

Trong đó: d1 và d2 là độ dài 2 dường kính chéo phần khuẩn lạc phân bố trênđĩa petri.