nhân nhanh chồi bắp zea mays l in vitro

Ảnh hưởng của nồng độ casein hydrolysate kết hợp với BA trong quá trình tạo chồi từ đoạn thân cây bắp hủy đỉnh sinh trưởng, 4 tuần tuổi .... Ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với IAA tron

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM

BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Tên đề tài:

NHÂN NHANH CHỒI BẮP ZEA MAYS L IN

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: NÔNG NGHIỆP-DƯỢC-MÔI TRƯỜNG

CBHD: ThS Nguyễn Trần Đông Phương

SVTH: Phạm Thị Ngọc Quỳnh MSSV: 1253010315

Khóa: 2012 – 2016

Bình Dương, tháng 05 năm 2016

LỜI CẢM ƠN

Xin trân trọng cảm ơn trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học đã tạo điều kiện cho em tiếp thu kiến thức một cách tốt nhất, đã giúp em có một môi trường học tập và rèn luyện

Xin gửi lời cảm ơn đến tất cả các thầy cô đã giảng dạy cho em trong suốt thời gian qua, đã trang bị cho em những kiến thức cần thiết giúp em vững bước chân trong chặn đường sau này

Trân trọng cảm ơn cô Nguyễn Trần Đông Phương là người trực tiếp hướng dẫn và truyền đạt cho em những kiến thức quý báu để em thực hiện tốt đề tài của mình

Xin cảm ơn tất cả bạn bè, các anh chị em học việc trong phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào thực vật đã luôn bên cạnh động viên và giúp đỡ mình trong suốt thời gian thực hiện đề tài này

Và cuối cùng, con xin chân thành cảm ơn ba mẹ đã yêu thương và nuôi nấng con trưởng thành, luôn bên con, an ủi và cho con những lời khuyên khi con gặp khó khăn

Bình Dương, ngày 20 tháng 05 năm 2016 Phạm Thị Ngọc Quỳnh

1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Sơ lược về họ Hòa thảo (Poaceae) 3

1.2 Sơ lược về cây Bắp Zea mays L 4

1.2.2 Nguồn gốc, phân bố 4

1.2.3 Đặc điểm hình thái của cây Bắp 4

1.2.4 Đặc điểm sinh thái của cây Bắp 5

1.2.5 Thành phần và công dụng của cây Bắp 5

1.3 Nghiên cứu trong và ngoài nước 6

1.3.1 Nghiên cứu trong nước 6

1.3.2 Nghiên cứu ngoài nước 6

1.4 Nuôi cấy mô tế bào thực vật 6

1.4.1 Khái niệm và ứng dụng 6

1.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy mô 7

1.4.3 Các điều kiện ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy 8

1.4.4 Vai trò của chất điều hòa sinh trưởng thực vật 9

1.5 Sự phát sinh cơ quan 12

1.5.1 Phát sinh hình thái chồi bất định 12

1.5.2 Phát sinh hình thái rễ bất định 13

2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 15

2.1 Vật liệu 15

2.1.1 Địa điểm và thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp 15

2.1.2 Đối tượng nghiên cứu 15

2.1.3 Điều kiện nuôi cấy in vitro cây Bắp Zea mays L 15

2.2 Phương pháp nghiên cứu 16

2.2.1 Tạo cây con in vitro từ hạt cây Bắp 16

2.2.2 Khảo sát khả năng tạo chồi trên môi trường MS có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật 17

2.3 Bố trí thí nghiệm 20

3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22

3.1 Tạo cây con in vitro từ hạt cây Bắp 22

3.2 Khảo sát khả năng tạo chồi trên môi trường MS bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng thực vật 23

3.2.1 Môi trường MS có bổ sung BA 23

3.2.2 Môi trường MS có bổ sung kết hợp casein hydrolysate 500 mg/l với BA 28

3.2.3 Môi trường MS có bổ sung kết hợp IAA và BA 34

4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 42

4.1 Kết luận 42

4.2 Đề nghị 42

TÀI LIỆU THAM KHẢO 43

Tài liệu trong nước 43

Tài liệu ngoài nước 43

Hình 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ BA trong trong quá trình tạo chồi từ đoạn thân cây bắp (chẻ đôi đoạn thân, 4 tuần tuổi) 25

Hình 3.3 Ảnh hưởng của nồng độ BA trong quá trình tạo chồi từ đoạn thân cây bắp (hủy đỉnh sinh trưởng, 4 tuần tuổi) 27

Hình 3.4 Ảnh hưởng của nồng độ casein hydrolysate kết hợp với BA trong quá trình tạo chồi từ đoạn thân cây bắp (chẻ đôi đoạn thân, 4 tuần tuổi) 30

Hình 3.5 Ảnh hưởng của nồng độ casein hydrolysate kết hợp với BA trong quá trình tạo chồi từ đoạn thân cây bắp (hủy đỉnh sinh trưởng, 4 tuần tuổi) 33

Hình 3.6 Ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với IAA trong quá trình tạo chồi từ đoạn thân cây bắp (chẻ đôi đoạn thân, 4 tuần tuổi) 36

Hình 3.7 Ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với IAA trong quá trình tạo chồi từ đoạn thân cây bắp (hủy đỉnh sinh trưởng, 4 tuần tuổi) 39

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Ảnh hưởng của nồng độ casein hydrolysate lên khả năng nảy mầm của hạt bắp 16 Bảng 2.2 Ảnh hưởng của nồng độ BA trong quá trình tạo chồi từ đoạn thân cây bắp

(chẻ đôi đoạn thân) 17 Bảng 2.3 Ảnh hưởng của nồng độ BA trong quá trình tạo chồi từ đoạn thân cây bắp

(hủy đỉnh sinh trưởng) 18 Bảng 2.4 Ảnh hưởng của nồng độ casein hydrolysate kết hợp với BA trong quá trình

tạo chồi từ đoạn thân cây bắp (chẻ đôi đoạn thân) 18 Bảng 2.5 Ảnh hưởng của nồng độ casein hydrolysate kết hợp với BA trong quá trình

tạo chồi từ đoạn thân cây bắp (hủy đỉnh sinh trưởng) 19 Bảng 2.6 Ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với IAA trong quá trình tạo chồi từ

đoạn thân cây bắp (chẻ đôi đoạn thân) 19 Bảng 2.7 Ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với IAA trong quá trình tạo chồi từ

đoạn thân cây bắp (hủy đỉnh sinh trưởng) 20 Bảng 3.1 Ảnh hưởng của nồng độ casein hydrolysate lên khả năng nảy mầm của hạt

bắp (2 tuần tuổi) 22 Bảng 3.2 Ảnh hưởng của BA trong quá trình tạo chồi từ đoạn thân cây bắp (chẻ đôi

đoạn thân, 4 tuần tuổi) 24 Bảng 3.3 Ảnh hưởng của nồng độ BA trong quá trình tạo chồi từ đoạn thân cây bắp

(hủy đỉnh sinh trưởng, 4 tuần tuổi) 26 Bảng 3.4 Ảnh hưởng của nồng độ casein hydrolysate kết hợp với BA trong quá trình

tạo chồi từ đoạn thân cây bắp (chẻ đôi đoạn thân, 4 tuần tuổi) 29 Bảng 3.5 Ảnh hưởng của nồng độ casein hydrolysate kết hợp với BA trong quá trình

tạo chồi từ đoạn thân của cây bắp (hủy đỉnh sinh trưởng, 4 tuần tuổi) 32 Bảng 3.6 Ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với IAA trong quá trình tạo chồi từ

đoạn thân cây bắp (chẻ đôi đoạn thân, 4 tuần tuổi) 35 Bảng 3.7 Ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với IAA trong quá trình tạo chồi từ

đoạn thân cây bắp (hủy đỉnh sinh trưởng, 4 tuần tuổi) 38

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bắp (Zea mays L.) là một loài thực vật thuộc họ Hòa thảo với danh pháp khoa học là Poaceae Bắp thuộc cây thân thảo, chiều cao có thể lên đến khoảng 3 m Sự phân bố đầu tiên ở Mexico và Trung Mỹ sau đó lan sang các nước Đông Nam Á Bắp chủ yếu sống ở vùng nhiệt đới nhưng qua quá trình trồng trọt và chọn tạo tự nhiên đã có thể trồng trên những vùng đất với khí hậu khác nhau

Ở Việt Nam, Bắp là loại cây có diện tích và sản lượng thu hoạch đứng thứ hai sau lúa Tất cả các bộ phận của cây đều có thể sử dụng để làm lương thực, thực phẩm cho con người và làm thức ăn cho gia súc Tuy nhiên, con người thường trồng Bắp ở những khu vực miền núi, đất đai cằn cỗi, khô hạn, thiếu nước tưới, nghèo chất dinh dưỡng hoặc trồng xen canh với các loại cây trồng khác Đây là nguyên nhân chủ yếu khiến năng suất thu hoạch thường không cao Do đó, việc tăng năng suất Bắp là vô cùng quan trọng và hết sức cần thiết Muốn vậy, nền nông nghiệp nói chung và sản xuất Bắp nói riêng phải nhanh chóng tiếp thu các tiến bộ khoa học kỹ thuật, đầu tư vốn, nguồn giống

Hiện nay, trên thế giới đã có một số quốc gia nghiên cứu về Bắp Năm 1983, Mỹ đã nghiên cứu ứng dụng của nuôi cấy mô để tạo cụm chồi và phôi soma từ chồi ngọn Năm 2004, X.-Q Huang đã nghiên cứu khả năng tái sinh cây thông qua mô sẹo bắt đầu từ phôi của cây Bắp Zea mays L Trong nước cũng có nhiều nghiên cứu về loại cây này Năm 2006, Nguyễn Thị Phương Nam đã xây dựng hệ thống in vitro để tái sinh cây Bắp và sau đó ứng dụng để chuyển gen tạo protein giàu sắt

Do đó, chúng tôi tiến hành đề tài “Nhân nhanh chồi Bắp Zea mays L in vitro” nhằm tìm ra môi trường tối ưu cho việc tạo chồi cây Bắp trong điều kiện

đầu thông qua các cách xử lý khác nhau

1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sơ lược về họ Hòa thảo (Poaceae)

Họ Hòa thảo là họ thực vật một lá mầm, còn được biết đến với danh pháp khác là Gramineae Họ này khá đồng nhất được chia làm 3 phân họ, bao gồm 700 chi với khoảng 10.000 loài, phân bố khắp nơi trên Trái đất Ở Việt Nam, hiện biết khoảng 150 chi với gần 500 loài Đây là một trong những họ có tầm quan trọng lớn vì là nguồn cung cấp lương thực cho con người hoặc là thức ăn cho gia súc [3]

Hầu hết họ Hòa thảo là cây thân cỏ, sống lâu năm, ít khi 1 hay 2 năm, một số có dạng thân gỗ thứ sinh (tre, nứa ) Thân khí sinh chia lóng và mắt: lóng thường rỗng (trừ một số loài như mía, kê, ngô có thân đặc), không phân nhánh (trừ tre), mà chỉ phân nhánh từ thân rễ hoặc từ gốc Lá mọc cách, xếp thành hai dãy hai bên thân, ít khi có dạng xoắc ốc, gân lá song song Bẹ lá to, dài, hai mép của bẹ lá không dính liền nhau Lá không có cuống (trừ tre), phiến lá hình dải hẹp [3]

Các bông nhỏ hợp thành những cụm hoa phức tạp như bông kép, chùm, chùy Mỗi bông nhỏ mang 1-10 hoa Nhị thường là 3 (đôi khi 6), chỉ nhị dài bao phấn đính lưng, hai bao phấn khi chín thường loe ra thành chữ X Bộ nhụy 2 lá noãn hợp, bầu trên, 1 ô, 1 noãn đính đáy, 2 vòi nhụy ngắn và hai đầu nhụy dài mang chùm lông để hứng hạt phấn, thường màu nâu hoặc tím Các hạt phấn nhỏ, nhẹ, dễ dàng được gió chuyển đi đến thụ phấn cho hoa khác Quả dĩnh, vỏ quả và vỏ hạt dính nhau Chỉ một số loài của chi Bambusa (tre) mới có quả bế hay quả mọng Hạt chứa nhiều tinh bột Vỏ quả và vỏ hạt gồm những tế bào nhu mô chứa nhiều protein, vitamin, dầu Phôi nằm lệch 1 bên so với nội nhũ, ở gốc của quả dĩnh và phân cách với nội nhũ bởi một bộ phận gọi là lá mầm [3]

Một số cây thuộc họ Hòa thảo: bắp, lúa, mía, cỏ tranh, tre, nứa, giang, ý dĩ (bo bo)

1.2 Sơ lược về cây Bắp Zea mays L

1.2.1 Vị trí phân loại

Giới: Plantae

Ngành: Magnoliophyta

Lớp: Magnoliopsida Bộ: Poales

Họ: Poaceae Chi: Zea

Loài: Zea mays L

Tên gọi khác: Ngô, má khẩu lý (Thái) [3]

1.2.2 Nguồn gốc, phân bố

Bắp có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới Mexico và Trung Mỹ Từ thời cổ đại, người dân đã biết cách trồng cây này Đến thế kỉ thứ XVI, người Bồ Đào Nha đưa Bắp từ châu Mỹ vào vùng Đông Nam Á Ngày nay, Bắp đã trở thành loại cây cho hạt được trồng rộng rãi nhất thế giới Ở Việt Nam, Bắp cũng được coi là cây trồng cổ và được trồng ở khắp các địa phương, đặc biệt là các tỉnh trung du và miền núi [1]

1.2.3 Đặc điểm hình thái của cây Bắp

Bắp là cây thân thảo, cao 2-3 m Thân thẳng, đặc, nhẵn, không phân nhánh, các đốt ở gốc mang rễ Lá hình dải, dài 30-40 cm, thường gập xuống, gốc nhẵn sát thân, đầu thuôn nhọn, mép có lông mềm, dạng mi, gân giữa nổi rõ, bẹ lá nhẵn, lưỡi bẹ ngắn [1]

Cụm hoa đực mọc ở ngọn thân thành chùy, cuống có lông; bông nhỏ hình bầu dục mang 2 hoa, hoa có 3 nhị, bao phấn thuôn, mày mềm hình mũi mác, có lông Cụm hoa cái mọc ở kẽ lá thành bông dày hình trụ, không cuống: bông nhỏ

Hình 1.1 Cây Bắp (nguồn internet)

rất ngắn mang 1 hoa, hoa ở dưới rỗng, các hoa ở trên có bầu và vòi nhụy dài, mày mềm, khá rộng [1]

Quả cứng, bóng, màu vàng, đôi khi đỏ hoặc nâu, tím, xếp thành nhiều dãy, bao bọc bởi mày, có vòi tồn tại rất dài và mảnh [1]

1.2.4 Đặc điểm sinh thái của cây Bắp

Cây Bắp có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới nhưng qua quá trình trồng trọt, chọn lọc và thuần hóa nên Bắp đã có thể trồng trên nhiều vùng khí hậu khác nhau Bắp là cây ưa nhiệt, có thể sinh trưởng và phát triển tốt ở biên độ nhiệt từ 25-300C, pH trong khoảng 5,7-7,5 Ánh sáng là một yếu tố quan trọng cho sự sinh trưởng và phát triển của cây Bắp, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình tích lũy chất dinh dưỡng và ảnh hưởng đến độ dài quá trình sinh trưởng [1]

Cây Bắp có thể chống chịu tốt với điều kiện mất nước và quang hợp ở nhiệt độ cao Ở những vùng nóng, nơi có sự thoát hơi nước cao, nhu cầu nước của cây Bắp lại càng cao Bắp là cây trồng cạn cần nhiều nước nhưng cũng rất nhạy cảm với độ ẩm đất cao Đặc biệt, khi cây còn nhỏ chỉ cần nằm dưới nước 1-2 ngày cũng có thể bị chết [1]

1.2.5.2 Tác dụng dược lý

Râu Bắp có tác dụng lợi tiểu, tăng bài tiết mật, làm giảm lượng bilirubin và tăng lượng prothrombin trong máu trên động vật thí nghiệm Râu Bắp dưới

dạng chế phẩm ủ lên men, có tác dụng hạ đường máu trên động vật đái tháo đường Dầu Bắp có tác dụng làm hạ cholesterol máu ở người và một số động vật, làm giảm giảm mức độ bão hòa của β- lipoprotein trong máu với cholesterol, làm chậm sự thâm nhiễm β- lipoprotein vào động mạch chủ và giảm xơ vữa động mạch [1]

1.3 Nghiên cứu trong và ngoài nước

1.3.1 Nghiên cứu trong nước

Năm 1995, Nguyễn Hữu Hổ, Nguyễn Văn Uyển, Z Y Tkaschuc, L V

Tkaschuc đã tạo cụm chồi cây Bắp Zea mays L từ đỉnh sinh trưởng và phôi hạt

nuôi cấy in vitro

Năm 2007, Nguyễn Thị Phương Nam, Lê Tấn Đức, Phạm Đức Trí, Nguyễn Hữu Tâm, Nguyễn Hữu Hổ, Nguyễn Văn Uyển đã xây dựng hệ thống tái sinh

in vitro cây Bắp Zea mays L và sau đó ứng dụng để chuyển gen tạo protein

giàu sắt nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

1.3.2 Nghiên cứu ngoài nước

Năm 1992, Heng Zhong, C Srinivasan và Mariam B Sticklen đã nghiên cứu sự phát sinh hình thái của cây Bắp trong điều kiện in vitro.

Năm 2004, X.-Q Huang và cộng sự đã nghiên cứu khả năng tái sinh cây thông qua mô sẹo bắt đầu từ phôi của cây Bắp Zea mays L

1.4 Nuôi cấy mô tế bào thực vật

1 4.1 Khái niệm và ứng dụng

Thuật ngữ “nuôi cấy mô tế bào thực vật” được dùng một cách rộng rãi để nói về việc nuôi cấy tất cả các phần của thực vật (tế bào đơn, mô, cơ quan) trong điều kiện vô trùng Hệ thống nuôi cấy mô thực vật thường được sử dụng để nghiên cứu tất cả các vấn đề liên quan đến thực vật như sinh lí học, sinh hóa học, di truyền học và cấu trúc thực vật [5]

Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào và cơ quan thực vật hiện nay đã được củng cố vững chắc ở rất nhiều phòng thí nghiệm trên khắp thế giới Nhiều phương pháp đã được phát triển để nhân giống, chọn lọc các đặc điểm mong muốn khác nhau, tạo dòng tế bào, nhân nhanh các kiểu di truyền tạo ra các cây đơn bội từ nuôi cấy noãn và túi phấn, đa dạng hóa các kiểu di truyền bằng cách tạo đột biến và nhân dòng soma, tạo mô sẹo cô lập và nuôi cấy tế bào để nghiên cứu ảnh hưởng của khoáng, vitamin và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trên sự tăng trưởng và biệt hóa tế bào Nhiều kỹ thuật nuôi cấy mô đặc biệt đã được nghiên cứu và ứng dụng Trong tương lai, các mô được nuôi cấy sẽ được sử dụng như công cụ cơ bản và người ta đã sử dụng nhiều thuật ngữ chuyên biệt để phân biệt các kiểu nuôi cấy khác nhau: cấy cây, cấy phôi, cấy cơ quan, cấy mô, cấy tế bào, cấy tế bào trần, cấy túi phấn, hạt phấn [5]

1.4.2.2 Khử trùng mẫu cấy

Phần quan trọng nhất trong kĩ thuật vô trùng và quá trình nuôi cấy là khử trùng mẫu cấy, môi trường, duy trì trạng thái khi đưa mẫu vào bình Vi khuẩn và vi nấm là hai nguồn gây nhiễm trong nuôi cấy mô thực vật Bào tử nấm có trọng lượng nhẹ và hiện diện khắp nơi trong môi trường sống của chúng ta Khi bào tử nấm tiếp xúc với môi trường nuôi cấy thì đây là điều kiện thuận lợi cho sự nảy mầm của bào tử và từ đó phát triển nguồn lây bệnh [5]

1.4.2.3 Môi trường nuôi cấy

Sự lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp là một yếu tố quan trọng quyết định sự thành công trong nuôi cấy mô Nhìn chung, môi trường nuôi cấy sẽ bao gồm các muối vô cơ (các khoáng đa lượng và khoáng vi lượng), các chất hữu cơ như: chất điều hòa sinh trưởng thực vật, vitamin, đường Ngoài ra, môi trường nuôi cấy còn có các amino acid, kháng sinh hoặc các phức hợp tự nhiên

Cường độ chiếu sáng cao làm tăng sự thoát hơi nước, môi trường nuôi cấy bị khô và nước trong tế bào sẽ giảm xuống gây ảnh hưởng đến sự phân chia và tăng trưởng của chúng [5]

Cường độ chiếu sáng yếu làm ảnh hưởng đến sự dự trữ chất dinh dưỡng của cây vì sự quang hợp kém hơn sự hô hấp

1.4.3.2 Nhiệt độ

Nhiệt độ có ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của cây con in

vitro Nhiệt độ phòng nuôi cấy thường được điều chỉnh ổn định từ 22-250

C Một số loài cần có nhiệt độ tối ưu để tạo hình [5]

1.4.3.3 pH

Ảnh hưởng đến sự hòa tan các muối khoáng cần thiết cho cây Người ta thường chỉnh pH khoảng 5,7-5,8; đây là mức pH tốt để cây có thể hấp thụ muối khoáng [5]

1.4.3.4 Sự thoáng khí

Quá trình quang tự dưỡng diễn ra một cách tự nhiên nhờ sự hiện diện của khí CO2 trong không khí như một nguồn cung cấp carbon Trong nuôi cấy in vitro truyền thống, nồng độ CO2 trong bình nuôi cấy giảm trong quá trình quang hợp làm giảm khả năng quang tự dưỡng thông thoáng khí giúp cây trong nuôi cấy mô hô hấp và quang hợp tốt [9][10]

1.4.3.5 Muối khoáng

Nhu cầu khoáng của mô, tế bào thực vật tách rời không khác nhiều so với nhu cầu của cây ngoài tự nhiên Vì vậy, việc bổ sung đầy đủ các khoáng đa lượng và vi lượng là điều cần thiết [5]

1.4.3.6 Nguồn carbon

Chủ yếu cho mô nuôi cấy là đường Mô tế bào nuôi cấy có sự quang hợp giới hạn Vì vậy người ta cần thêm glucid cần thiết cho sự tăng trưởng của mô vào môi trường nuôi cấy [5]

1.4.3.7 Vitamin

Thực vật cần vitamin để xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau, các vitamin thường được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là: thiamin HCl (vitamin B1), pyridoxine HCl (vitamin B6), acid nicotinic, myo-inositol [5]

1.4.3.8 Agar

Agar là một polyosid có trọng lượng phân tử cao, được chiết ra từ rong biển loại gelidium Có tác dụng làm giá thể giúp mô nuôi cấy không bị ngập trong môi trường gây chết do thiếu oxy [5][6]

1.4.4 Vai trò của chất điều hòa sinh trưởng thực vật

1.4.4.1 Auxin

Auxin là những hợp chất được đặc tính hóa bởi khả năng gây ra sự kéo dài trong tế bào chồi trong vùng gần đỉnh và giống như indole-3-acetic acid (IAA) trong hoạt động sinh lý Auxin cũng có những ảnh hưởng khác nhau bên cạnh sự kéo dài, nhưng sự kéo dài là quan trọng nhất Auxin nói chung mang tính acid với một nhân không bão hòa hoặc những dẫn xuất của chúng

Auxin có thể được chia thành nhóm sau: dẫn xuất indole (Indole-3-acetic acid (IAA) và Indole-3-butyric acid (IBA)), dẫn xuất benzoic acid (2,3,6-trichlorobenzoic acid và 2-methoxy-3-6-dichlorobenzoic acid), dẫn xuất chlorophenoxyacetic acid (2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid (2,4,5-T) và 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D)), picolinic acid (4-amino-3,5,6-trichloropiconic acid), dẫn xuất naphthalene acid (α và β-naphthaleneacetic acid (α và β-NAA)), dẫn xuất naphthoxyacetic acid (α và β-naphthoxyacetic acid (α và β-NOA))

Những ảnh hưởng sinh lý: auxin liên quan đến nhiều quá trình sinh lý trong cây Ví dụ như: kéo dài tế bào, quang hướng động, địa hướng động, ưu thế chồi ngọn, sự tượng rễ, sự sản sinh ethylene, sự phát triển trái, sự trinh sản, sự rụng, sự thể hiện giới tính [5][6]

Hình 1.2 Auxin

1.4.4.2 Cytokinin

Cytokinin là những hợp chất adenin được thay thế, kích thích sự phân chia tế bào và những chức năng điều hòa sinh trưởng khác giống như kinetin (6-furfufylaminopurine) Cytokinin đầu tiên được phân lập từ DNA tinh trùng cá bẹ được thanh trùng và được gọi là kinetin bởi vì nó có khả năng kích thích sự phân chia tế bào hay sự phân bào (cytokinensis) trong mô lõi thuốc lá Cytokinin có nguồn gốc tự nhiên được phân lập đầu tiên từ hạt bắp non và được gọi là zeatin (6-(4-hydroxy-3-methyl-trans-2-butenyl-amino) purine) Ngày nay, hầu hết cytokinin được tìm thấy trong cây là zeatin

Hiện nay, cytokinin được tổng hợp khá nhiều, thông dụng nhất là kinetin furfurylaminopurine), BA (6-benzylaminopurine) và BPA (6-benzylamino)-9-(2-tetrahydropyranyl)-9H-purine) Cytokinin đã được tìm thấy ở hầu hết thực vật bậc cao, rêu, nấm kí sinh và không ký sinh, vi khuẩn, và cũng có trong phần lớn tRNA của vi sinh vật và tế bào động vật Hiện tại có hơn 200 loại cytokinin tự nhiên và tổng hợp đã được phát hiện

(6-Cytokinin ảnh hưởng nhiều đến sinh lý trong cây như sự phân chia tế bào và sự tạo thành cơ quan, sự nảy mầm, sự mở rộng tế bào và cơ quan, sự tượng rễ

Hình 1.3 Cytokinin

và sự phát triên rễ,sự phát triến nụ vàchồi, trì hoãn sự lão hóa và kích thích sựvận chuyểnchất dinh dưỡng vànhữnghợp chất hữu cơ[5][6].

Ngoài khả năngtạođược số lượng chồi lớn thì Casein hydrolysate còn giúp chồi dài, mập và xanh tốt.

1.5 Sự phát sinh cơ quan

Sựphát sinh hình thái ở thực vậtlà sự phát triển của tế bào, mô hay cơquan ở thựcvật Sự phát sinh hình thái ở thực vật phụ thuộc vào hai quátrìnhcănbản: sụ điều hòahướng kéo dài tế bào, sự kiêm soát vị tí và hướngphân chia củatế bào.

ỉ.5. ỉ Phát sinh hìnhthái chồi bất định

Chồi bất định là những chồi được hình thànhtừ các cơ quankhôngsinh sản của cây như lóng thân, lá, cuống lá, rễ,trục phát hoa,lá đài,cánh hoa Ngườita sử dụng phương pháptạo chồi bấtđịnh đếnhân giống vô tính, nhằm làm tăng

sốlượng cây mong muốn.

Chồi bất định phát triển từ các phôi soma Các tiền phôi được nuôi cấy trong các môi trường có chất điều hòa sinh trưởng không thích hợp sẽ tạo ra các chồi không có rễ (Sidavas và cộng sự, 1990) Bắt đầu là giai đoạn phản phân hóa để tạo mô sẹo, nhờ cảm ứng bởi nhiều yếu tố khác nhau mà quan trọng nhất là chất điều hòa sinh trưởng mà có sự hình thành mô phân sinh đỉnh chồi Sau đó, mô phân sinh đỉnh chồi phân hóa thành lá nguyên thủy, chồi bên và trở thành chồi trưởng thành [5][7]

1.5.2 Phát sinh hình thái rễ bất định

Rễ bất định là những rễ được tạo ra từ những trục thân hay từ những cơ quan khác nhau Rễ bất định có thể được sản sinh tự nhiên trong thời gian phát triển của cây Sự xuất hiện của rễ bất định cho ta nhiều cơ hội khác nhau trong việc nhân giống vô tính thực vật

Sự hình thành của rễ bất định bắt đầu ở trục giữa hoặc các mô dẫn truyền Hoạt động này có thể chia thành ba giai đoạn Hoạt động khởi đầu là những biến đổi về tế bào Các tế bào có tế bào chất đậm đặc hơn và nhân có màu, hạch nhân giãn nở, sự sinh tổng hợp các đại phân tử xảy ra mạnh hơn Những biến đổi này quyết định nguồn gốc của rễ Giai đoạn hai là sự phân bào, những mô mềm sẽ phân chia tế bào với số lượng lớn, mô mạch dẫn truyền không phân chia Sự phân chia này tạo thành những mô sẹo Trên vùng mô sẹo này, người ta nhận thấy tế bào phân hóa liên tục dẫn đến sự hoạt động của một nhóm tế bào khởi đầu gọi là mô phân sinh sơ khởi Khối mô phân sinh dạng hình cầu và kích thước gia tăng nhanh chóng Người ta còn nhận thấy khối mô này gia tăng liên tục bởi sự sát nhập của các tế bào lân cận, dẫn đến sự hình thành phát thể dạng bán cầu bao xung quanh mô phân sinh Phát thể này biểu thị vùng phân sinh rễ, hình thái ổn định sau đó và rễ được hình thành Cuối cùng là sự sinh trưởng và kéo dài của rễ, rễ chui qua vỏ ra ngoài và tạo thành rễ bất định [5][7]

2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu

2.1.1.1 Địa điểm: Phòng Công nghệ Tế Bào- Khoa Công nghệ Sinh Học

Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh

Sử dụng môi trường nuôi cấy MS cơ bản, bổ sung một số thành phần: Đường: 30 g/l

Agar Việt Xô: 7,5 g/l pH: 5,7-5,8

Chất điều hòa sinh trưởng thực vật được bổ sung tùy theo mục đích thí nghiệm, bao gồm: Casein hydrolysate, 6-Benzylaminopurine và Indole-3-acetic acid với nồng độ thay đổi

Sử dụng chai thủy tinh 500 ml, cho vào mỗi chai 40 ml môi trường, hấp khử trùng ở 121oC, 1 atm, trong 1 giờ

Độ ẩm trung bình: 70±5%

Thời gian chiếu sáng: 16 giờ/ ngày

2.1.4.3 Hóa chất dùng trong nuôi cấy mô

Javel Cồn 70o

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Tạo cây con in vitro từ hạt cây Bắp

Mục đích thí nghiệm: Khảo sát nồng độ khác nhau của casein hydrolysate

nhằm tìm ra nồng độ tốt nhất cho sự nảy mầm từ hạt của cây Bắp

Môi trường nuôi cấy: Môi trường MS bổ sung casein hydrolysate theo bảng

2.1

trong 1 phút Sau đó, hạt được lắc liên tục trong Javel 20% với thời gian 30 phút (lặp lại 2 lần)

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 5 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, 1 bình/lần, 5 hạt/bình

Thời gian theo dõi: 2 tuần

Bảng 2.1 Ảnh hưởng của nồng độ casein hydrolysate lên khả năng nảy mầm của hạt Bắp

Nghiệm thức Nồng độ casein hydrolysate mg/l

2.2.2 Khảo sát khả năng tạo chồi trên môi trường MS có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật

Mục tiêu thí nghiệm: Khảo sát nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thực vật

nhằm tìm ra môi trường tốt nhất tạo chồi từ đoạn thân của cây Bắp

Vật liệu thí nghiệm: Đoạn thân cây Bắp

Mô tả thí nghiệm: Cấy đoạn thân cây Bắp in vitro trên môi trường MS bổ

sung casein hydrolysate và chất điều hòa sinh trưởng thực vật với hai cách xử lý là chẻ đôi đoạn thân và hủy đỉnh sinh trưởng

Thời gian theo dõi: 4 tuần

Chỉ tiêu đánh giá: Số lượng, đặc điểm chồi tạo thành từ đoạn thân cây Bắp

sau 4 tuần nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy:

Môi trường MS bổ sung BA với nồng độ thay đổi theo bảng 2.2 và 2.3 tương ứng với hai cách xử lý

Thí nghiệm được bó trí theo kểu hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 11 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức lặp lại 6 lần, 1 mẫu/lần, cấy trong 3 bình, 1 bình 2 mẫu,

Bảng 2.2 Ảnh hưởng của nồng độ BA trong quá trình tạo chồi từ đoạn thân cây Bắp (chẻ đôi đoạn thân)

Tên nghiệm

thức

DC B1.1 B1.2 B1.3 B1.4 B1.5 B1.6 B1.7 B1.8 B1.9 B1.10

Nồng độ BA mg/l

Bảng 2.3 Ảnh hưởng của nồng độ BA trong quá trình tạo chồi từ đoạn thân cây Bắp (hủy đỉnh sinh trưởng)

Tên nghiệm

thức

DC B2.1 B2.2 B2.3 B2.4 B2.5 B2.6 B2.7 B2.8 B2.9 B2.10

Nồng độ BA mg/l

Bảng 2.5 Ảnh hưởng của nồng độ casein hydrolysate kết hợp với BA trong quá trình tạo chồi từ đoạn thân cây Bắp (hủy đỉnh sinh trưởng)

Bảng 2.7 Ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với IAA trong quá trình tạo chồi từ đoạn thân cây Bắp (hủy đỉnh sinh trưởng)

3 KẾT QUẢ VÀ THẢOLUẬN3.1 Tạo cây con in vitro từ hạt cây Bắp

Sau14ngàynuôi cấy, trênmôitruờng MS có bổ sung và không bo sung casein hydrolysate hạt bắpđều nảy mầm Tuy nhiên,nghiệm thức bổ sung casein hydrolysate với nồng độ500 mg/1cho kết quảnảymầm cao nhất so với các nghiệm thức còn lạiPong cùng điều kiện nuôi cấy (bảngIII 1, hỉnh III 1).

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của nồng độ casein hydrolysate lên khả năng nảy mầm của hạt Bắp (2 tuần tuối)

(những chữ cáikhácnhauthế hiện sựkhác biệt cóýnghĩathống kê p <0,05)Nghiệm thức Tỷ lệ nảy mầm (%)

Cl(MS+ caseinhydrolysate 300 mg/1) 46,67bC2(MS+ caseinhydrolysate400 mg/1) 66,67b

C3 (MS+ casein hydrolysate 500 mg/l)93,33a

C4(MS+ casein hydrolysate 600 mg/1) 53,33b

Chú thích:

A: Mẫu đối chứng trên môi trường MS

B: Mẫu trên môi trường MS+ 300 mg/l casein hydrolysate C: Mẫu trên môi trường MS+ 400 mg/l casein hydrolysate

D: Mẫu trên môi trường MS+ 500 mg/l casein hydrolysate

E: Mẫu trên môi trường MS+ 600 mg/l casein hydrolysate

Sau 2 tuần, ta nhận thấy trên tất cả các nghiệm thức hạt bắp đều nảy mầm Nghiệm thức C3 (MS+ casein hydrolysate 500 mg/l) cho kết quả tốt nhất với tỷ lệ nảy mầm là 93,33% Nghiệm thức C1 (MS+ casein hydrolysate 300 mg/l) không có sự khác biệt so với nghiệm thức đối chứng với tỷ lệ nảy mầm là 46,67%; điều này cho thấy casein hydrolysate ở nồng độ 300 mg/l không có tác động đến khả năng nảy mầm của hạt Bắp Theo Dương Công Kiên (2006), casein hydrolysate rất hay dùng trong nuôi cấy mô bởi vì nó cung cấp một hỗn hợp các acid amin tăng cường khả năng phản ứng của tế bào

3.2 Khảo sát khả năng tạo chồi trên môi trường MS bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng thực vật

Sau 4 tuần nuôi cấy, chồi hình thành từ đoạn thân của cây Bắp trên các nghiệm thức trong thí nghiệm cho thấy tác động của BA với những tỉ lệ khác nhau vào việc hình thành chồi và đặc điểm hình thái chồi khác nhau ở từng nghiệm thức Ở nghiệm thức B1.4 (MS+ BA 4 mg/l) cho chồi cao hơn so với các nghiệm thức còn lại trong cùng điều kiện và thời gian 4 tuần nuôi cấy Nghiệm thức B1.10 (MS+ BA 10 mg/l) thì các mẫu cấy có hiện tượng chết (bảng 3.2, hình 3.2)

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của BA trong quá trình tạo chồi từ đoạn thân cây Bắp (chẻ đôi đoạn thân, 4 tuần tuổi)

Số chồi (chồi/mẫu)

Chiều cao chồi (mm)

DC 0,50b 20,0b Chồi cao, ốm, rễ dài, số rễ >3 B1.1 (MS+ BA 1mg/l) 1,00ab 18,3bc Chồi to, mập, không có rễ B1.2 (MS+ BA 2 mg/l) 0,67b 21,7b Chồi cao, không có rễ B1.3 (MS+ BA 3 mg/l) 0,83ab 22,5b Chồi cao, không có rễ

B1.4 (MS+ BA 4 mg/l) 1,33a 31,7a Chồi tốt, không có rễ

B1.5 (MS+ BA 5 mg/l) 0,83ab 13,3cd Chồi nhỏ, ốm, không có rễ B1.6 (MS+ BA 6 mg/l) 1,00ab 12,5de Chồi thấp, không có rễ B1.7 (MS+ BA 7 mg/l) 0,83ab 10,0de Chồi thấp, không có rễ B1.8 (MS+ BA 8 mg/l) 0,83ab 12,5de Chồi thấp, không có rễ B1.9 (MS+ BA 9 mg/l) 0,83ab 7,5e Chồi thấp, không có rễ

cv %= 49,40 cv%= 28,72

(những chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê P ≤0,05)

NG

Hình 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ BA trong trong quá trình tạo chồi từ đoạn thân cây Bắp (chẻ đôi đoạn thân, 4 tuần tuổi)

(Lưu ý: sự phát triển của chồi bên được chỉ thị bằng dấu mũi tên)

Chú thích

A: Mẫu đối chứng trên môi trường MS D: Chồi trên môi trường MS 9 mg/l BA

B: Chồi trên môi trường MS 2 mg/l BA E: Chồi trên môi trường MS 10 mg/l BA

C: Chồi trên môi trường MS 4 mg/l BA

3.2.1.2 Hủy đỉnh sinh trưởng

Sau 4 tuần nuôi cấy, chồi tạo thành từ đoạn thân cây Bắp trên các nghiệm thức trong thí nghiệm cho thấy tác động của BA với những tỉ lệ khác nhau vào việc hình thành chồi và đặc điểm hình thái chồi khác nhau ở từng nghiệm thức Nghiệm thức B2.4 (MS+ BA 4 mg/l) cho chồi cao hơn so với các nghiệm thức còn lại trong cùng điều kiện và thời gian nuôi cấy Nghiệm thức B2.10 (MS+ BA 10 mg/l) thì các mẫu cấy có hiện tượng mẫu chết (bảng 3.3, hình 3.3)

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của nồng độ BA trong quá trình tạo chồi từ đoạn thân cây Bắp (hủy đỉnh sinh trưởng, 4 tuần tuổi)

cv%= 13,32 cv %= 23,94

(những chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê P ≤ 0,05)