đánh giá hiệu quả kiểm soát sinh học nấm và tuyến trùng gây bệnh thối rễ của bộ sản phẩm vi sinh trên vườn cà phê coffea canephora ở đắk nông

--- ∞0∞--- VŨ THỊ THÚY HẰNG ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ KIỂM SOÁT SINH HỌC NẤM VÀ TUYẾN TRÙNG GÂY BỆNH THỐI RỄ CỦA BỘ SẢN PHẨM VI SINH TRÊN VƯỜN CÀ PHÊ Coffea canephora Ở ĐẮK NÔNG KHÓA LUẬN TỐT NG

Trang 1

- ∞0∞ -

VŨ THỊ THÚY HẰNG

ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ KIỂM SOÁT SINH HỌC NẤM VÀ TUYẾN TRÙNG GÂY BỆNH THỐI RỄ CỦA

BỘ SẢN PHẨM VI SINH TRÊN VƯỜN CÀ PHÊ

(Coffea canephora) Ở ĐẮK NÔNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

TP HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022

Trang 2

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - ∞0∞ -

VŨ THỊ THÚY HẰNG

ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ KIỂM SOÁT SINH HỌC NẤM VÀ TUYẾN TRÙNG GÂY BỆNH THỐI RỄ CỦA

BỘ SẢN PHẨM VI SINH TRÊN VƯỜN CÀ PHÊ

(Coffea canephora) Ở ĐẮK NÔNG

Mã số sinh viên: 1853010044 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn: ThS NGUYỄN VĂN MINH ThS DƯƠNG NHẬT LINH

TP HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022

Trang 3

Tôi tên là: Vũ Thị Thúy Hằng

Ngày sinh: 29/11/2000 Nơi sinh: Đắk Lắk

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học- Nông nghiệp- Môi trường Mã số sinh viên: 1853010044

Tôi đồng ý cung cấp toàn văn thông tin khóa luận tốt nghiệp hợp lệ về bản quyền cho Thư viện Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh Thư viện Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh sẽ kết nối toàn văn thông tin khóa luận tốt nghiệp vào hệ thống thông tin khoa học của Sở Khoa học và Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh

Ký tên

(Ghi rõ họ và tên)

Vũ Thị Thúy Hằng

Trang 4

SVTH: VŨ THỊ THÚY HẰNG iii

Ý KIẾN CHO PHÉP BẢO VỆ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỦA GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN Giảng viên hướng dẫn: ThS Nguyễn Văn Minh, ThS Dương Nhật Linh Học viên thực hiện: Vũ Thị Thúy Hằng Lớp: DH18 – NN01 Ngày sinh: 29/11/2000 Nơi sinh: Đắk Lắk Tên đề tài: ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ KIỂM SOÁT SINH HỌC NẤM VÀ TUYẾN TRÙNG GÂY BỆNH THỐI RỄ CỦA BỘ SẢN PHẨM VI SINH TRÊN VƯỜN CÀ PHÊ (Coffea canephora) Ở ĐẮK NÔNG Ý kiến của giáo viên hướng dẫn về việc cho phép sinh viên được bảo vệ khóa luận trước Hội đồng:………

Nguyễn Văn Minh Dương Nhật Linh

Trang 5

Lời đầu tiên, em xin được gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến thầy Nguyễn

Văn Minh và cô Dương Nhật Linh đã luôn kề bên quan tâm, hướng dẫn và

truyền đạt những kiến thức quý báu từ lúc từ những ngày đầu em bước vào trường và làm việc tại phòng thí nghiệm

Em xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô trong khoa Công nghệ sinh học nói chung và các thầy cô trong tổ chuyên ngành Nông nghiệp – Môi trường nói riêng đã truyền đạt cho em những kiến thức bổ ích để em có thể thực hiện đề tài này

Em xin cảm ơn chị Trần Thị Á Ni và anh Trần Hoàng Tú cùng các bạn

trong phòng thí nghiệm Công nghệ Vi sinh đã nhiệt tình giúp đỡ em giải đáp những thắc mắc, khó khăn trong quá trình học tập lẫn thực hiện đề tài

Con xin được gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến Bố Mẹ và

người thân trong gia đình người đã nuôi nấng, dạy dỗ con lớn khôn, tạo điều kiện tốt nhất để con có thể học tập, cũng là động lực và niềm tin để con có thể vượt qua được những thử thách trong cuộc sống, luôn bên con chia sẻ những khi con gặp khó khăn và ủng hộ con hết lòng

Cuối cùng, em xin kính chúc quý thầy cô, các anh chị, các bạn và gia đình có thật nhiều sức khỏe, hạnh phúc và thành công trong công việc và cuộc sống Em xin chân thành cảm ơn!

TP Hồ Chí Minh, ngày 23 tháng 8 năm 2022

Vũ Thị Thúy Hằng

Trang 6

SVTH: VŨ THỊ THÚY HẰNG v

MỤC LỤC LỜICẢMƠN ii

DANHMỤCCÁCTỪVIẾTTẮT viii

DANHMỤCBẢNG ix

DANHMỤCHÌNHẢNH x

DANHMỤCBIỂUĐỒ xii

ĐẶTVẤNĐỀ 2

PHẦN1:TỔNGQUANTÀILIỆU 4

1 TỔNG QUAN VỀ CÂY CÀ PHÊ 5

1.1 Đặc điểm thực vật học của cây cà phê 5

1.2 Đặc điểm hình thái và phân bố 5

1.3 Sơ lược về vi nấm gây hại cà phê Fusarium sp., Pythium sp 6

1.6 Vi sinh vật phân giải lân 10

1.7 Vi sinh vật phân giải cellulose 11

Trang 7

SVTH: VŨ THỊ THÚY HẰNG vi

1 VẬT LIỆU 17

1.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 17

1.2 Đối tượng nghiên cứu 17

1.3 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất và môi trường 18

2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Thông tin bộ sản phẩm vi sinh và cách sử dụng 18

2.2 Bố trí thí nghiệm 22

2.3 Quy trình thu nhận và xử lý mẫu 24

2.3.1 Thu nhận mẫu 24

2.3.2 Xử lý mẫu 24

2.3.3 Quan sát hình thái đại thể, vi thể 28

PHẦN 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 29

1.1 Kết quả kiểm tra mật độ nấm Pythium sp có trong đất trước và sau khi sử dụng bộ chế phẩm vi sinh trong 6 tháng 30

1.2 Kết quả kiểm tra mật độ nấm Fusarium sp có trong đất trước và sau khi sử dụng bộ chế phẩm vi sinh trong 6 tháng 34

1.3 Kết quả kiểm tra mật độ vi sinh vật cố định đạm có trong đất trước và sau khi sử dụng bộ chế phẩm vi sinh trong 6 tháng 37

1.4 Kết quả kiểm tra mật độ vi sinh vật phân giải lân có trong đất trước và sau khi sử dụng bộ chế phẩm vi sinh trong 6 tháng 41

1.5 Kết quả kiểm tra mật độ vi sinh vật phân giải cellulose có trong đất trước và sau khi sử dụng bộ chế phẩm vi sinh 6 tháng 45

1.6 Kết quả kiểm tra mật độ tuyến trùng Meloidogyne sp có trong đất trước và sau khi sử dụng bộ chế phẩm vi sinh trong 6 tháng 48

1.7 Kết quả kiểm tra mật độ tuyến trùng Pratylenchus sp có trong đất trước và sau khi sử dụng bộ chế phẩm vi sinh trong 6 tháng 48

1.8 Kết quả đánh giá khả năng sinh trưởng chiều cao thân trước và sau khi sử dụng bộ chế phẩm vi sinh trong 6 tháng 49

Trang 8

SVTH: VŨ THỊ THÚY HẰNG vii

Tài liệu tham khảo tiếng việt 56Tài liệu tham khảo tiếng Anh 58PHỤLỤC 63

Trang 9

VSV Vi sinh vật

Trang 10

Bảng 3 1 Mật độ nấm Pythium sp có trong 1g đất trước và sau khi sử dụng bộ chế

phẩm vi sinh trong 6 tháng ……… 30Bảng 3 2 Mật độ vi sinh vật cố định đạm có trong 1g đất trước và sau khi sử dụng bộ chế phẩm vi sinh trong 6 tháng 37Bảng 3 3 Mật độ vi sinh vật phân giải lân có trong 1g đất trước và sau khi sử dụng bộ chế phẩm vi sinh trong 6 tháng 41Bảng 3 4 Mật độ vi sinh vật phân giải cellulose có trong 1g đất trước và sau khi sử dụng bộ chế phẩm vi sinh trong 6 tháng 45Bảng 3 5 Kết quả độ chênh lệch chiều cao cây trước và sau khi sử dụng bộ chế phẩm vi sinh trong 6 tháng (cm) 49

Trang 11

SVTH: VŨ THỊ THÚY HẰNG x

DANHMỤCHÌNHẢNH Hình 1 1 Cây cà phê vối (Coffea canephora) 5

Hình1 2 Chu kì gây bệnh của tuyến trùng hại rễ (Grains research & Development Corporation, 2019)……… 9

Hình 2 1 Địa điểm đất trồng cà phê 17

Hình 3 1 Kết quả vi sinh vật phân giải Pythium sp trong mẫu đất tháng 12 31

Hình 3 2 Kết quả vi sinh vật phân giải Pythium sp trong mẫu tháng 1 31

Hình 3 4 Kết quả vi sinh vật phân giải Pythium sp.trong mẫu đất tháng 3 32

Hình 3 5 Kết quả vi sinh vật phân giải Pythium sp.trong mẫu đất tháng 4 32

Hình 3 7 Hình ảnh vi thể nấm Pythium sp quan sát dưới kính hiển vi 33

Hình 3 8 Hình thái đại thể mẫu đối chứng (A) và mẫu thí nghiệm (B) có trong mẫu đất tháng 12 34

Hình 3 14 Kết quả vi sinh vật cố định đạm trong mẫu đất tháng 12 38

Trang 12

SVTH: VŨ THỊ THÚY HẰNG xi

Hình 3 20 Kết quả vi sinh vật phân giải lân trong mẫu tháng 12 42

Hình 3 21 Kết quả vi sinh vật phân giải lân trong mẫu đất tháng 1 42

Hình 3 26 Kết quả vi sinh vật phân giải cellulose trong mẫu đất tháng 12 46

Hình 3 32 Chiều cao cây cà phê đối chứng (A) và cây sử dụng bộ chế phẩm vi sinh (B) tháng 12 50

Trang 14

SVTH: VŨ THỊ THÚY HẰNG 2

Tại Việt Nam, cây cà phê (Coffea canephora) là mặt hàng nông sản xuất khẩu

đứng thứ 2 sau lúa gạo Năm 2021 cà phê xuất khẩu đạt 1.56 triệu tấn, đóng góp 3.07 tỉ USD vào ngân sách nhà nước Tổng diện tích trồng cà phê năm 2021 ước đạt 694.000 ha tập trung chủ yếu ở các tỉnh Tây Nguyên (Bộ Công thương, 2022) Bên cạnh đó, cây cà phê là cây xóa đói giảm nghèo và trở thành cây làm giàu cho nhiều hộ nông dân Trồng cà phê không chỉ mang lại hiệu quả kinh tế, mà còn phủ xanh đất trống đồi trọc, bảo vệ môi trường sinh thái

Các bệnh cây cà phê thường mắc phải là do tuyến trùng, nấm, rệp, mối , gây nên Các nhóm tuyến trùng phổ biến nhất và gây hại nhiều nhất trên cà phê là

Meloidogyne sp là 43% và Pratylenchus sp cũng bắt gặp khá nhiều (Nguyễn Văn

Vấn và cộng sự, 2015) làm cho rễ cây bị sung u, nứt nẻ, cây sinh trưởng kém, đồng thời bị héo vàng vào mùa khô, bệnh nặng cây sẽ chết Sau khi rễ cây bị sự xâm nhập của tuyến trùng sẽ có các vết thương hở làm cho nấm và các vi khuẩn có hại dễ dàng tấn công hơn Bệnh thối rễ gây hại nghiêm trọng cho cây cà phê và có liên

quan đến sự kết hợp giữa nấm gây bệnh Fusarium sp và tuyến trùng hại rễ Các hiện tượng do nấm Fusarium sp gây ra như xâm chiếm hệ thống mạch của rễ và thân cây do loài Fusarium oxysporum gây nên (Roberto Gamboa-Becerra và cộng sự, 2021), Fusarium xylarioides tấn công vào hệ mạch của cây và làm cho cây héo cuối cùng dẫn đến chết (Serani và cộng sự, 2007) Nấm Fusarium sp có thể tồn tại

vài năm trong đất vẫn có thể xâm nhập vào cây chủ (Nguyễn Thị Liên và cộng sự, 2017) Ngoài ra bệnh thối rữa hạt và rễ cây cà phê con cũng có mối quan hệ chặt

chẽ giữa các loại nấm Pythium sp., Fusarium sp., Rhizoctonia sp (Filani, 1976)

Nguyên nhân gây vàng lá và thối rễ ở nhóm cà phê tái canh ở khu vực Tây Nguyên chủ yếu là do tuyến trùng và nấm

Để phòng trừ sâu bệnh hại có thể sử dụng các biện pháp khác nhau nhưng hiện nay tỉ lệ người dân sử dụng thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc hóa học vẫn còn rất cao Việc sử dụng thuốc hóa học để phòng trừ sâu bệnh hại cây trồng gây ô nhiễm môi trường, ảnh hưởng đến sức khỏe của người nông dân Đặc biệt, lượng phân bón

Trang 15

dư thừa này sẽ gây ảnh hưởng đến chất lượng đất và sự tồn tại của hệ vi sinh vật đất (Lâm Văn Hà, 2016) ngoài ra dư lượng phân bón, cũng như thuốc trừ sâu nhiễm vào các nguồn nước sinh hoạt của người nông dân, làm gia tăng các bệnh hiểm nghèo ở người như: bệnh ung thư, v.v (Nguyễn Tuấn Khanh, 2010) Bên cạnh đó, việc sử dụng các thuốc trừ sâu sẽ ảnh hưởng đến chất lượng hạt cà phê, làm cho hạt cà phê Việt Nam không thể xuất khẩu sang những nước có yêu cầu cao về chất lượng Để góp phần giải quyết các vấn đề trên, việc sử dụng các loại chế phẩm sinh học chứa các loại vi sinh vật có tính đối kháng với vi nấm và vi khuẩn gây bệnh hại cây trồng là hướng đi an toàn và thân thiện với môi trường

Hiện nay, ở Việt Nam đã có rất nhiều những nghiên cứu về sinh vật đối kháng nhưng chỉ trên điều kiện phòng thí nghiệm vẫn còn rất ít những công bố trên điều kiện thực tế ngoài đồng ruộng Từ những lí do trên, tôi quyết định thực hiện đề tài:

“Đánh giá khả năng kiểm soát sinh học nấm và tuyến trùng gây bệnh thối rễ

của bộ sản phẩm vi sinh trên vườn cà phê (Coffea canephora) ở Đắk Nông”

• Nội dung nghiên cứu:

- Đánh giá khả năng kiểm soát nấm Fusarium sp., Pythium sp và

tuyến trùng Meloidogyne sp., Pratylenchus sp gây bệnh vàng lá, thối rễ trên vườn cà phê (Coffea canephora) trước và sau khi sử dụng bộ

chế phẩm vi sinh trong vòng 6 tháng

- Đánh giá khả năng vi sinh vật phân giải lân, phân giải cellulose và khả

năng cố định đạm trên vườn cà phê (Coffea canephora) trước và sau

khi sử dụng bộ chế phẩm vi sinh trong vòng 6 tháng

- Đánh giá khả năng sinh trưởng: Chiều cao thân của 2 lô nghiệm thức

đối chứng và thực nghiệm

Trang 16

Trang 17

SVTH: VŨ THỊ THÚY HẰNG 5 1 TỔNG QUAN VỀ CÂY CÀ PHÊ

1.1 Đặc điểm thực vật học của cây cà phê

Cà phê vối có tên khoa học là Coffea canephora

Hình 1 1 Cây cà phê vối (Coffea canephora)

Vị trí phân loại

Giới (Regnum): Plantae Bộ (Ordo): Rubiales Họ (Familia): Rubiaceae

Chi (Genus): Coffea

Loài (Species): Coffea canephora

1.2 Đặc điểm hình thái và phân bố

Cà phê là cây thân gỗ thuộc bộ Rubiales, họ Rubiacea, chi Coffea Phân bố

chủ yếu ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới ít gặp ở vùng ôn đới Theo phân loại

thực vật học cà phê có khoảng 500 chi với trên 6.000 loại, chi Coffea có khoảng 100 loài khác nhau Các giống cà phê hiện đang trồng đều thuộc chi Coffea, họ Rubiaceae, bộ Rubiales (Berthaud và Charrier, 1988), chi Coffea được chia thành 4 nhóm chính là: Paracoffea, Mascarreocoffea, Agrocoffea Pierre và Eucoffea, trong đó chỉ có nhóm Eucoffea mới có thành phần caffeine và có ý nghĩa kinh tế, phần lớn

Trang 18

các loài cà phê được trồng trọt là thuộc nhóm này Cà phê vối được trồng nhiều ở các nước Châu Phi, Indonesia, Ấn Độ, Việt Nam, chiếm tỷ lệ trên 90% tổng diện tích trồng cà phê vối của thế giới Giống này chủ yếu có nguồn gốc từ Trung phi, phân bố rải rác dưới các tán rừng thưa, thấp thuộc châu thổ sông Congo (Herrera và Lambot, 2017) Hầu hết các giống cà phê vối được trồng ở Việt Nam hiện nay đều được mang về từ Java (ICO, 2019) Cà phê Việt Nam được trồng chủ yếu ở các khu vực như: Tây Nguyên, Tây Bắc và vùng Trung Bộ

1.3 Sơ lược về vi nấm gây hại cà phê Fusarium sp., Pythium sp

Nấm là một giới trong số năm giới theo hệ thống phân loại của (Whittaker, 1969) Nấm là những sinh vật có nhân và thành tế bào thực sự, dị dưỡng (heterotrophic), sinh sản bằng bào tử Nấm phân bố rộng rãi trong tự nhiên, trong không khí, đất, nước, trên động, thực vật sống hoặc chết Ước tính có khoảng trên 1.000.000 loài nấm, hầu hết sống hoại sinh trong đất, một số ít có khả năng kí sinh gây bệnh cho người và động vật Một số bệnh nấm tiêu biểu gây hại cho cây trồng được quan tâm nhiều nhất là bệnh thối thân, rễ ở thực vật do nhiều loài nấm ký sinh

gây ra như Phytophthora sp., Pythium sp., Botrytis cinerespers, Diplodia sp.,

Fusarium sp., Rhizoctonia solani Kuln, Sclerotium batiticola Faud 1.3.1 Nấm Fusarium sp

Phân loại

Giới (Regnum): Fungi

Ngành (Phylum): Ascomycota Lớp (Class): AscomycetesBộ (Ordo): Hypocreales

Chi (Genus): Fusarium

Nấm Fusarium sp được đặc trưng bởi các khuẩn lạc phát triển nhanh, có

màu nhạt hoặc sáng màu, hình thành bào tử cong hình thuyền, đỉnh nhọn có vách ngăn (Zemankoa và Lebeda, 2001) Gây bệnh thối nứt thân, thối cổ rễ phát tán dễ dàng trong không khí và được lan truyền nhanh nhờ gió, nước, côn trùng, động vật

Trang 19

Cây cà phê bị bệnh thối nứt thân thường phát triển kém, lá héo rũ nhanh rồi chết khô Vết bệnh trên thân thường bị thối nhũn, rất dễ bóc rời khỏi phần thân gỗ, mạch gỗ bị khô làm tắc đường vận chuyển nước và dinh dưỡng trong cây Vết bệnh có thể phát hiện ở bất cứ vị trí nào trên thân cây Bệnh thối nứt thân thường xuất hiện gây hại nặng trên các vườn cà phê kinh doanh không thông thoáng, ẩm thấp, độ ẩm không khí cao trong các tháng mùa mưa Nấm bệnh phát triển và gây hại nặng trong tháng 5 - 9 hàng năm Nấm bệnh xâm nhập gây hại và lan truyền từ cây này sang cây khác rất nhanh (IPM, 2016)

Họ (Familia): Pythiaceae

Chi (Genus): Pythium

Nấm Pythium sp gây bệnh trên cây trưởng thành với các triệu chứng như thối rễ, thối ngọn, và bạc lá, nhiều loài Pythium sp gây thối hạt và chết cây con (Kageyama, 2014) Nấm Pythium sp có màu trắng mịn, bông xốp với sợi nấm uốn

cong hơn hoặc uốn khúc trên đĩa thạch (Ho, 2018) và Nấm bệnh phát triển và gây hại nặng trong mùa mưa khiến cây sinh trưởng chậm, lá vàng nên rất dễ bị nhầm lẫn bởi vàng lá do thiếu dinh dưỡng, kém chăm sóc (IPM, 2016)

1.4 Sơ lược về tuyến trùng gây hại cà phê Meloidogyne sp.,

Pratylenchus sp

Tuyến trùng (nematodes) là một nhóm động vật không xương sống, đa bào có kích thước rất bé dài khoảng 0,1 - 0,5 mm (mắt thường không thể nhìn thấy) Vòng đời của tuyến trùng ký sinh gây hại khoảng 25 - 70 ngày và phát triển qua 3 giai đoạn chính, bao gồm giai đoạn trứng, giai đoạn ấu trùng và giai đoạn trưởng

Trang 20

thành Hệ số sinh sản của tuyến trùng rất cao, một cá thể tuyến trùng cái trưởng thành có thể đẻ trên 2.000 trứng (Castillo và Wintgens, 2004) Đây là tác nhân gây hại quan trọng đối với cây cà phê, đặc biệt khi có sự kết hợp của nấm hay vi khuẩn Trong đó, nhóm tuyến trùng ký sinh thực vật là đối tượng gây hại trên nhiều cây trồng nông nghiệp và công nghiệp, là một trong những tác nhân gây hại chính trên cây cà phê Sau khi kí sinh được vào rễ cà phê, tuyến trùng bắt đầu sinh trưởng và phát triển nhanh về số lượng, hủy hoại gây vết thương cho hệ rễ, ngăn cản khả năng hấp thụ chất dinh dưỡng và mở đường cho các loại vi sinh vật khác tấn công gây hại rễ Triệu chứng biểu hiện trên mặt đất như: cây sinh trưởng kém, có biểu hiện thiếu dinh dưỡng, cây héo khi thời tiết nóng hay khô, năng suất cây giảm Triệu chứng

dưới đất hệ thống rễ kém phát triển, có nhiều nốt sần (Meloidogyne spp.), vết thương ở rễ (Pratylechus spp., Radopholus spp.), đầu rễ sưng (Rotylenchuslus

reniformis) Điển hình là xuất hiện tình trạng rễ nhánh mọc nhiều ở vùng kế cận

vùng bị tuyến trùng gây hại Ngoài ra, tuyến trùng gây hại còn kèm theo tác nhân như bệnh nấm khuẩn gây ra hiện tượng thối rễ (Mehrotra, 1980 & Trần Kim Loang, 2002) Có rất nhiều loài tuyến trùng tấn công và gây hại rễ cà phê làm ảnh hưởng

nặng nề tới năng suất và chất lượng cà phê điển hình như các loại tuyến trùng

Meloidogyne exigua, M Africana, M coffeicola, M incognita, Pratylenchus coffeae, P brachyurus, P loosi, P pratensis và Radopholus simili (Whitehead,

1968)

Trang 21

SVTH: VŨ THỊ THÚY HẰNG 9 Hình 1 2 Chu kì gây bệnh của tuyến trùng hại rễ (Grains research &

Development Corporation, 2019)

1.4.1 Tuyến trùng Meloidogyne sp

Meloidogyne sp là nhóm tuyến trùng ký sinh thực vật ít di chuyển Tuyến

trùng cái trưởng thành thuộc nhóm này thường ký sinh cố định trong rễ cà phê và tạo nên các u nang rất lớn trên bề mặt rễ (hay còn gọi là nốt sần) Các vết thương trên bề mặt rễ cà phê bị gây hại bởi tuyến trùng này là một điều kiện rất thuận lợi cho các loại nấm ký sinh gây tổn thương rễ cà phê Hầu hết các vùng trồng cà phê trên thế giới đều được ghi nhận có sự xuất hiện và gây hại của các loài tuyến trùng khác nhau thuộc nhóm tuyến trùng này Tại Việt Nam, tuyến trùng gây u sưng rễ

Meloidogyne sp là một trong 2 loại tuyến trùng ký sinh gây hại chủ yếu trong rễ cà

phê (Trần Kim Loang, 2002)

1.4.2 Tuyến trùng Pratylenchus sp

Trang 22

Pratylenchus sp là nhóm tuyến trùng nội ký sinh di chuyển Có phổ kí chủ

rộng , phân bố rộng khắp vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới và ôn đới Chúng tấn công và gây vết thương trên bề mặt rễ cà phê, tạo điều kiện thuận lợi cho các loại vi khuẩn và vi nấm ký sinh gây hại rễ Điều này làm cho cây cà phê nhanh chóng mất sức, lá cây chuyển vàng và sau cùng bị chết hoàn toàn Theo tác giả Castillo và Wintgens năm 2004, một số loài tuyến trùng thuộc nhóm này đã được phát hiện và ghi nhận:

P coffeae được tìm thấy tại Brazil, Costa Rica, Dominican Republic, El Salvador,

Guatemala, Venezuela, Madagascar, Ấn Độ và một số nước Châu Phi khác Loài P

brachyurus được tìm thấy tại Brazil và một số nước Châu Phi, P vulvu được tìm

thấy tại Ấn Độ; gần đây có một loài mới là P brzeskii có hình thái tương tự P

coffeae và P loosi gây hại cho cà phê ở những vùng ôn đới Bắc Âu (Castillo và

Vovlas, 2007) Thêm vào đó, tuyến trùng Pratylenchus sp cũng đã được ghi nhận

tại một số quốc gia trồng cà phê khác trên thế giới như: Colombia, Cuba, Honduras, Mexico, Nicaragua và Việt Nam

1.5 Vi sinh vật phân cố định đạm

Vi sinh vật cố định đạm hay còn gọi là cố định nitơ (Nitrogen fixing Microorganisms) là những vi sinh vật quan trọng nhất trong việc cố định N2 trong đất và trong cây trồng Nitơ là yếu tố quan trọng đối với cây trồng nguồn dự trữ nitơ trong tự nhiên rất lớn, chỉ riêng trong không khí có đến 78.16% N2 Để giúp cho cây hấp thụ đươc, các vi sinh vật cố định nitơ từ không khí (N2) thành các hợp chất (NH3, NH4+) cung cấp cho cây Hàng năm số lượng nitơ cây trồng thu được bằng con đường này nhiều gấp 3 lần so với việc sử dụng phân bón hóa học (Nguyễn Lân Dũng, 2002)

1.6 Vi sinh vật phân giải lân

Vi sinh vật phân giải lân hay còn gọi là vi sinh vật chuyển hóa lân (Phosphate Solubilizing Microorganisms – PSM) là các vi sinh vật có khả năng chuyển hóa hợp chất photpho khó tan thành dạng dễ tan để cây trồng sử dụng Các vi sinh vật phân giải hợp chất photpho khó tan được biết đến nhiều hiện nay như:

Trang 23

Pseudomonas, Bacillus, Penicillium, Aspergillus Các vi sinh vật này không chỉ

phân giải photphat canxi mà có cả photphat nhôm, sắt, mangan và các dạng khác kể cả quặng, photphat vô cơ (Ingle và cộng sự, 2017) Photpho có tác dụng thúc đẩy phát triển và tăng khả năng chống chịu của cây trồng Thiếu photpho, sự hình thành tế bào mới bị chậm lại, cây còi cọc ít phân cành, đẻ nhánh, lá có màu xanh lục bẩn, không sáng, năng suất của cây trồng bị giảm sút nghiêm trọng, ngay cả khi được cung cấp đủ nitơ (Havlin và cộng sự, 1999) Cây trồng chỉ có thể hấp thu 5 - 25% lượng lân được bón, số còn lại bị đất giữ lại dưới dạng hấp phụ hoặc cố định, trong đó hấp phụ thông qua trao đổi ion sẽ trở thành dạng tan, còn cố định thì không thể chuyển đổi thông qua ion trao đổi (Murphy và cộng sự, 2003)

1.7 Vi sinh vật phân giải cellulose

Vi sinh vật phân giải cellulose (Cellulose microorganisms) có khả năng tiết ra enzyme cellulase để phân giải cellulose Chúng được tìm thấy ở bộ tiêu hóa của động vật ăn cỏ như trâu , bò, dê (Oyeleke và cộng sự, 2008) và côn trùng như mối và bọ cánh cứng hay ở những đống ủ phân hữu cơ, bùn nước thải (Bayer và cộng sự, 2004) Ngoài ra các nhà khoa học cũng đã phân lập ra những chủng vi khuẩn ở

sâu trong lòng đất có khả năng phân giải cellulose như Brevibacllus, Paenibacillus,

Bacillus, và Geobacillus (Rastogi và cộng sự, 2009) Không chỉ đóng góp vai trò

trong chu trình carbon tự nhiên vi sinh vật phân giải cellulose còn có tiềm năng lớn trong việc phân hủy cellulose trong nước ô nhiễm (Hubbe và cộng sự, 2011), chuyển hóa cellulose thành nhiên liệu sinh học thay thế cho nhiên liệu hóa thạch (Falter và cộng sự, 2015)

Trang 24

SVTH: VŨ THỊ THÚY HẰNG 12 2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU

2.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới về khả năng kiểm soát nấm và tuyến trùng gây bệnh

Năm 2001, Girma và cộng sự đã cho biết tỉ lệ cà phê bị héo rũ do Fusarium

xylarioides trên các cánh đồng dao động với tỉ lệ 45% đến 69% ở Bebeka và 60% Fusarium xylarioides được phân lập ra từ mẫu vật, tất cả các mẫu đều tạo ra nấm

trừ hạt

Năm 2007, Serani và cộng sự đã phân lập được các chủng Fusarium sp gây

bệnh trên cây cà phê vối

Năm 2013, Ji và cộng sự đã phân lập được 62 chủng từ các bãi bùn

Gomsohang, Mohang, Jeju ở Hàn Quốc, trong đó có chủng Bacillus

amyloquiquefaciens chống lại 12 loại nấm phytopathogenic, hợp chất bán tinh kết

ức chế đáng kể sự phát triển của sợi nấm gây bệnh Alternaria panax, Botrytis

cinera, Colletotrichum orbiculare, Penicillium digitatum, Pyricularia grisea và Sclerotinia sclerotiorum

Năm 2021, Gamboa-Becerra và cộng sự đã báo cáo các phức hợp bệnh liên

quan đến sự tương tác giữa tuyến trùng thắt nút rễ Meloidogyne sp và nấm

Fusarium sp gây bệnh thối rễ

2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước về khả năng kiểm soát nấm và tuyến trùng gây bệnh

Năm 2014, Nguyễn Văn Minh và cộng sự đã nghiên cứu và chứng minh

được sự kết hợp giữa nấm Trichoderma viride và Bacillus subtilis F9 có khả năng đối kháng sinh học cao đối với cả hai chủng nấm Pythium sp và Fusarium sp cho

hiệu quả tốt hơn riêng rẽ

Năm 2015, Ngyễn Thị Tiến Sỹ và cộng sự đã làm thí nghiệm trong nhà lưới

và kết luận Pratylenchus coffeae không có khả năng gây ảnh hưởng đến sự sinh

trưởng của cây sầu riêng, bơ, hồ tiêu, ca cao, muồng đen, điều Từ đó có thể trồng

Trang 25

các loại cây này vào vườn cà phê bị nhiễm tuyến trùng Pratylenchus coffeae để

chắn gió, che nắng

Năm 2018, Nguyễn Thị Ánh Nguyệt và cộng sự đã đánh giá khả năng dối

kháng của các chủng Trichoderma sp và Bacillus sp Đối kháng với chủng Pythium

vexans gây bệnh chết nhanh trên cây hồ tiêu

Năm 2020, Nguyễn Thị Duyên và cộng sự đã kết luận rằng trong điều kiện

phòng thí nghiệm dịch bào tử nấm Paecilomyces sp có hiệu lực cao đối với quá trình ức chế nở tuyến trứng và giết chết ấu trùng Meloidogyne incognita và tuyến trùng Pratylenchus penetrans

Năm 2020, Nguyễn Bá Thọ và cộng sự đã phân lập được một số chủng

Bacillus sp có khả năng đối kháng với nấm Colletotrichum sp trong đó chủng Bacillus subtilis có khả năng đối kháng cao nhất

2.3 Sơ lược về bộ chế phẩm vi sinh

2.3.1 Khái niệm

Chế phẩm vi sinh còn được gọi là chế phẩm sinh học, theo ý kiến của các nhà khoa học chế phẩm sinh học là sản phẩm của quá trình tái tạo và sử dụng tài nguyên sinh học Người ta chia chế phẩm ra làm 2 loại: Chế phẩm sinh học truyền thống và chế phẩm sinh học mới Các chế phẩm sinh học truyền thống ví dụ bao gồm vật liệu xây dựng từ gỗ, giấy và bột giấy, rừng và các sản phẩm từ rừng Các chế phẩm sinh học mới có thể bao gồm các chế phẩm có nguồn gốc sinh học như: nhiên liệu sinh học, năng lượng sinh học, tinh bột và cellulose ethanol, chất kết dính sinh học, hóa sinh, nhựa sinh học (Trung tâm Thông tin Khoa học và Công nghệ TP.HCM và Dương Hoa Xô, 2012) Chế phẩm sinh học còn đem lại những lợi ích như sau:

- Không gây ảnh hưởng tiêu cực đến sức khỏe con người, vật nuôi, cây

trồng và không gây ô nhiễm môi trường sinh thái

- Có tác dụng cân bằng hệ sinh thái (vi sinh vật, dinh dưỡng …) trong

môi trường đất nói riêng và môi trường nói chung

Trang 26

- Ứng dụng các chế phẩm sinh học không làm hại kết cấu đất, không

làm chai đất, thoái hóa đất mà còn góp phần tăng độ phì nhiêu của đất

- Có tác dụng đồng hóa các chất dinh dưỡng, góp phần tăng năng suất

và chất lượng sản phẩm

- Có tác dụng tiêu diệt côn trùng gây hại, giảm thiểu bệnh hại, tăng khả

năng đề kháng bệnh của cây trồng mà không làm ảnh hưởng đến môi trường như các loại thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc hóa học khác

- Có khả năng phân hủy, chuyển hóa các chất hữu cơ bền vững, các phế

thải sinh học, phế thải nông nghiệp, công nghiệp, góp phần làm sạch môi trường

2.3.2 Sơ lược về cơ chế kháng nấm và tuyến trùng của một số vi sinh vật có trong bộ chế phẩm vi sinh

❖ Nấm trichoderma

Các nhà khoa học đã chỉ ra rằng các bệnh hại cây trồng phổ biến như bệnh

thối rễ, héo rũ, thối trái và các bệnh thực vật khác do Pythium arrhenomanes,

Fusarium oxysporum, Alternaria tenuis và Botrytis cinerea gây ra có thể được kiểm

soát bằng nấm Trichoderma sp. (Zin và Badaluddin, 2020) Nấm trichoderma sp đã được chứng minh là có khả năng đối kháng với nấm bệnh Pythium sp nhờ tiết ra

các enzyme ngoại bào như glucanase, chitinase làm phân hủy sợi nấm gây bệnh do đó hạn chế sự phát triển và xâm lấn sâu hơn vào mô vật chủ (Saxena và cộng sự,

2016) Nấm Trichoderma sp tấn công tuyến trùng đốt rễ và nang bằng cách tiêu

diệt trứng tuyến trùng và con non giai đoạn hai, cũng như một số đoạn tuyến trùng trưởng thành Bên cạnh đó, nấm Trichoderma sp còn giúp hấp thụ chất dinh dưỡng

của cây trồng tốt hơn và có khả năng khử độc thuốc trừ sâu và thuốc diệt cỏ (Vázquez và cộng sự, 2015) Ngoài ra, sợi nấm có khả năng tiết ra một lượng lớn enzyme cellulase tham gia vào quá trình phân giải cellulose bao gồm: cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91), endo-1,4-b-D-glucanase (EC 3.2.1.4) và 1,4-bD-glucosidase (EC 3.2.1.21) (Domingues và cộng sự, 2000)

❖ Vi khuẩn Bacillus

Trang 27

Bacillus sp có thể sản sinh ra các chất kháng sinh và các enzym thủy phân như

bacteriocins, chitinase, chitosanase, glucanase, cellulase, lipase và protease chúng thủy phân hiệu quả các thành phần chính của thành tế bào vi nấm và vi khuẩn

Chống lại các bệnh do nấm Fusarium sp., Pythium sp gây ra Mặt khác, Bacillus sp

còn tham gia vào quá trình chuyển hóa các chất hữu cơ khó phân hủy thành những chất hữu cơ đơn giản cho cây trồng dễ sử dụng, giúp cải tạo đất, trực tiếp thúc đẩy sự phát triển và năng suất của thực vật (Miljaković và cộng sự, 2020) Bên cạnh đó,

Bacillus thuringiensis, và Bacillus velezensis có khả năng ức chế tuyến trùng đốt rễ Meloidogyne incognita, và thúc đẩy sự phát triển của cà chua (Choi và cộng sự,

2020) Đặc biệt, Bacillus thuringiensis, Bacillus amyloliquefaciens có thể kiểm soát

ve sầu, sâu hại mía, mối và cả bọ cánh cứng (Milner, 2000).

❖ Nấm Paecilomyces

Nấm Paecilomyces sp tạo ra nhiều loại chất chuyển hóa thứ cấp có cấu trúc hóa học khác nhau và các hoạt tính sinh học đa dạng chẳng hạn như chất diệt cỏ, diệt côn trùng, diệt nấm và diệt khuẩn (Moreno-Gavíra và cộng sự, 2020) Ngoài ra,

nấm Paecilomyces lilacinus còn có khả năng kiểm soát tốt lượng tuyến trùng

Meloidogyne incognita bằng cách kí sinh trực tiếp lên trứng, ấu trùng và con trưởng

thành đồng thời sản sinh ra acid acetic, chitinase, protease làm phân hủy lớp kitin trong vỏ của trứng và con trưởng thành (Kiewnick và Sikora, 2006) Ngoài việc

kiểm soát tốt tuyến trùng Paecilomyces lilacinum còn có hoạt lực cao cho việc tiêu

diệt sâu khoang sau 10 ngày lây nhiễm (Nguyễn Quốc Linh và Nguyễn Như Nhứt, 2017)

Trang 28

Trang 29

SVTH: VŨ THỊ THÚY HẰNG 17 1 VẬT LIỆU

1.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ tháng 12 năm 2021 đến tháng 06 năm 2021 tại phòng thí nghiệm Công nghệ vi sinh – cơ sở III, Trường Đại học Mở Tp Hồ chí

Minh

1.2 Đối tượng nghiên cứu

Thu nhận mẫu đất trồng cà phê 3 năm tuổi ở Đắk Nông để đánh giá hàm

lượng nấm Fusarium sp., Pythium sp., tuyến trùng Meloidogyne sp., Pratylenchus

sp., đồng thời đánh giá khả năng vi sinh vật phân giải lân, phân giải cellulose và khả năng cố định đạm trên vườn cà phê trước và sau khi sử dụng bộ chế phẩm vi sinh trong vòng 6 tháng

Hình 2 1 Địa điểm đất trồng cà phê

Bảng 2 1 Danh sách các mẫu nghiên cứu

Mẫu Số lượng Địa điểm Đất trồng cà phê 12 Xã Quảng Tân, huyện

Tuy Đức, tỉnh Đắk Nông

Trang 30

SVTH: VŨ THỊ THÚY HẰNG 18 1.3 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất và môi trường

❖ Thiết bị: Tủ cấy vô trùng, nồi hấp, kính hiển vi, kính soi nổi, cân phân tích, máy lắc, tủ sấy, máy ly tâm, máy vortex, tủ lạnh, tủ ấm, microwave, bếp điện

❖ Dụng cụ: Ống nghiệm, đĩa Petri, lam, lamen, becher, phễu, micropipette, đũa thủy tinh, que cấy trang, đèn cồn, rây lọc, ống facol ❖ Hóa chất: Nước cất, cồn 96˚, cồn 70˚, thuốc nhuộm lactophenol,

lugol, kháng sinh chloramphenicol

❖ Môi trường: PDA, PPA, Jensen, CMC, Pikovskaya, saccharose 20%,

nước muối sinh lí 0, 85 %

2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Thông tin bộ sản phẩm vi sinh và cách sử dụng

Bộ sản phẩm được sử dụng thử nghiệm trên vườn cà phê được tài trợ từ công

ty TNHH MIDOLI bao gồm: Chế phẩm vi sinh TRI-BIOMI 3X, BIOMI-Anti N1,

BIOMI-AntiFB 1, BIOMI-Pest 1, BIOMI-Pest 2, BIOMI-Ferti Thành phần vi sinh và công dụng của mỗi sản phẩm được mô tả chi tiết ở bảng 2.2

Bảng 2 2 Thành phần và công dụng của chế phẩm vi sinh

Chế phẩm vi sinh Chi tiết sản phẩm và chỉ tiêu chất lượng TRI-BIOMI 3X

(viên nén): Chế phẩm vi sinh( bón rễ và ủ phân)

Thành phần:

-Tổng VSV phân giải cellulose (Trichoderma viride,

Aspergillus oryzae, Bacillus velezensis, Streptomyces rochei., Phanerochaete chrysosporium): ≥ 1x108 CFU/g Bổ sung thêm:

+ Tổng VSV cố định đạm vùng rễ và nội sinh (Azotobacter sp Azospirillum sp., Bacillus velezensis): ≥ 1x106 CFU/g

+ Tổng VSV phân giải lân (Bacillus sp., Azospirillum sp.):

CFU/g

Trang 31

Công dụng:

- Kích thích tăng trưởng, tăng năng suất

- Các chủng vi sinh trong sản phẩm có khả năng chịu mặn, thích hợp cho các ruộng lúa, các nhà vườn trồng cây ăn quả nằm trong khu vực bị nhiễm mặn ở vùng Đồng bằng sông Cửu Long

- Dùng ủ lên men cho tất cả các nguyên liệu hữu cơ: bã bùn mía, rơm, bã trồng nấm, phân chuồng, vỏ cà phê, xác bã thực vật, phế phẩm hữu cơ của các nhà máy…

- Cải tạo đất bạc màu

Sử dụng: Pha 1 viên trong 40 – 50 lít nước Ủ phân 1 viên

(3g) dùng ủ 1 tấn nguyên liệu

BIOMI-AntiFB 1

(viên nén): Chế phẩm vi sinh ( phòng trừ nấm và khuẩn)

Thành phần:

- Bacillus polyfermenticus (kháng nấm) ≥ 1x107 CFU/g

- Trichoderma viride ≥ 1x106 CFU/g

- Bacillus amyloliquefaciens ≥ 1x107 CFU/g

Công dụng:

- Phòng và trừ nấm gây bệnh - cung cấp hệ vi sinh vật đối kháng mạnh với nấm, khuẩn bệnh hại cây trồng

- Vi khuẩn Bacillus sinh chất kháng nấm, kháng khuẩn

- Chế phẩm ức chế nhiều loại nấm (Phytophthora, Pythium,

Colletotrichum,…) gây bệnh vàng lá, thối cổ rễ, khô cành trên

mắc ca, chết chậm trên cây tiêu, khô vằn trên cây lúa, đốm trắng trên cây thanh long, cháy lá, xoắn cổ lá, thối đỏ trên cây mía, thối rễ, thối thân, thối trái, … trên nhiều loại cây trồng

- Có khả năng cải tạo đất, giúp bộ rễ phát triển mạnh, hỗ trợ

cây phục hồi và phát triển

Sử dụng: Pha 1 viên trong 40 – 50 lít nước Nên phun vào lúc

Trang 32

sáng sớm hay chiều mát

BIOMI-Anti N1

(viên nén): Chế phẩm vi sinh (phòng trừ tuyến trùng hại rễ)

Thành phần:

- Paecilomyces sp ≥ 1×106CFU/g

- Bacillus subtilis ≥ 1×107CFU/g

- Trichoderma viride ≥ 1×106CFU/g

- Phụ gia: Dịch chiết cây neem (Azadirachta indica)

Công dụng:

- Phòng trừ đặc trị tuyến trùng tối ưu hơn với sự kết hợp giữa vi sinh vật và dịch chiết thực vật

- Phòng trừ côn trùng gây hại, ức chế nấm bệnh

- Có tác dụng như phân bón vi sinh vật (hoạt tính cố định đạm, sinh hoocmon tăng trưởng IAA, phân giải lân) qua đó hỗ trợ cây phục hồi và phát triển

Sử dụng: Pha 1 viên trong 40- 50 lít nước Nên phun vào lúc

BIOMI-Pest 1

(viên nén): Chế phẩm vi sinh (trừ sâu)

BIOMI- Pest 2

(dạng lỏng): Chế phẩm vi sinh (trừ sâu)

Thành phần:

- Bacillus thuringiensis (4 chủng): ≥1×107 CFU/g

- Beauveria bassiana: ≥1×106 CFU/g

- Metarhizium sp.: ≥1×106CFU/g - Phụ gia: dịch ủ hạt neem

Công dụng:

- Bào tử của vi khuẩn Bacillus thuringiensis và tinh thể độc sẽ

đi qua đường tiêu hóa, sau đó độc tố được kích hoạt, bào tử nẩy nầm và tiếp tục sinh độc tố để diệt sâu Sự kết hợp với dịch chiết hạt neem sẽ tối ưu hóa hoạt tính diệt sâu Có khả năng diệt các loại sâu phổ biến trong nông nghiệp như: sâu xanh, bướm trắng, sâu đo, sâu cuốn lá, sâu đục thân/rau màu,…

Sử dụng: Pha 1 viên trong 40 – 50 lít nước Nên phun vào lúc

Trang 33

BIOMI- Ferti

(dạng lỏng): Phân bón hữu cơ vi sinh kích thích tăng trưởng cây trồng

Thành phần:

- Hàm lượng hữu cơ thủy phân từ đậu nành, trùn quế, sinh

khối, nấm men

- Tổng VSV cố định đạm ≥ 106 CFU/ml - Tổng VSV phân giải lân ≥ 106 CFU/ml - Tổng VSV phân giải cellulose ≥ 106 CFU/ml

- Tổng VSV phân giải kali ≥ 106 CFU/ml

Công dụng:

- Kích thích bộ rễ phát triển, tăng cường hấp thu phân bón - Cung cấp hệ vi sinh vật vùng rễ và vi sinh vật nội sinh thực vật (cố định đạm, sinh auxin, phân giải lân) giúp cây tăng trưởng tốt Cung cấp hệ vi sinh giúp phân giải cellulose, xác bã thực vật giúp tăng cường chuyển hóa và hấp thu dinh dưỡng hữu cơ tại chỗ

- Cung cấp dinh dưỡng dễ tiêu, bổ sung dịch lên men vi sinh vật giúp phát triển rễ, cây hấp thu nhanh và hiệu quả, tăng trưởng tốt

- Cung cấp các chất dinh dưỡng cho cây, tạo điều kiện cho cây sinh trưởng phát triển tốt theo giai đoạn

- Dùng bón bổ sung cho cây trồng và phục hồi sinh trưởng sau mùa thu hoạch, cải tạo đất bạc màu, hạ phèn

Sử dụng: 1L pha trong 100- 200 L nước

Trang 34

SVTH: VŨ THỊ THÚY HẰNG 22 2.2 Bố trí thí nghiệm

⮚ Phương pháp: Bố trí thí nghiệm gồm 2 nghiệm thức so sánh giữa nghiệm thức đối chứng và nghiệm thức sử dụng bộ chế phẩm vi sinh ⮚ Quy trình: Các kĩ thuật chăm sóc cây cà phê được dựa theo bộ tài

liệu hướng dẫn sản xuất cà phê bền vững

Bảng 2 3 Quy trình chăm sóc cây cà phê

Nghiệm thức sử dụng bộ chế phẩm vi sinh

Nghiệm thức đối chứng

- Phân bón:

● Sử dụng chế phẩm BIOMI 3X (viên) để ủ phân, bón 5kg/cây/vụ Cách ủ 2 viên/ 1 tấn nguyên liệu (vỏ cà phê), ủ trong 3 tháng ● Bón phân hữu cơ

TRI-3kg/cây/lần Cách 3 tháng bón 1 lần

● Bón phân đạm cá: 1L/ 250L nước, cách 30 ngày phun 1 lần

● Bón phân lân nung chảy: Lần 1 (tháng 1, 2): 1kg/ gốc Lần 2 (tháng 3, 4): 0,5- 0,7 kg/ gốc

Lần 3 (tháng 6): 0,6 - 0,8 kg/ gốc

Lần 4 (tháng 8, 9): 0,7 - 0,9 kg/ gốc

- Phân bón:

• Sử dụng phân bón hỗn hợp NPK

• Lần 1: giữa mùa khô (tháng 1, 2): NPK 18-5-5+9S, bón 0,4-0,5 kg/lần

• Lần 2: đầu mùa mưa (tháng 5, 6): NPK 17-7-9+9S, bón 0,4- 0,5 kg/lần, kết hợp bón phân hữu cơ vi sinh 1kg/gốc

• Lần 3: giữa mùa mưa (tháng 7-8): NPK 14-6-16+9S, bón 0,4- 0,5 kg/lần

• Lần 4: cuối mùa mưa (tháng 9- 10): NPK 16-12-18+9S,

bón 0,4- 0,5 kg/ lần

• Chăm sóc:

• Tỉa cành 2 lần/ năm Lần đầu ngay sau khi thu hoạch, lần 2 vào giữa mùa mưa

Trang 35

● Bón phân kali hữu cơ: Lần 1 (tháng 1, 2): 0,5 kg/ gốc

Lần 2 (tháng 3, 4): 0,5 kg/ gốc

Lần 3 (tháng 6): 0,5 kg/ gốc Lần 4 (tháng 8, 9): 0,5 kg/ gốc

● Sử dụng bộ chế phẩm gồm TRI-BIOMI 3X (viên), BIOMI-AntiFB 1 (viên), BIOMI-Pest 1 (viên), BIOMI-Pest 2 (lít), BIOMI Ferti (lít) phun tưới bề mặt đất và phun ướt đẫm cây định kỳ 30 ngày/lần trong 6 tháng Cách pha 2 viên, lít/ 1 loại chế phẩm/ 200L, đối với BIOMI Ferti 2L/100L Liều 400-500L/ 1 lần/ 1 ha - Chăm sóc:

● Tỉa cành 2 lần/ năm Lần đầu ngay sau khi thu hoạch, lần 2 vào giữa mùa mưa (tháng 6- 7)

● Tưới nước: Áp dụng tưới mưa phun vào khoảng tháng 2 hàng năm tùy theo điều kiện thời tiết, lượng nước

(tháng 6- 7)

• Tưới nước: Áp dụng tưới mưa phun vào khoảng tháng 2 hàng năm tùy theo diều kiện thời tiết, lượng nước 400- 500 m3/ha/lần, chu kì tưới 25-30 ngày

• Quản lí cỏ dại trong vườn làm sạch cỏ, sâu bệnh hại và nhu cầu các chất dinh dưỡng cần thiết cho cây để có thể sử dụng các loại phân bón,

thuốc trừ sâu hóa học hợp lí

Trang 36

400- 500 m3/ha/lần, chu kỳ tưới 25-30 ngày

• Quản lý cỏ dại trong vườn

làm sạch cỏ

*Ghi chú: Quy trình công nghệ này có thể điều chỉnh phù hợp theo tình hình

trồng và chăm sóc thực tế

⮚ Chỉ tiêu theo dõi:

• Kiểm tra mật độ nấm và tuyến trùng định kì 30 ngày/lần

• Kiểm tra tổng vi sinh vật cố định đạm định kì 30 ngày/lần

• Kiểm tra tổng vi sinh vật phân giải lân và cellulose định kì 30 ngày/lần

• Theo dõi khả năng sinh trưởng: Chiều cao thân trước và sau khi sử dụng bộ chế phẩm

2.3 Quy trình thu nhận và xử lý mẫu

2.3.1 Thu nhận mẫu

Mẫu đất được thu nhận tại vườn cà phê ở Đắk Nông, tiến hành lấy mẫu dưới tán cây cà phê, cách mặt đất từ 0- 20cm, được bảo quản ở nhiệt độ từ 8ᵒC - 10ᵒC tối đa 3 ngày (Alex Oliveira Botelho và cộng sự, 2019) Lấy 1000g đất từ 5 vị trí khác nhau tương ứng với 4 mẫu xung quanh và 1 mẫu ở vị trí chính giữa, trộn đều các

mẫu lại với nhau Lấy mẫu bằng bao zipper và hũ đựng vô trùng

2.3.2 Xử lý mẫu

2.3.2.1 Phương pháp kiểm tra nồng độ nấm Fusarium sp., Pythium sp

Phương pháp: Xử lý theo phương pháp của Trần Thị Huế và cộng sự năm

2020

Quy trình: Cân 10g đất (được nghiền nhỏ và sàng qua rây có đường kính lỗ

710µm) cho vào bình chứa sẵn 90ml nước cất, đem li tâm ở tốc độ 150 vòng/ phút

Trang 37

trong 15h ở nhiệt độ phòng Sau đó pha loãng ở nồng độ 10-3, hút 1ml dung dịch

cho vào môi trường PPA (đối với nấm Fusarium sp.), PDA (đối với nấm Pythium

sp.) có bổ sung kháng sinh trang đều trên đĩa petri, sau 3-4 ngày đếm số khuẩn lạc

nấm Fusarium sp mọc trên môi trường PPA bằng cách lựa chọn các khuẩn lạc có hình thái đặc trưng cho loài Fusarium sp có màu nhạt hoặc sáng màu, dạng bào tử

lan tỏa (Zemankoa và cộng sự, 2001) sau đó sẽ tiến hành quan sát vi thể dưới kính hiển vi để kiểm tra hình thái của khuẩn ty phân nhánh, có vách ngăn, bào tử nấm có

dạng hình oval tới elip, thẳng hoặc hơi cong Đến số khuẩn lạc nấm Pythium sp

mọc trên môi trường PDA bằng cách tiến hành quan sát các khuẩn lạc có tính đặc trưng về màu sắc và hình thái tạo sợi nấm bông xốp màu trắng Sau khi quan sát đại thể sẽ tiến hành quan sát vi thể có túi bào tử nhú, sợi nấm không có vách ngăn Mật

độ nấm trong đất (CFU/g) được tính theo công thức sau:

= Trong đó:

Nf: Mật độ nấm trong 1 gam đất M: Hệ số pha loãng mẫu dùng để cấy

X: Số khuẩn lạc trung bình trong mỗi đĩa petri V: Thể tích dung dịch mẫu cấy vào mỗi đĩa petri

2.3.2.2 phương pháp kiểm tra nồng độ tuyến trùng Meloidogyne sp., Pratylenchus sp

Phương pháp: Xử lý theo phương pháp ly tâm của Nusbaum và cộng sự

(1966)

Quy trình: Nghiền nhỏ 100 g mẫu đất với 250 ml nước bằng máy xay, lọc

qua rây có đường kính 1.200 µm.Thu phần nước phía dưới, thêm đủ 1 lít nước, khuấy đều Ly tâm 100ml dung dịch mẫu 1.800 vòng/phút trong 4 phút Thu lại phần cặn phía dưới, thêm dung dịch đường saccharose 20% và lắc đều, ly tâm với vận tốc 1.800 vòng/phút trong 4 phút Thu nhận dịch nổi lọc qua màng lọc có kích thước 50 µm Thu lại các vật chất còn lại trên rây, chuyển vào ống facol 15ml

Trang 38

Kiểm tra tuyến trùng dưới kính soi nổi từ 10X đến 40X Phân loại tuyến trùng

Meloidogyne sp và Pratylenchus sp thông qua đặc điểm hình thái dựa trên các

khóa phân loại theo (Nguyễn Vũ Thanh, 2002)

2.3.2.3 Phương pháp kiểm tra nồng độ vi sinh vật cố định đạm trước và sau khi sử dụng bộ chế phẩm vi sinh

Phương pháp: Dựa theo TCVN 6166:2002 về phân bón vi sinh vật cố định

nitơ

Quy trình: Cân 10g mẫu (có thể được nghiền nhỏ trước) cho vào bình chứa

90ml dịch pha loãng đã chuẩn bị sẵn Trộn kĩ bằng thiết bị trộn cơ học từ 5-10 phút sao cho vi sinh vật trong dung dịch phân bố đồng đều Để cho các phần tử nặng lắng xuống trong thời gian không quá 15 phút gạn được đung dịch huyền phù ban đầu Pha loãng ở các nồng độ khác nhau, lấy 0.1ml dịch pha loãng rồi cấy trang trên môi trường Jensen, ủ 37ᵒC, sau 2-3 ngày đọc kết quả Đếm số khuẩn lạc mọc trên đĩa có tính đặc trưng và tính mật độ tổng vi sinh vật cố định đạm theo công thức:

N = ∑ ( 1 + 0,1 2)Trong đó:

N: là số vi sinh vật trong một đơn vị kiểm tra (được tính bằng CFU trên gam hay mililit)

C: là tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa petri được giữ lại N1: là số đĩa được giữ lại ở độ pha loãng thứ nhất

N2: là số đĩa được giữ lại ở độ pha loãng thứ hai

D: là hệ số pha loãng tương ứng với độ pha loãng thứ nhất

2.3.2.4 Phương pháp kiểm tra nồng độ vi sinh vật phân giải lân trước và sau khi sử dụng bộ chế phẩm vi sinh

Phương pháp: Dựa theo TCVN 6167:1996 về phân bón vi sinh vật phân

giải hợp chất photpho khó tan

Quy trình: Cân 10g mẫu cho vào bình chứa 90ml dịch pha loãng trộn đều

trong 2-5 phút sao cho vi sinh vật trong dung dịch được phân bố đồng đều Để lắng

Trang 39

khoảng 15 phút gạn được dung dịch huyền phù ban đầu Pha loãng ở các nồng độ khác nhau, lấy 0.1ml dịch pha loãng rồi cấy trang trên môi trường Pikovskaya, ủ 37ᵒC, rồi tiến hành đọc kết quả sau 5-7 ngày Đếm số khuẩn lạc mọc trên đĩa petri tạo vòng phân giải (vòng tròn trong suốt) bao quanh khuẩn lạc và tính mật độ tổng

vi sinh vật phân giải lân theo công thức:

N = ∑ ( 1 + 0,1 2)Trong đó:

C: là tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa petri được giữ lại N1: là số đĩa được giữ lại ở độ pha loãng thữ nhất

2.3.2.5 Phương pháp kiểm tra nồng độ vi sinh vật phân giải cellulose trước và sau khi sử dụng bộ chế phẩm vi sinh

Phương pháp: Dựa theo TCVN 6168:2002 về chế phẩm vi sinh vật phân

giải cellulose

Quy trình: Cân 10g mẫu cho vào bình chứa sẵn 90ml dịch pha loãng trộn

đều từ 2-5 phút sao cho vi sinh vật trong dung dịch phân bố đồng đều Để lắng khoảng 15 phút gạn được dung dịch huyền phù ban đầu Pha loãng ở các nồng độ khác nhau, lấy 0.1ml dịch pha loãng rồi tiến hành cấy trang trên môi trường NA bổ sung 1% CMC, ủ 37ᵒC, từ 1-2 ngày Sau khi khuẩn lạc vi sinh vật đã phát triển trên đĩa petri chứa môi trường kiểm tra, để đĩa petri vào tủ lạnh trong 12h Sau đó cho vào tủ ấm 40ᵒC trong 6h, lấy ra nhỏ thuốc thử lugol đều khắp mặt thạch để trong 15 phút gạn bỏ hết thuốc thử Đếm số khuẩn lạc trong đĩa petri tạo vòng phân giải cellulose (vòng trong suốt) bao quanh khuẩn lạc và tính mật độ tổng vi sinh vật phân giải cellulose theo công thức:

Trang 40

N = ∑ ( 1 + 0,1 2) Trong đó:

C: là tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa petri được giữ lại N1: là số đĩa được giữ lại ở độ pha loãng thứ nhất

2.3.3 Quan sát hình thái đại thể, vi thể 2.3.3.1 Quan sát đại thể

Quan sát bằng mắt thường các khuẩn lạc có tính đặc trưng (màu sắc, kích thước, hình dạng) được mọc trên từng môi trường

2.3.3.2 Quan sát vi thể

❖ Đối với vi nấm:

Nhuộm nấm bằng lactophenol, sau đó quan sát bằng kính hiển vi ở vật kính 40X về các đặc điểm sau: hình dạng sợi nấm, màu sắc, có hay không có vách ngăn, có phân nhánh hay không, đặc điểm cơ quan bào tử, hình dạng của bào tử (Nguyễn Thị Hà, 2014)